방법 논문

조영제 유발 급성 신손상 쥐 모델에서 조영제 투여 후 N-아세틸시스테인 및 몬테루카스트 치료의 신장 보호 효과

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DOI:

10.3791/73087

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2026년 9월 3일

 ,  , 
1Department of Emergency Medicine, Kırşehir Ahi Evran University Faculty of Medicine, 2Department of Histology and Embryology, Kırşehir Ahi Evran University Faculty of Medicine

이 논문에서

요약

본 프로토콜에서는 조영제 유발 급성 신손상 랫드 모델을 제시하고, 조영제 투여 후 N-acetylcysteine과 montelukast를 각각 단독 또는 병용 투여하여 그 효과를 평가합니다. 치료 요법의 결과, 신 기능 장애, 산화 스트레스, 염증 및 조직병리학적 손상이 덜 심각한 것으로 나타났으나, 병용 투여가 단독 투여보다 일관되게 우수한 성능을 보이지는 않았습니다.

초록

조영제 유발 급성 신손상(CI-AKI)은 요오드성 조영제 노출로 인해 발생하는 주요 합병증으로, 산화 스트레스와 염증 과정이 신장 손상에 기여합니다. 본 연구에서는 CI-AKI의 실험적 쥐 모델을 구축하고, 조영제 투여 후 N-acetylcysteine(NAC), montelukast 또는 두 약물을 병용한 치료의 효과를 조사하였습니다. 성체 수컷 Wistar 쥐를 대상으로 수분 제한을 실시한 후, Nω-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME), indomethacin, 그리고 iohexol을 순차적으로 정맥 투여하였습니다. 치료는 iohexol 투여 완료 1시간 후(L-NAME 투여 후 약 1.5시간 후)에 시작하여 3일 연속으로 1일 1회 실시하였습니다. 신기능 지표, 산화 스트레스 파라미터, 염증성 사이토카인, 신손상 바이오마커 및 신장 조직 병리학적 소견을 평가하였습니다. 치료를 받지 않은 CI-AKI 군에서는 뚜렷한 신기능 장애, 불리한 산화 스트레스 및 염증 프로필, 그리고 상당한 조직 병리학적 손상이 나타났습니다. 치료를 받지 않은 CI-AKI 군과 비교하여 NAC, montelukast 또는 병용 요법을 투여받은 동물들은 일반적으로 생화학적 및 조직 병리학적 소견이 개선된 것으로 나타났습니다. Glutathione(GSH) 수치는 병용 투여군에서 가장 높았고, 평균 조직 병리학적 손상 점수는 수치상으로 가장 낮았으나, 병용 치료가 평가된 모든 결과에서 단독 요법보다 일관되게 우수한 성능을 보이지는 않았습니다. 본 프로토콜은 CI-AKI의 조영 후 중재술을 평가하기 위한 통제된 전임상 프레임워크를 제공하며, 본 결과는 임상적 효능이나 병용 투여 특이적 이점을 확립하지 않은 상태에서 NAC와 montelukast에 대한 추가적인 실험적 연구의 필요성을 뒷받침합니다.

서론

급성 신손상(AKI)은 입원 환자의 경과에서 빈번하게 합병증으로 나타나며, 이환율, 사망률 및 의료 자원 사용량의 증가를 초래합니다. 요오드성 조영제가 진단 영상 및 중재 시술에 일상적으로 사용됨에 따라, 조영제 노출 후 신기능 저하가 중요한 임상적 관심사가 되었습니다. 현재의 명명법에서는 조영제 투여 후 발생하는 모든 AKI 사례를 포함하는 조영제 관련 급성 신손상(CA-AKI)과, 신손상이 조영제에 의해 인과적으로 기인한 조영제 유발 급성 신손상(CI-AKI)을 구분합니다. 따라서 조영제 노출이 신손상과 직접적으로 연결될 수 있는 통제된 실험 모델에서는 CI-AKI라는 용어가 여전히 널리 사용되고 있습니다1,2.

만성 신장 질환, 당뇨병, 고령, 심부전 또는 기타 심혈관 동반 질환이 있는 환자는 조영제 유발 급성 신손상(CI-AKI)에 특히 취약합니다. 많은 환자의 경우 신장 기능이 회복되지만, 더 심각한 사례에서는 지속적인 신장 기능 저하, 신대체 요법의 필요성 및 사망 위험 증가가 나타날 수 있습니다. 또한 CI-AKI는 입원 기간의 연장 및 의료 자원 사용량 증가와 관련이 있습니다. 이러한 부정적인 결과는 조영제 관련 신장 손상을 예방하고 치료하기 위한 효과적인 접근법 개발의 지속적인 필요성을 강조합니다1,3,4,5.

CI-AKI의 발생은 신혈류 변화, 수질 산소 불균형, 산화 스트레스, 염증 및 직접적인 세뇨관 독성을 포함하여 서로 연관된 여러 과정과 관련이 있습니다. 조영제 노출은 신장 내 혈관 긴장도를 혈관 수축 방향으로 변화시키고 혈관 확장 반응을 약화시켜 신혈류량을 감소시킵니다. 외수질은 생리적 조건에서도 이미 산소 가용성이 제한되어 있어 특히 취약합니다. 따라서 조영제 투여 후 산소 공급이 더욱 감소하면 저산소성 세뇨관 손상이 촉진될 수 있습니다2,6,7.

조영제 노출 후 발생하는 신장 저산소증은 활성 산소종(ROS)의 생성 증가를 동반하며, 이는 신장 손상에 상당한 영향을 미칩니다. ROS 생성이 내인성 항산화 능력을 초과하면 세포 지질, 단백질 및 DNA에 산화적 손상이 발생할 수 있으며, 동시에 염증 신호 전달이 강화됩니다. 실험적 및 임상적 설정 모두에서 조영제 투여는 산화 스트레스 지표의 증가 및 항산화 방어 체계의 손상과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 반응에 관여하는 분자 경로에는 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) 산화효소 의존적 라디칼 형성 및 nuclear factor kappa-B (NF-κB)의 활성화가 포함됩니다1,6,8,9.

염증의 기여도는 CI-AKI가 단순히 혈역학적 교란만으로 설명될 수 없음을 시사합니다. 최근의 증거들은 조영제 노출 후의 신장 손상에 페로토시스(ferroptosis), 질소성 스트레스 및 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps)이 관여한다는 점을 보여주었습니다. 이러한 추가적인 기전의 인식은 CI-AKI의 예방 및 치료를 위해 연구되는 분자 표적의 범위를 확장시켰습니다1.

혈청 크레아티닌과 소변량은 CI-AKI를 식별하는 데 흔히 사용되지만, 두 지표 모두 신장 손상이 이미 발생한 후에야 변화가 나타날 수 있습니다. 이러한 한계로 인해 세뇨관 손상을 반영하는 kidney injury molecule-1 (KIM-1)과 사구체 여과율의 변화와 관련된 cystatin C를 포함한 조기 지표들에 대한 평가가 촉진되었습니다. 실험 및 임상 연구 결과에 따르면, 이러한 바이오마커의 변화는 CI-AKI의 초기 단계에서 검출될 수 있으며, 따라서 신장 손상의 조기 평가를 가능하게 합니다9,10,11.

CI-AKI의 병태생리에 대한 이해가 진전됨에 따라 산화 및 염증 경로를 겨냥한 약물학적 중재법에 대한 평가가 촉진되었습니다. 적절한 수분 공급은 여전히 주요한 예방책으로 남아 있는 반면, 약물 기반 접근법의 보고된 이점은 연구마다 다양하게 나타났습니다. 결과적으로, CI-AKI의 표준 임상 중재법으로 채택될 만큼 충분하고 일관된 효능을 입증한 약물 치료는 아직 없습니다1,4,12,13.

N-아세틸시스테인(NAC)은 조영제 유발 급성 신손상(CI-AKI)을 제한하기 위한 약리학적 접근법으로 널리 평가되어 왔습니다. NAC의 제안된 신보호 효과는 반응성 종의 제거 및 글루타치온 저장량의 회복과 관련이 있습니다. 초기 임상적 근거는 만성 신장 질환 환자를 대상으로 한 획기적인 연구에서 나왔으며, 이 연구에서 NAC는 조영제 관련 신기능 장애의 발생률을 감소시켰습니다14. 그러나 이후의 임상 시험 및 증거 합성 연구에서는 일부 연구가 이점을 보고하고 다른 연구는 유의미한 임상적 효과를 보이지 않는 등 일관되지 않은 결과가 도출되었습니다. 따라서 CI-AKI에 대한 NAC의 효과는 여전히 불확실합니다12,15,16,17.

Montelukast는 시스테이닐 류코트리엔 수용체-1을 선택적으로 차단하며, 오랫동안 천식 및 알레르기성 질환 치료에 사용되어 왔습니다. 실험적 근거에 따르면 이 약제는 항염증, 항산화 및 항세포사멸 효과를 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 다양한 신장 손상 모델에서 montelukast 투여는 지질 과산화 감소, 내인성 항산화 방어 체계 강화, 조직병리학적 손상 완화 및 신장 손상 감소와 관련이 있는 것으로 나타났습니다18,19,20,21,22.

CI-AKI에서 몬테루카스트(montelukast)를 구체적으로 조사한 근거는 여전히 제한적입니다. 가용한 실험적 결과들에 따르면, 이 약물의 신장 효과는 산화 및 염증 신호 전달의 조절과 관련이 있을 수 있습니다. NADPH oxidase 4 (NOX4), p22phox 및 NF-κB의 발현 감소가 몬테루카스트가 조영제 관련 신장 손상을 완화할 수 있는 하나의 기전으로 제시되었습니다9.

NAC과 montelukast는 신장 손상에 관여하는 부분적으로 서로 다르지만 중첩되는 경로에 영향을 미칩니다. NAC는 주로 항산화 방어를 지원하는 반면, montelukast는 항염증 및 항산화 작용을 모두 가지고 있습니다. 따라서 이러한 약제들을 병용 투여하면 CI-AKI 병태생리의 여러 구성 요소에 영향을 줄 수 있으나, 이들의 상호작용이 가산적 또는 시너지 효과를 내는지 여부는 실험 모델에서 아직 확립되지 않았습니다18,19,20,21,22.

이전의 연구들은 주로 조영제 노출 전에 투여되는 중재법을 평가해 온 반면, 노출 후에 시작되는 치료에 관한 근거는 여전히 부족한 실정입니다. 특히, 실험적 CI-AKI 모델에서 NAC와 함께 몬테루카스트를 조영제 노출 후에 투여하는 것에 대한 연구는 제한적이었습니다. 따라서 본 연구에서는 조영제 노출 후 몬테루카스트와 NAC를 단독 또는 병용 투여하여, CI-AKI 쥐 모델에서 신장 기능, 산화 스트레스 파라미터 및 항산화 방어 체계, 신장 손상 및 염증성 바이오마커, 그리고 조직병리학적 변화를 평가하였습니다.

프로토콜

동물을 대상으로 하는 모든 실험 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 국제적으로 인정된 가이드라인에 따라 수행되었으며, Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) 가이드라인을 준수하였습니다. 실험 프로토콜은 터키 크르셰히르의 Ahi Evran University 동물 실험 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다 (결정 번호 2, 회의 번호 12, 날짜: 2025년 6월 12일). 연구 전 과정에서 동물의 고통을 최소화하고 사용되는 동물의 수를 줄이기 위해 모든 노력을 기울였습니다. 사용된 모든 시약과 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

시약 준비

본 연구에서는 Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), indomethacin, iohexol, montelukast sodium 및 NAC를 사용하였다. 10 mg/mL L-NAME 용액은 멸균된 0.9% 생리식염수 100 mL당 L-NAME 1 g을 사용하여 조제하였다. 해당 용액은 투여 당일에 새로 조제하였으며, 조제 당일 이후로 저장하여 사용하지 않았다. 실험적 CI-AKI 모델 유도를 위해 L-NAME을 10 mg/kg 용량으로 정맥 내(IV) 투여하였다. 약 220 g 무게의 쥐의 경우, 계산된 투여량은 약 2.2 mg이었으며, 이는 약 0.22 mL의 투여 부피에 해당한다. Indomethacin은 100 mg을 최종 부피 10 mL의 5% 탄산수소나트륨 용액에 녹여 10 mg/mL 농도로 조제하였다. 조제물은 육안으로 균일해질 때까지 볼텍싱하였다. 조제된 indomethacin 용액의 최종 pH는 실험 중에 측정되지 않았으므로 소급하여 결정할 수 없었다. 조제된 indomethacin 용액에 대한 특정 멸균 또는 여과 절차는 실험 기록에 문서화되지 않았으며, 따라서 소급하여 보고할 수 없었다. 공식적인 안정성 기간은 설정하거나 평가하지 않았으며, 용액은 당일에 새로 조제하여 사용하였다. 실험적 CI-AKI 모델을 유도하기 위해 indomethacin을 10 mg/kg 용량으로 정맥 내 투여하였다. 약 220 g 무게의 쥐의 경우, 계산된 투여량은 약 2.2 mg이었으며, 이는 약 0.22 mL의 투여 부피에 해당한다.

647 mg iohexol/mL과 300 mg/mL의 등가 요오드 농도를 포함하는 상용 iohexol 제제를 추가 희석 없이 투여하였습니다. 주사 당시 iohexol의 정확한 온도는 기록되지 않았습니다. 가용한 실험 기록으로는 제제 특유의 삼투압 값을 신뢰성 있게 확인 할 수 없었으므로 보고하지 않았습니다. 실험적 CI-AKI 모델 유도를 위해 iohexol을 3 g iodine/kg으로 정맥 투여하였습니다. 체중이 약 220 g인 쥐의 경우, 이 용량은 약 0.66 g의 요오드를 제공하며 주입 부피는 약 2.2 mL에 해당합니다.

0.5% 카복시메틸 셀룰로오스(CMC)로 몬테루카스트 나트륨 현탁액을 조제하였다. 이는 매 투여일에 새로 조제하였으며, 현탁 입자의 균일한 분포를 위해 투여 직전에 볼텍싱하였다. 각 동물에 필요한 몬테루카스트 용량은 연구 시작 시 기록된 체중을 바탕으로 다음 공식을 사용하여 별도로 계산하였다: 필요 용량(mg) = 체중(kg) × 10 mg/kg. 체중이 약 220 g인 동물의 경우, 계산된 용량은 약 2.2 mg였으며 경구 투여(oral gavage)로 전달되었다. 매 투여 전 현탁액을 육안으로 검사하였으며, 침전이 보이는 조제물은 사용 전 다시 볼텍싱하였다.

NAC를 처리군에 추가 희석 없이 시판 제형 그대로 100 mg/kg의 용량으로 복강 내 투여하였습니다. 각 동물에 대해 필요한 투여량은 연구 시작 시 기록된 체중을 바탕으로 개별적으로 계산하였습니다. 체중이 약 220 g인 동물의 경우, 이는 약 22 mg의 NAC와 약 0.15 mL의 투여량에 해당하였습니다. 투여 전 용액을 육안으로 확인하였으며, 투명하고 가시적인 입자가 없는 제제만을 사용하였습니다.

각 제제는 투여 전 육안 검사를 거쳤습니다. L-NAME, indomethacin, iohexol 및 NAC 용액의 변색 및 가시적 입자 유무를 확인하였습니다. 투여 직전, montelukast 현탁액을 볼텍스 믹싱(vortex)하고 육안으로 검사하여 균질성을 확인하였습니다. 이러한 수락 기준을 충족하지 못한 제제는 사용하지 않았습니다. 모든 화학 물질의 조제 및 투여 과정 동안 실험복, 보호 장갑 및 보안경을 착용하였습니다. 모든 절차는 기관의 실험실 안전 및 생물 안전 요구 사항을 준수하였습니다.

동물 선택, 사육, 실험군 및 무작위 배정

튀르키예 커르셰히르 Ahi Evran University의 실험동물연구소에서 성체 수컷 Wistar albino 랫트 30마리(8~12주령; 체중 200~220 g)를 분양받았습니다. 이전에 발표된 실험적 CI-AKI 모델과의 방법론적 일관성을 유지하고 발정 주기 단계를 추가적인 생물학적 변수로 도입하는 것을 방지하기 위해 수컷 랫트를 선택하였습니다. 본 연구에서 성별은 실험 변수로 평가되지 않았습니다. 해당 동물 시설은 번식/생산 라이선스 번호 184를 보유하고 있었으며, 랫트들은 표준 실험실 조건 하에 그곳에서 번식 및 유지되었습니다. 등록 당시, 동물들의 특정 병원균 부재(SPF) 상태 또는 기타 공식적으로 지정된 미생물학적 건강 분류는 기록되지 않았습니다. 각 랫트는 40 cm × 25 cm × 20 cm 크기의 폴리카보네이트 케이지에 개별 수용되었으며, 거칠게 썬 소나무 톱밥을 깔개로 사용하였습니다. 실내 조건은 자동 환경 제어 및 환기 시스템을 통해 온도 24 °C ± 2 °C, 상대 습도 35% ± 10%로 유지되었습니다. 07:00부터 19:00까지 조명을 켜는 12시간 명기/12시간 암기 일정을 적용하였습니다. 7일간의 적응 기간 및 이후의 실험 기간 동안 별도의 환경 풍부화 장치는 제공되지 않았습니다. CI-AKI 유도 전 지정된 16시간의 수분 제한 기간을 제외하고, 표준 펠릿 형태의 설치류 사료와 수돗물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였습니다. 사료 성분은 조단백질 24%, 조셀룰로스 3.94%, 조지방 5.08%, 조회분 8.8%, 라이신 1.44%, 메티오닌 0.61%, 칼슘 1.14%, 인 0.89%, 나트륨 0.28%였습니다. 모든 동물은 실험 절차를 시작하기 전 7일 동안 적응 기간을 거쳤습니다. 적응 기간과 실험 기간 모두에 매일 관찰을 수행하여 전신 상태, 사료 및 수분 섭취량, 활동성, 자세, 모질 및 스트레스 징후를 평가하였습니다. 선택 편향을 최소화하기 위해 컴퓨터로 생성된 무작위 배정 순서를 사용하여 동물들을 5개의 실험군으로 나누었으며, 각 군에 6마리씩 배정하였습니다. 표본 크기는 G*Power 버전 3.1.9.6을 이용한 사전 검정력 분석을 통해 결정되었습니다.

표본 크기는 5개의 실험군을 대상으로 한 고정 효과 일원 분산 분석(fixed-effects one-way analysis of variance)을 위해 사전 검정력 분석(a priori power analysis)을 통해 결정되었습니다. 효과 크기(f) 0.65, 제1종 오류율(α) 0.05, 통계적 검정력 80%를 가정했을 때, 필요한 총 표본 크기는 30마리로 계산되었으며, 이는 군당 6마리에 해당합니다. 효과 크기(f = 0.65)는 5개 군 비교 시 전체적인 군 간 효과가 클 것이라고 사전에 가정하여 설정되었습니다. 이 계산은 이러한 전체적인 효과를 검출하는 데 필요한 표본 크기를 결정하기 위한 것이며, 활성 치료군 간의 더 작은 개별 쌍별 차이를 구체적으로 검출하도록 설계된 것은 아닙니다. 모든 분석에서 개별 동물은 실험 단위로 간주되었습니다.

일상적인 사육, 매일의 건강 모니터링 및 최종 절차를 제외하고, 대조군(Control group) 동물들은 프로토콜 관련 핸들링이나 보정, 수분 제한, 정맥 또는 복강 내 주사, 경구 투여 또는 부형제 투여를 받지 않았습니다. CI-AKI 군은 8일 차에 CI-AKI 모델이 확립되었으며 아무런 치료를 받지 않은 동물들로 구성되었습니다. CI-AKI + Montelukast 군은 CI-AKI 모델이 확립된 후 montelukast로 치료받은 동물들로 구성되었습니다. CI-AKI + NAC 군은 CI-AKI 모델이 확립된 후 NAC로 치료받은 동물들로 구성되었습니다. CI-AKI + Montelukast + NAC 군은 CI-AKI 모델이 확립된 후 montelukast와 NAC 병용 치료를 받은 동물들로 구성되었습니다. 대조군과 치료를 받지 않은 CI-AKI 군 모두 치료 매칭 샴(sham) 절차를 거치지 않았습니다. 구체적으로, 이 군들에서는 샴 핸들링, 샴 경구 투여, 샴 치료 주사 또는 치료 매칭 부형제 투여가 수행되지 않았습니다. L-NAME, indomethacin 및 montelukast 조제에 사용된 부형제는 화학 물질 조제법에 기술된 바와 같이 각각 0.9% normal saline, 5% sodium bicarbonate solution 및 0.5% CMC였습니다. NAC는 추가 희석 없이 상용 제형 그대로 투여되었으며, NAC를 위한 별도의 부형제는 준비하지 않았습니다. 8일 차에 대조군을 제외한 모든 동물은 16시간 동안 수분을 제한한 후, 조영제 유발 급성 신손상을 유도하기 위해 L-NAME (10 mg/kg), indomethacin (10 mg/kg) 및 iohexol (3 g iodine/kg)을 순차적으로 정맥 투여받았습니다. 지정된 치료군의 경우, montelukast (10 mg/kg, 경구 투여) 및/또는 NAC (100 mg/kg, 복강 내 주사)를 8일 차에 iohexol 투여 완료 1시간 후(L-NAME 투여 후 약 1.5시간 후에 해당)에 먼저 투여하였으며, 이후 9일 차와 10일 차에 동일한 시간에 매일 1회 투여하였습니다.

약물 투여 프로토콜

CI-AKI는 16시간의 수분 제한 후 L-NAME, indomethacin, iohexol을 순차적으로 정맥 투여하는 기발표된 실험 프로토콜에 따라 유도되었다23,24,25. L-NAME과 indomethacin은 각각 10 mg/kg으로 투여되었으며, iohexol은 3 g iodine/kg으로 투여되었다. 치료 용량은 montelukast sodium의 경우 10 mg/kg, NAC의 경우 100 mg/kg이었다. 모델 유도 및 치료 용량의 선택은 기존에 발표된 실험 연구를 참고하였다22,26,27. 사전 용량 범위 설정 또는 용량 최적화 연구는 수행되지 않았다. NAC 및 montelukast 용량은 개별 약제에 대해 기발표된 실험 연구를 바탕으로 독립적으로 선정되었으며, 병용 투여 특이적 용량 결정 연구를 통해 도출된 것이 아니다. 선택된 용량은 약리학적으로 동등한 노출을 나타내도록 의도된 것이 아니며, 용량-반응 분석이나 공식적인 약물 상호작용 분석은 수행되지 않았다. 개별 동물 수준에서 모델 유도의 성공 여부를 정의하기 위해 미리 지정된 수치적 또는 실험실적 임계값은 사용되지 않았다. 연구 종료 시점에서, 대조군과 비교하여 치료받지 않은 CI-AKI군에서 관찰된 특징적인 조직병리학적 변화를 통해 신장 손상의 성공적인 유도를 확인하였다. 8일차에 대조군을 제외한 모든 동물은 조영제 유발 급성 신손상(CI-AKI) 유도 직전에 16시간 동안 한 번의 수분 제한 과정을 거쳤다. 수분 제한은 나머지 실험 기간 동안 반복되지 않았다. 표준 펠릿 사료는 수분 제한 기간 내내 자유롭게 섭취할 수 있도록 제공되었다. 16시간의 단일 수분 제한 기간이 끝난 후, 첫 번째 모델 유도 약제인 L-NAME을 투여하기 전, 수분 제한을 거친 모든 실험군에 대해 수돗물 접근을 동시에 자유롭게 허용하였으며, 이는 실험 종료 시까지 유지되었다. 수분 복구의 시점과 조건은 모든 수분 제한군에서 동일했다. 복구 후 수분 섭취량은 미리 정의된 부피로 제한되지 않았으며 정량적으로 측정되지 않았다. 16시간 수분 제한 직전과 직후의 체중을 측정하지 않았으므로, 탈수와 관련된 체중 감소율은 계산할 수 없었다. 소변 배출량은 정량적으로 모니터링되지 않았다. 수분 접근 복구 후 CI-AKI 유도를 시작하였다. L-NAME, indomethacin, iohexol의 모든 순차적 정맥 투여는 멸균 5 mL 주사기에 연결된 26 G 바늘을 사용하여 외측 미정맥을 통해 수행되었다. 정맥 투여 전, 외측 미정맥의 시각화와 확장을 용이하게 하기 위해 꼬리를 수 분 동안 따뜻한 물에 데웠다. 각 정맥 투여 후, 각각의 모델 유도 약제의 계산된 투여 부피 외에 추가로 0.5 mL의 멸균 0.9% 생리식염수로 정맥을 세척하였다. 투여 및 세척 과정 전반에 걸쳐 부종, 누출 또는 혈관 외 유출 징후가 있는지 주사 부위를 시각적으로 모니터링하였다. 먼저 L-NAME (10 mg/kg)을 투여하였다. L-NAME 투여 15분 후, indomethacin (10 mg/kg)을 동일한 외측 미정맥을 통해 정맥 투여하였다. indomethacin 투여 15분 후, iohexol을 동일한 외측 미정맥을 통해 3 g iodine/kg의 용량으로 정맥 투여하였다. 각 동물에 대해 iohexol 용량과 그에 따른 주입 부피는 연구 시작 시 기록된 체중과 상용 요오드 농도인 300 mg iodine/mL를 기준으로 개별적으로 계산되었다. 이는 10 mL/kg의 투여 부피에 해당하며, 따라서 200–220 g 무게의 쥐의 경우 약 2.0–2.2 mL가 되었다. 프로토콜상에 정의된 별도의 최대 허용 정맥 투여 부피는 지정되지 않았으며, 본 연구에서 사용된 단일 약제 최대 정맥 투여량은 iohexol 10 mL/kg이었다. Iohexol은 약 1~2분에 걸쳐 천천히 투여되었다. 주사 부위에 가시적인 부종, 누출 또는 혈관 외 유출이 없는 것을 통해 성공적인 정맥 투여를 확인하였다. 부분적 혈관 외 유출은 관찰되지 않았으며, 혈관 외 유출 의심으로 인해 재시도나 반복 투여가 필요한 사례는 없었다. Iohexol 투여 완료 1시간 후, 치료군에 지정된 치료제를 처음으로 투여하였다. Iohexol 투여는 L-NAME 투여 30분 후에 시작되어 약 1~2분 동안 진행되었으므로, 치료 시작은 L-NAME 투여 후 약 91~92분(약 1.5시간) 후에 이루어졌다. Montelukast sodium (10 mg/kg)은 경구 투여(gavage)하였고, NAC (100 mg/kg)는 복강 내 투여하였다.

22 G 스테인리스 스틸 급여 캐뉼라를 사용하여 경구 투여를 수행하였습니다. 각 동물은 직립 상태를 유지하도록 하였으며, 급여 캐뉼라를 식도를 통해 위까지 조심스럽게 삽입하였습니다. 과도한 저항이 느껴지는 경우, 약물을 투여하기 전에 캐뉼라를 뺀 후 다시 위치를 조정하였습니다. 투여 중 및 투여 직후에 역류가 있는지 관찰하였습니다. 모든 동물에서 투여 중 또는 투여 직후에 역류나 기타 불완전한 경구 투여의 증거가 관찰되지 않았으며, 경구 투여 실패 의심으로 인해 제외된 동물은 없었습니다. 복강 내 주사는 복부의 우하복부에 투여하였습니다. 바늘을 약 30°–45° 각도로 삽입하였으며, 투여 전 흡인을 수행하여 의도치 않은 혈관 진입 여부를 확인하였습니다. 투여 중 및 투여 직후에 주사 부위에 누출, 출혈 또는 기타 가시적인 합병증이 있는지 시각적으로 모니터링하였습니다. 지정된 처치는 8, 9, 10일째에 매일 동일한 시간에 투여되었습니다. 이에 따라 CI-AKI + Montelukast 군의 동물은 3일 연속으로 매일 한 번씩 montelukast를 투여받았고, CI-AKI + NAC 군의 동물은 3일 연속으로 매일 한 번씩 NAC를 투여받았으며, CI-AKI + Montelukast + NAC 군의 동물은 동일한 3일 처리 일정에 따라 매일 한 번씩 montelukast와 NAC를 모두 투여받았습니다. 모든 모델 유도 및 약물 처치는 동일한 연구자가 수행하였습니다. 체중은 연구 시작 시 각 동물에 대해 한 번 측정하였으며, 실험 기간 동안 재측정하지 않았습니다. 각 동물에 대해 모든 모델 유도제 및 연구 처리제의 용량과 그에 따른 투여량은 연구 시작 시 기록된 체중을 사용하여 개별적으로 계산하였습니다. 모든 정맥, 복강 내 및 경구 투여 절차는 투여 관련 변동성을 최소화하기 위해 동일한 표준화된 기술을 사용하여 수행되었습니다.

안락사 절차, 인도적 종료 시점 및 시료 수집

실험 전 기간 동안 동물들의 전신 상태, 사료 및 음수 섭취량, 운동성, 자세, 모질의 외관 및 고통의 징후를 매일 한 번씩 관찰하였다. 사전에 정의된 인도적 종료 시점은 심한 무기력증, 제공된 사료나 물을 섭취하거나 접근하지 못하는 상태, 비정상적인 자세, 운동성 감소, 지속적인 입모, 그리고 기타 명백한 고통의 발현으로 구성되었다. 이러한 기준 중 어느 하나라도 충족하는 동물은 즉시 안락사를 실시하기로 하였으나, 연구 기간 동안 인도적 종료 기준을 충족한 동물은 없었다. 최종 처치 24시간 후인 11일 차에 케타민(80 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)을 복강 내 투여하여 깊은 마취를 유도하였다. 적절한 마취 평면을 확인하기 위해 발절 제반사(pedal withdrawal response)의 소실 여부를 확인하였다. 충분한 마취 깊이가 확인된 후, 각 동물로부터 심장 천자를 통해 약 3~5 mL의 혈액을 채취하였다. 이후 동물이 깊은 마취 상태를 유지하는 동안 방혈을 통해 안락사를 완료하였다. 심장 활동과 자발적 호흡이 모두 없는 것을 확인하여 사망을 판정하였다.

혈청 생화학적 측정을 위해 채취한 혈액은 항응고제가 없는 튜브에 넣고 응고가 완료될 때까지 방치하였습니다. 이후 튜브를 4 °C에서 3,000 × g로 10–15분 동안 원심분리한 후, 혈청 분획을 분리하여 분석 전까지 −80 °C에 보관하였습니다. 글루타치온 측정을 위한 시료는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 포함된 튜브에 별도로 채취하였습니다. 이러한 검체들은 항응고 처리되었으므로, 해당 글루타치온 분석 절차에 따라 응고 단계 없이 처리되었습니다. 회수된 혈청이 투명하고 용혈의 가시적 증거가 없을 때 혈청 분리가 적절하게 이루어진 것으로 간주하였습니다.

사망이 확인된 후, 정중선 개복술을 실시하여 각 동물로부터 양측 신장을 조심스럽게 적출하였습니다. 표본에서 주변 지방 및 결합 조직을 제거하였습니다. 오른쪽 신장은 조직병리학적 검사 전용으로 보존하였으며, 왼쪽 신장은 생화학적 분석에 할당하였습니다. 왼쪽 신장의 혼합 조직은 신피질과 신수를 별도로 분리하지 않고 분석하였습니다. 두 신장은 독립적으로 취급하였으며, 서로 다른 동물의 표본은 처리 과정 전반에 걸쳐 통합하지 않고 분리된 상태로 유지하였습니다. 오른쪽 신장 전체를 10% 중성 완충 포르말린에 넣고 조직병리학적 평가를 위해 처리하였습니다. 신피질과 외수질을 포함하는 절편을 제작하였으며, 조직병리학적 처리 및 점수 산정법에 기술된 절차에 따라 검사하였습니다. 각 왼쪽 신장에는 개별적으로 라벨을 부착하였으며, 균질화 및 생화학적 테스트 전까지 -80 °C에서 보관하였습니다. 적출 후 조직의 육안적 무결성을 확인하였으며, 의도한 조직병리학적 및 생화학적 평가를 위해 충분한 양의 조직을 확보하였습니다.

모델 유도 및 처리 투여를 담당한 연구자는 실험군마다 서로 다른 절차를 거쳤기 때문에 눈가림 처리를 할 수 없었습니다. 그러나 생화학 및 통계 분석을 수행하는 연구자와 조직병리학적 평가를 수행하는 병리학자에게는 그룹 식별 정보를 숨겼습니다. 등록된 모든 동물은 연구에 유지되었으며 이후 분석에 포함되었습니다. 생물학적 시료, 동물 조직, 포름알데히드 기반 고정액 및 기타 화학 폐기물은 적절한 개인 보호 장구를 착용하여 취급하였습니다. 모든 생물학적 및 화학적 폐기물의 처리는 기관의 생물 안전 및 위험 폐기물 관리 규정에 따라 수행되었습니다.

생화학적 분석

생화학적 측정은 각 동물에서 수집한 혈청, EDTA 항응고 혈액 및 왼쪽 신장 조직 균질액을 사용하여 수행되었습니다. 절차는 각 파라미터에 사용된 생물학적 매트릭스에 따라 아래와 같이 제시됩니다. 혈청에서는 urea, 혈중 요소 질소(BUN), creatinine, superoxide dismutase(SOD) 및 malondialdehyde(MDA)를 분석하였습니다. Urea, BUN 및 creatinine은 신장 기능 지표로 활용되었으며, SOD 활성과 MDA 농도는 산화 스트레스 파라미터로 평가되었습니다. 혈청 urea 및 BUN 값은 동일한 효소적 urease–glutamate dehydrogenase 분석법을 사용하여 얻었습니다. 이 방법에서 urea는 urease에 의해 가수분해되어 암모니아를 생성하며, 이는 이후 glutamate dehydrogenase 존재 하에 2-oxoglutarate 및 환원된 nicotinamide adenine dinucleotide(NADH)와 반응합니다. 사용된 분석 방법은 효소적 urease–glutamate dehydrogenase 역학 분석법이었습니다. NADH 소비로 인한 흡광도 감소는 분광광도계를 사용하여 역학적으로 측정되었습니다. 혈청 creatinine 농도는 자동 생화학 분석기를 사용하여 비색법으로 측정되었습니다. 혈청 SOD 활성은 동일한 자동 생화학 분석기에서 상용 분석 키트를 사용하여 비색법으로 측정되었습니다. SOD 분석은 xanthine–xanthine oxidase 시스템에 의한 슈퍼옥사이드 라디칼 생성과, 이들이 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride와 반응하여 유색의 formazan 생성물을 형성하는 원리를 기반으로 합니다. 최종 흡광도는 505 nm에서 측정되었으며, SOD 활성은 U/mL로 표시되었습니다. 혈청 MDA 농도는 thiobarbituric acid 반응을 이용한 비색법으로 결정되었습니다. 혈청 샘플을 차가운 trichloroacetic acid와 혼합하여 단백질을 침전시켰고, 생성된 침전물은 원심분리로 분리하였습니다. 이 원심분리 단계는 4 °C에서 7,500 × g로 5분 동안 수행되었습니다. 상청액을 90 °C에서 60분 동안 thiobarbituric acid와 반응시킨 후 냉각하여 532 nm에서 측정하였습니다. MDA 농도는 해당 검정 곡선으로부터 계산하여 nmol/mL로 표시하였습니다. Glutathione(GSH) 분석은 EDTA 항응고 혈액을 사용하여 수행되었습니다. trichloroacetic acid로 단백질을 침전시켰으며, 생성된 탈단백 샘플을 변형된 Ellman 법으로 비색 분석하였습니다. 샘플을 pH 8.2의 500 mM Tris 완충액 내의 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB)와 혼합하였습니다. GSH의 티올기가 DTNB와 반응하여 유색 생성물을 형성하였으며, 흡광도는 412 nm에서 기록되었습니다. Catalase(CAT) 활성은 2단계 비색 절차를 사용하여 결정되었습니다. 샘플을 먼저 일정량의 과산화수소와 함께 배양하였으며, catalase는 이를 물과 분자상 산소로 전환하였습니다. 효소 반응이 종료된 후, 잔류 과산화수소를 발색 시약을 사용하여 측정하였습니다. 흡광도는 405 nm에서 기록되었으며, CAT 활성은 U/mL로 보고되었습니다. 신장 조직 측정의 경우, 각 동물의 왼쪽 신장을 피질과 수질을 분리하지 않고 혼합 조직으로 사용하였습니다. 절차에 명시된 바와 같이, 오른쪽 신장은 오직 조직병리학적 평가를 위해서만 보존되었습니다. 개별 동물에 속하는 샘플은 독립적으로 처리되었으며 어떤 단계에서도 풀링(pooling)되지 않았습니다. 각 왼쪽 신장 표본은 조직 대 완충액 비율 1:10(w/v)으로 pH 7.4의 50 mM 인산염 완충액 내에서 얼음 위에서 균질화되었습니다. 쥐 한 마리당 하나의 동물 특이적 신장 조직 균질액이 생성되었습니다. 이 균질액의 별도 분취액들이 서로 다른 신장 조직 측정에 사용되어, 모든 파라미터가 동일한 개별 동물로부터 유도되도록 하였습니다. 생성된 신장 조직 균질액은 4 °C에서 14,000 × g로 10분 동안 원심분리되었습니다. 원심분리 후, 각 동물로부터 얻은 상청액을 별도로 수집하여 계획된 신장 조직 분석을 위한 분취액으로 나누었습니다. 신장 조직 상청액 내의 tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-1 beta(IL-1β), interleukin-6(IL-6), cystatin C 및 KIM-1 농도는 쥐 특이적 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 키트를 사용하여 측정하였습니다. 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 배양 조건은 TNF-α, IL-1β, IL-6, cystatin C 및 KIM-1 ELISA에 대해 동일했습니다. 각 분석에서 샘플과 ELISA 시약을 37 °C에서 1시간 동안 배양하였으며, 5회의 세척 주기 후 기질 용액 A와 B를 첨가하고 37 °C에서 10분 동안 배양하였습니다. 간단히 설명하면, 표준품과 신장 조직 상청액을 항체가 사전 코팅된 웰에 첨가한 후, 해당 비오틴화 검출 항체와 streptavidin–horseradish peroxidase 접합체를 첨가하였습니다. 지정된 배양 단계 후, 결합되지 않은 성분들을 자동 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 제거하였습니다. 이후 기질 용액을 첨가하고 산성 정지 용액을 사용하여 발색 반응을 종료시켰습니다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 측정하였으며, 분석물 농도는 해당 표준 곡선으로부터 계산하였습니다. 신장 조직 ELISA 측정은 이중(duplicate)으로 수행되었습니다. 각 분석물에 대해 두 개의 기술적 반복(technical replicate) 웰의 평균을 계산하여 단일 동물 수준의 값을 얻었습니다. 동일한 동물 특이적 균질액에서 얻은 기술적 반복 웰과 별도의 분취액은 독립적인 관찰값으로 간주하지 않았습니다. 모든 생화학적 측정은 표준화된 분석 특이적 조건 하에 수행되었습니다. 혈청, EDTA 항응고 혈액 및 신장 조직 샘플은 해당 분석 방법의 요구 사항에 따라 별도로 처리되었습니다. 생화학 분석을 수행한 연구자들은 그룹 배정에 대해 블라인드 처리되었습니다. 각 혈청 샘플, 혈액 샘플, 신장 표본, 균질액 분취액 또는 기술적 반복 웰이 아닌, 개별 동물을 실험 단위로 간주하였습니다. 이에 따라, 각 실험 그룹에 대해 6개의 독립적인 동물 수준 관찰값이 통계 분석에 포함되었습니다.

조직병리학적 처리 및 점수 산정

우측 신장 표본은 일반적인 조직학적 처리 과정을 통해 현미경 평가를 위해 준비되었습니다. 각 동물의 우측 신장 전체를 10% 중성 완충 포름알데히드에 담가 실온에서 72시간 동안 고정하였습니다. 고정 후, 50%, 70%, 80%, 96%, 100% 에탄올 순으로 각 농도에서 1시간씩 조직 탈수를 수행하였습니다. 그 후 표본을 파라핀 포매 전, 30분씩 두 번의 자일렌 배스에 노출시켰습니다. 회전식 마이크로톰을 사용하여, 신장 피질과 외수질이 모두 포함된 5 µm 두께의 절편을 파라핀 블록에서 얻었습니다.

hematoxylin and eosin (HE) 염색을 위해, 절편을 탈파라핀화 및 재수화시킨 후, 5분 동안 hematoxylin에 노출시키고 흐르는 수돗물에서 5분간 추가로 세척하였습니다. 분별을 위해 산성 알코올을 사용하였으며, 그 후 절편을 암모니아수로 1분간 청색화하고 2분 동안 eosin으로 대조 염색하였습니다. 염색된 절편은 이후 농도가 높아지는 알코올 순서대로 탈수하고, xylene으로 투명화한 후 커버글라스를 덮어 영구 봉입하였습니다.

Masson’s trichrome 염색을 위해 지정된 절편들 또한 동일하게 탈파라핀 및 재수화 과정을 거쳤습니다. 56 °C에서 60분 동안 매염 처리를 수행한 후, 흐르는 수돗물로 10분간 세척하였습니다. 그다음 절편들을 Weigert’s iron hematoxylin으로 10분, Biebrich scarlet–acid fuchsin 용액으로 15분, 인텅스텐산 용액으로 10분, 그리고 aniline blue 용액으로 10분 동안 순차적으로 처리하였습니다. 1% 아세트산에 5분간 침전시킨 후, 절편들을 탈수하고 xylene으로 투명화한 뒤 커버글라스를 덮어 마운팅하였습니다.

현미경 평가 전, 각 방법의 염색 적절성을 별도로 검증하였다. HE 염색 절편은 핵의 세부 구조와 세포질의 대비가 명확하게 구별될 때 적절한 것으로 간주하였으며, Masson’s trichrome 염색 절편은 결합 조직 구조를 뚜렷하게 시각화할 수 있을 때 수용하였다. 각 동물당 3개의 HE 염색 절편과 3개의 Masson’s trichrome 염색 절편을 검사하였다. 각 절편에서 40× 대물렌즈를 사용하여 무작위로 선택한 5개의 현미경 시야를 평가하였다. 이에 따라 동물당 염색 방법별로 15개의 현미경 시야를 검사하였다. 모든 현미경 검사는 모든 동물과 실험군에 걸쳐 동일한 대물렌즈와 표준화된 평가 조건 하에 수행되었다. Masson’s trichrome 염색 절편은 간질 콜라겐의 분포 및 침착, 세포외 기질 축적, 그리고 세관-간질 구조에 대해 정성적으로 평가하였다. 이 절편들은 0–3점의 반정량적 조직병리학적 손상 점수를 생성하는 데 사용되지 않았다. 대표적인 HE 및 Masson’s trichrome 염색 광미세사진은 40× 대물렌즈를 사용하여 획득하였으며, 각 대표 이미지에 100 µm 스케일 바를 포함하였다. 이러한 광미세사진은 예시 목적으로 얻은 것이며, 조직병리학적 점수 산정이나 통계 분석에서 독립적인 관찰치로 취급하지 않았다. 모든 조직병리학적 평가는 실험군 정체를 알지 못하는 한 명의 숙련된 병리학자에 의해 블라인드 방식으로 수행되었다. 단일 블라인드 검사자를 사용한 것은 평가 편향과 관찰자 간 차이로 인한 변동을 제한하기 위함이었다. 세관 괴사, 세관 확장, 세포 변성 및 혈관 충혈은 이전에 발표된 신장 손상 모델28,29에서 응용된 시스템에 따라 HE 염색 신장 절편에서 반정량적으로 점수를 매겼다. 각 파라미터에 대해 점수는 0에서 3까지였으며, 이는 각각 조직병리학적 손상이 없는 상태, 경미함, 보통, 심함에 해당한다. 각 동물에 대해, 3개의 HE 염색 절편 각각에서 검사한 5개의 현미경 시야(총 15개 시야)의 소견을 종합적으로 고려하여 각 조직병리학적 파라미터에 대해 단일 0–3점 점수를 부여하였다. 따라서 각 동물은 세관 괴사, 세관 확장, 세포 변성 및 혈관 충혈에 대해 하나의 점수를 제공하였다. 조직 절편과 현미경 시야는 동물 내 하위 표본으로 취급되었으며, 독립적인 관찰치로 간주되지 않았다. 각 절편 내에서 현미경 시야는 동물 및 실험군 간의 해부학적 샘플링을 표준화하기 위해 유사한 신장 피질 및 외수질 영역에서 무작위로 선택되었다. 각 신장, 조직 절편 또는 현미경 시야가 아닌 개별 동물을 실험 단위로 간주하였다. 이에 따라 각 실험군에 대해 6개의 독립적인 동물 수준 관찰치가 통계 분석에 포함되었다. Table 3에 제시된 값은 각 실험군의 동물 6마리에 대한 개별 동물 수준 점수로부터 계산된 집단 평균을 나타낸다.

통계 분석

통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 모든 통계 분석에서 개별 동물을 실험 단위로 간주하였다. 각 실험군은 6마리의 독립적인 동물로 구성되었다(그룹당 n = 6). 기술적 반복, 분석 웰, 조직 절편 및 현미경 관찰 시야는 독립적인 관찰치로 처리하지 않았으며, 통계적 표본 크기를 늘리는 데 사용하지 않았다. 연속 변수는 평균으로 나타낸다. ± 표준편차(SD). 정규성은 Shapiro-Wilk 검정을 통해 각 실험군 내에서 개별적으로 평가하였으며, 분산의 균질성은 Levene 검정을 사용하여 평가하였다. 그룹 간 표본 크기가 동일한 완전 균형 실험 설계(fully balanced experimental design)를 고려하여, 그룹 간 비교를 위해 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하였다. 사후 분석으로는 Duncan의 다중 비교 검정을 통해 쌍별 비교를 수행하였다. 잠재적 이상치는 박스 플롯의 그래픽 검토와 개별 관찰값 조사를 통해 평가하였다. 측정 오류나 유효하지 않은 실험 결과로 간주된 관찰값은 없었으며, 통계적 근거로 제외된 데이터 포인트 또한 없었다. pp-값 < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.

결과

혈청 신장 기능 지표(요소, 혈중 요소 질소, 크레아티닌)

본 연구의 실험 설계, 동물 군 분류, 처리 일정 및 시료 채취 일정은 다음에 요약되어 있다. 그림 1. 그룹 간 혈청 요소, BUN 및 크레아티닌 수치에서 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p = 0.003, p = 0.003, 및 p = 0.002). 평균 혈청 요소 농도는 67.43 mg/dL이었다 ± 대조군에서 53.11 mg/dL이었으며 606.71 mg/dL로 증가함 ± CI-AKI 군에서 429.42 mg/dL이었다. 마찬가지로, 평균 BUN 농도는 31.51 mg/dL에서 증가하였다. ± 대조군에서 24.82 mg/dL에서 268.63 mg/dL로 ± CI-AKI 군에서 190.84 mg/dL로 상승하였다. 혈청 크레아티닌 농도도 0.60 mg/dL에서 현저히 증가하였다. ± 대조군에서 0.05 mg/dL에서 3.27 mg/dL로 ± CI-AKI 그룹에서 2.14 mg/dL이었다. 던컨의 사후 비교 분석 결과, 혈청 요소, BUN 및 크레아티닌 수치는 치료받지 않은 CI-AKI 그룹보다 각각 CI-AKI + 몬텔루카스트 그룹, CI-AKI + NAC 그룹, CI-AKI + 몬텔루카스트 + NAC 그룹에서 모두 유의하게 낮았다(모두 p < 0.05). 혈청 신기능 지표의 데이터는 다음과 같다. 표 1.

산화 스트레스 지표 및 항산화 효소 활성

SOD, GSH, CAT 및 MDA 수준에서 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되었다(p = 0.044, p = 0.001, p = 0.003 및 p = 0.001, 각각; 표 1). 던컨의 사후 분석(Duncan’s post hoc analysis) 결과, GSH 수준은 치료하지 않은 CI-AKI 그룹보다 몬텔루카스트, NAC 및 병용 치료 그룹에서 유의미하게 더 높았다(모두 p < 0.05). 병용 치료 그룹은 대조군에 비해서도 GSH 수준이 유의미하게 더 높았다(p < 0.05). 그러나 병용 치료 그룹과 단일 치료 그룹 간, 또는 두 단일 치료 그룹 간에는 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되지 않았다(모두 p > 0.05). SOD 수준은 CI-AKI 그룹에서 가장 낮았으며(92.23 U/mL ± 16.37 U/mL), 대조군은 147.81 U/mL ± 33.27 U/mL를 보였다. GSH 수준은 CI-AKI 그룹에서 가장 낮았고(66.05 mmol/L ± 24.72 mmol/L), CI-AKI + 몬텔루카스트 + NAC 그룹에서 가장 높았다(172.44 mmol/L ± 60.48 mmol/L). CAT 활성은 대조군에서 가장 높았고(93.35 U/mL ± 18.75 U/mL), CI-AKI 그룹에서 가장 낮았다(33.22 U/mL ± 17.07 U/mL). MDA 수준의 경우, CI-AKI 그룹에서 가장 높은 값을 보였고(54.13 nmol/mL ± 19.37 nmol/mL), 가장 낮은 값은 CI-AKI + NAC 그룹에서 기록되었다(21.53 nmol/mL ± 5.07 nmol/mL). 산화 스트레스 지표 및 항산화 효소 활성에 관한 자료는 표 1에 제시되어 있다.

신장 손상 및 염증성 생체지표(KIM-1, Cystatin C, TNF-α, IL-1β, 및 IL-6)

그룹 간 신장 캐스타틴 C, IL-6, KIM-1, TNF-α 및 IL-1β 수치에서 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.001, p = 0.008, p = 0.027, p = 0.006 및 p < 0.001; 각각 표 2). 던컨(Duncan)의 사후 비교 결과, 캐스타틴 C, IL-6, KIM-1, TNF-α 및 IL-1β 수치는 치료받지 않은 CI-AKI 그룹보다 각각의 치료 그룹인 CI-AKI + 몬테루카스트, CI-AKI + NAC 및 CI-AKI + 몬테루카스트 + NAC 그룹에서 유의하게 낮았다(모두 p < 0.05). IL-1β의 경우, CI-AKI + 몬테루카스트 그룹과 CI-AKI + NAC 그룹 사이에서도 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p < 0.05). 신장 캐스타틴 C 수치는 CI-AKI 그룹에서 가장 높았으며(18.43 ng/mL ± 1.06 ng/mL), 대조군은 10.30 ng/mL ± 0.78 ng/mL의 값을 나타냈다. 마찬가지로, IL-6 수치는 CI-AKI 그룹에서 가장 높았고(13.41 ng/L ± 2.14 ng/L), 대조군에서 가장 낮았다(9.29 ng/L ± 2.70 ng/L). KIM-1 수치는 대조군(2.25 ng/mL ± 0.54 ng/mL)에 비해 CI-AKI 그룹에서 가장 높았다(3.07 ng/mL ± 0.36 ng/mL). 또한 TNF-α 수치는 CI-AKI 그룹에서 가장 높았으며(161.69 ng/L ± 26.14 ng/L), 가장 낮은 수치는 대조군에서 관찰되었다(95.49 ng/L ± 16.98 ng/L). IL-1β 수치는 CI-AKI 그룹에서 가장 높았고(9.28 ng/mL ± 0.68 ng/mL), 가장 낮은 값은 CI-AKI + 몬테루카스트 그룹에서 관찰되었다(7.34 ng/mL ± 0.57 ng/mL). 신장 손상 및 염증성 생체지표에 관한 데이터는 표 2에 제시되어 있다. 중요하게도, CI-AKI + 몬테루카스트 + NAC 그룹의 일부 생화학적 지표 수치는 CI-AKI + 몬테루카스트 그룹보다 수치상으로 높았지만, 던컨의 사후 비교 분석 결과, 산화 스트레스 지표, 신장 손상 생체지표 및 염증성 생체지표를 포함한 평가된 모든 생화학적 변수에서 두 치료 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이는 없었다(p > 0.05).

조직병리학적 평가

조직병리학적 소견

HE 염색한 신장 절편에서 대조군은 정상적인 사구체 및 세뇨관 형태를 포함한 보존된 신장 구조를 나타냈다. 반면, 치료하지 않은 조영제 유도 급성 신장 손상(CI-AKI) 군에서는 세뇨상피 손상, 광범위한 세포 변성, 세뇨관 확장, 세뇨관 내 세포 잔해 및 혈관 충혈을 포함한 현저한 조직병리학적 변화가 관찰되었다. 괴사성 변화는 특히 근위세뇨관 구역에서 두드러지게 나타났다. CI-AKI + 몬테루카스트 군에서는 치료하지 않은 CI-AKI 군에 비해 세뇨관 손상의 중증도가 감소하였으나, 국소적인 퇴행성 변화는 여전히 관찰되었다. 마찬가지로, CI-AKI + NAC 군에서도 세뇨상피의 구조적 완전성이 더 잘 유지되었으며 괴사 영역이 적었다. 질적 조직병리학적 검사에서 CI-AKI + 몬테루카스트 + NAC 군에서는 피질 및 수질 구조가 대체로 보존되고, 세뇨관 괴사, 세뇨관 확장, 세포 변성 및 혈관 충혈이 비교적 제한적으로 나타나는 등 신장 구조가 보존된 것으로 보였다. Masson’s trichrome 염색 절편에서는 대조군에서 간질 콜라겐의 정상적인 분포가 관찰되었다. 치료하지 않은 CI-AKI 군에서는 간질 콜라겐 침착 증가, 세뇨간질 구조의 불규칙성 및 세포외기질 축적이 관찰되었다. 이러한 변화는 치료군, 특히 병합 치료군에서 치료하지 않은 CI-AKI 군에 비해 덜 두드러졌다. 이러한 결과를 보여주는 대표적인 HE 염색 및 Masson’s trichrome 염색 신장 절편은 그림 2에 제시되어 있다.

반정량적 조직병리학적 점수 평가

반정량적 조직병리학적 평가 결과, 세뇨관 괴사, 세뇨관 확장, 세포 변성 및 혈관 혼잡 점수는 치료받지 않은 CI-AKI 군에서 가장 높았다. 이 군의 평균 점수는 각각 2.67, 2.83, 2.67 및 2.50이었다. 0–3 척도의 상한선에 근접한 비교적 높은 평균 점수는 동일 군에서 정성적 조직병리학적 검사에서 관찰된 광범위하고 심각한 세뇨관 및 혈관 변화와 일치하였다. 반면, 모든 지표는 대조군에서 나타나지 않았다. 모든 치료군에서는 치료받지 않은 CI-AKI 군에 비해 손상 점수가 낮았다. CI-AKI + 몬테루카스트 군에서는 세뇨관 괴사에서 1.33, 세뇨관 확장에서 1.50, 세포 변성에서 1.17, 혈관 혼잡에서 1.00의 평균 점수가 나타났다. CI-AKI + NAC 군의 해당 값은 각각 1.17, 1.17, 0.83 및 0.83이었다. 수치적으로 가장 낮은 평균 조직병리학적 손상 점수는 CI-AKI + 몬테루카스트 + NAC 군에서 관찰되었으며, 세뇨관 괴사, 세뇨관 확장, 세포 변성, 혈관 혼잡에 대한 평균값은 각각 0.50, 0.67, 0.50 및 0.17이었다. 상세한 조직병리학적 점수 데이터는 표 3에 제시되어 있다.

모든 생화학적 및 조직병리학적 분석의 기초가 되는 원시 데이터와 원본의 자르지 않은 HE 및 마슨 트리크롬(Masson’s trichrome) 조직학 이미지는 보충 파일 1로 제공된다.

figure-results-1
그림 1: 실험 설계 및 연구 일정. 실험 절차를 개략적으로 나타낸 그림이다. 성체 수컷 Wistar 쥐 30마리를 7일간 적응시킨 후, 다섯 그룹으로 무작위 배정하였다(각 그룹 n = 6). 대조군은 물 금식, CI-AKI 유도 또는 치료를 시행하지 않았다. 나머지 그룹은 16시간 단일 급수 금지 후, 순차적으로 L-NAME(10 mg/kg), 인도메타신(10 mg/kg), 그리고 요헥솔(3 g 요소/kg)을 정맥 내 투여하여 CI-AKI를 유도하였다. 요헥솔 투여 1시간 후, 각각의 치료군은 몬텔루카스트(10 mg/kg, 경구 투여), NAC(100 mg/kg, 복강 내 주사), 또는 두 약물을 모두 8일차부터 10일차까지 하루 한 번씩 투여받았으며, 치료하지 않은 CI-AKI 군은 치료용 약물을 투여받지 않았다. 모든 그룹은 11일차에 최종 절차 및 시료 채집을 시행하였다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 실험군에서 얻은 대표적인 HE 및 Masson’s trichrome 염색 신장 절편. 대표적인 HE 염색 및 Masson’s trichrome 염색 신장 절편은 각각 (A) 대조군, (B) CI-AKI군, (C) CI-AKI + Montelukast군, (D) CI-AKI + NAC군, 그리고 (E) CI-AKI + Montelukast + NAC군에서 채취하였다. HE 염색 절편(상단 행)에서는 대조군에서 신장 조직 구조가 잘 보존되어 있는 반면, CI-AKI군에서는 현저한 세뇨관 괴사(*), 세뇨관 확장(+), 세포 변성(×), 혈관 충혈(↑)이 관찰된다. 이러한 조직병리학적 변화는 치료군의 대표 절편에서 치료하지 않은 CI-AKI군에 비해 완화된 것으로 나타났다. Masson’s trichrome 염색 절편(하단 행)에서는 CI-AKI군에서 간질 콜라겐 침착 및 세뇨관-간질 구조의 불규칙성이 증가하였으며, 치료군의 대표 절편에서는 이러한 변화가 덜 두드러지게 나타났다. 눈금 막대 = 100 µm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

변수대조군CI-AKICI-AKI+MCI-AKI+NACCI-AKI+NAC+Mp
UREA (mg/dL)67.43±53.11a606.71±429.42b105.89±28.63a243.14±135.99a293.61±212.05a0.003
BUN (mg/dL)31.51±24.82a268.63±190.84b51.53±14.69a129.54±73.54a108.38±87.36a0.003
Creatinine (mg/dL)0.60±0.05a3.27±2.14b0.61±0.12a1.53±1.17a1.28±0.55a0.002
SOD (U/mL)147.81±33.27a92.23±16.37b130.96±42.19a137.87±31.95a141.71±30.27a0.044
GSH (mmol/L)124.29±21.24b66.05±24.72a133.87±26.95bc139.31±30.10bc172.44±60.48c0.001
CAT (U/mL)93.35±18.75c33.22±17.07a58.67±32.95ab52.64±19.97ab75.46±26.85bc0.003
MDA (nmol/mL)23.42±13.48a54.13±19.37b22.40±14.81a21.53±5.07a37.01±9.29a0.001
각 행 내에서 적어도 하나의 위첨자 문자를 공유하는 그룹 간에는 유의한 차이가 없었으며, 공통의 위첨자 문자를 갖지 않는 그룹 간에는 던컨의 사후 검정(Duncan’s post hoc test)에 따라 유의한 차이가 있었다(p < 0.05). 

표 1: 실험군의 생화학적 및 산화 스트레스 지표. 유의한 쌍별 차이: 요소, BUN, 크레아티닌(CREA), SOD 및 MDA는 CI-AKI 대 대조군, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC 및 CI-AKI+M+NAC 간에서 나타남; GSH는 CI-AKI 대 다른 모든 군 및 대조군 대 CI-AKI+M+NAC 간에서 나타남; CAT는 대조군 대 CI-AKI, CI-AKI+M 및 CI-AKI+NAC 간, 그리고 CI-AKI 대 CI-AKI+M+NAC 간에서 나타남. 데이터는 평균 ± SD(n = 6)로 제시되며, 일원배치 분산분석(ANOVA)과 던컨의 사후 검정을 통해 분석하였다. 공유하는 위첨자 문자가 없는 수치들은 유의하게 서로 다름(p < 0.05).

변수대조군CI-AKICI-AKI+MCI-AKI+NACCI-AKI+NAC+Mp
Cystatin C (ng/mL)10.30±0.78a18.43±1.06b10.90±1.13a11.00±0.59a11.13±0.84a<0.001
IL-6 (ng/L)9.29±2.70a13.41±2.14b10.24±0.86a10.66±0.83a10.85±1.63a0.008
KIM-1 (ng/mL)2.25±0.54a3.07±0.36b2.39±0.60a2.45±0.33a2.45±0.17a0.027
TNF-α (ng/L)95.49±16.98a161.69±26.14b110.26±38.12a119.42±35.35a127.76±15.13a0.006
IL-1β (ng/mL)7.65±0.53ab9.28±0.68c7.34±0.57a8.24±0.73b8.11±0.72ab<0.001
각 행 내에서 하나 이상의 위첨자 문자를 공유하는 그룹 간에는 유의한 차이가 없었으며, 공통의 위첨자 문자가 없는 그룹 간에는 Duncan의 사후 검정에 따라 유의한 차이가 있었다(p < 0.05). 

표 2: 실험군에서의 신장 손상 및 염증성 생체지표 수준. 개별 비교 시 유의한 차이: cystatin C, IL-6, KIM-1 및 TNF-α는 CI-AKI 대 대조군, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC, CI-AKI+M+NAC 간에서 유의하게 다름; IL-1β는 CI-AKI 대 다른 모든 군 간 및 CI-AKI+M 대 CI-AKI+NAC 간에서 유의하게 다름. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD, n = 6)로 제시하였으며, 일원배치 분산분석(one-way ANOVA) 후 Duncan의 사후 검정으로 분석함. 공유하는 윗첨자 문자가 없는 수치들은 유의하게 서로 다름(p < 0.05).

그룹세뇨관 괴사세뇨관 확장세포 변성혈관 충혈
대조군0000
CI-AKI2.672.832.672.5
CI-AKI+M1.331.51.171
CI-AKI+NAC1.171.170.830.83
CI-AKI+NAC+M0.50.670.50.17

표 3: 실험군의 신장 조직에서 조직병리학적 손상 지표 비교. H&E 염색 기반의 반정량적 조직병리학적 손상 점수는 각 그룹의 평균값(그룹당 n = 6마리)으로 제시하였다. 점수는 0(손상 없음), 1(경증), 2(중등도), 3(심한 손상)으로 등급을 매겼으며, 점수가 높을수록 조직병리학적 손상이 더 심하다는 것을 의미한다.


보충 파일 1: 본 연구 결과를 뒷받침하는 데이터.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 CI-AKI 실험 연구에서는 조영제 투여 후 montelukast, NAC 또는 이들의 병용 투여가 신장 기능, 산화 스트레스 파라미터, 염증 반응, 신장 손상 바이오마커 및 조직병리학적 결과에 미치는 영향을 평가하였습니다. 조영제 노출은 혈청 urea, BUN 및 creatinine의 상당한 증가를 유발했으며, 산화 스트레스 파라미터와 염증 바이오마커의 부정적인 변화를 동반하였습니다. KIM-1 및 cystatin C 수치의 증가는 신장 손상의 추가적인 증거를 제공하였습니다.

몬테루카스트(montelukast), NAC 또는 이들의 병용 요법을 이용한 조영제 투여 후 치료는 평가된 여러 파라미터에서 긍정적인 변화와 관련이 있었습니다. 그러나 병용 요법이 생화학적 결과 전반에서 몬테루카스트 단독 요법보다 일관되게 우수한 성능을 보이지는 않았습니다. 종합하면, 이러한 관찰 결과는 CI-AKI의 발생에 산화 스트레스와 염증이 관여한다는 점과 부합하며, 이러한 과정에 작용하는 중재법이 신장 손상을 완화할 수 있음을 시사합니다. 다만, 본 연구에서는 기저 신호 전달 경로를 직접적으로 조사하지는 않았습니다1,30.

조영제 투여 후 혈청 urea, BUN 및 creatinine의 현저한 상승은 본 실험적 CI-AKI 모델에서 신기능 장애가 성공적으로 유도되었음을 뒷받침합니다. 조영제 노출은 신내 혈관 수축, 수질 저산소증, 산화적 손상 및 세뇨관 세포 손상을 포함하는 상호작용 과정을 통해 신기능을 손상시킬 수 있습니다. 그 결과로 나타나는 신혈류량 및 사구체 여과율의 감소는 질소성 노폐물의 배출을 제한하여 혈중 농도를 증가시킬 수 있습니다. 처리되지 않은 CI-AKI군에서 관찰된 신기능 변화는 이전의 실험 연구들1,30,31,32에서 보고된 결과와 일치합니다.

처리되지 않은 CI-AKI 그룹의 혈청 요소 및 BUN에서 상대적으로 큰 표준 편차로 나타난 바와 같이 상당한 그룹 내 변동성이 관찰되었습니다. 이러한 분산은 수분 제한에 대한 신장 반응, 일산화질소 및 프로스타글란딘 경로의 억제, 그리고 조영제 노출에 대한 반응의 변동성을 포함하여, 감작된 CI-AKI 유도 프로토콜에 대한 감수성의 개체 간 생물학적 차이를 반영하는 것일 수 있습니다. 동물들 사이의 신장 기능 예비력 및 생리학적 반응의 미세한 차이 또한 신장 손상 정도의 불균질성에 기여했을 수 있습니다. 따라서 큰 표준 편차는 측정 오차가 아니라 본 실험 모델 내의 상당한 생물학적 변동성의 증거로 해석되어야 합니다. 그럼에도 불구하고, 각 그룹의 동물 수가 적다는 점을 고려할 때, 분포 특성과 처리 관련 차이의 크기는 신중하게 해석해야 합니다.

본 연구에서 혈청 요소, BUN 및 크레아티닌 수치는 NAC 처리군이 처리되지 않은 CI-AKI 군보다 수치상으로 낮게 나타났으며, 이는 신기능 장애의 완화 가능성과 일치하는 양상입니다. NAC는 CI-AKI와 관련하여 광범위하게 연구되어 왔으나, 신기능에 미치는 영향에 대한 보고는 연구마다 차이가 있었습니다14,15,16,17. 제안된 기전으로는 반응성 종의 제거, 글루타치온 합성 지원 및 신장 조직 내 산화적 손상의 제한 등이 있습니다1. 따라서 NAC 처리 후 관찰된 신기능 프로파일은 NAC의 항산화 특성과 관련이 있을 수 있으나, 본 연구에서 이 기전을 직접적으로 검증하지는 않았습니다.

본 연구에서 혈청 urea, BUN 및 creatinine 수치는 montelukast 투여군이 투여하지 않은 CI-AKI 군보다 수치상으로 낮게 나타났으며, 이는 신기능 장애가 완화되었을 가능성을 시사한다. CI-AKI 연구를 포함한 이전의 실험적 연구들에서도 montelukast 투여 후 혈청 creatinine 및 urea 수치가 낮아졌음이 유사하게 보고된 바 있다9,18,19. 병용 투여군 또한 투여하지 않은 CI-AKI 군보다 신기능 마커가 수치상으로 낮게 나타났다. 그러나 urea, BUN 및 creatinine은 병용 치료보다 montelukast 단독 요법에서 수치상으로 더 낮았으며, Duncan의 사후 검정 결과 이 두 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이는 없었다 (p > 0.05). 따라서 이러한 신기능 마커들에 대해 병용 요법이 montelukast 단독 요법보다 우월함을 입증하지 못했다.

산화적 손상은 CI-AKI 병태생리의 중요한 기여 요인으로 간주됩니다. 조영제 노출로 인해 유도된 수질 저산소증은 과도한 ROS 생성을 촉진하며, 이는 세포 지질과 미토콘드리아를 손상시키고, 세뇨관 상피 세포를 손상시키며, 염증 신호를 강화할 수 있습니다1,12,30.

처치를 하지 않은 CI-AKI 그룹은 가장 높은 MDA 농도와 함께 가장 낮은 SOD 및 CAT 활성, 그리고 가장 낮은 GSH 수준을 나타냈으며, 이는 조영제 노출 후 산화적 부하와 항산화 방어 기제 사이의 불균형을 시사한다. 증가된 MDA와 감소된 항산화 능력으로 특징지어지는 이와 유사한 양상이 다른 CI-AKI 실험 모델에서도 보고된 바 있다18,19. 이러한 결과는 산화적 스트레스가 단순히 이차적인 결과로 발생하는 것이 아니라, 신장 손상의 발생 및 진행에 기여한다는 점과 일치한다1,30.

처치를 하지 않은 CI-AKI 군과 비교하여, NAC 및 montelukast 처치 군은 전반적으로 더 낮은 MDA 수치와 더 높은 SOD, GSH 및 CAT 수치를 보였으며, 이는 산화적 손상의 완화와 일치하는 양상입니다. NAC의 제안된 항산화 작용에는 반응성 종의 중화 및 세포 내 glutathione 가용성 유지가 포함됩니다1,14. Montelukast 또한 cysteinyl leukotriene 수용체 차단 이상의 메커니즘을 통해 신장 조직 내 산화적 반응의 억제를 포함하여 신장의 산화적 손상을 제한할 수 있습니다18,33. CI-AKI 모델을 포함한 신장 손상에 대한 이전 연구들에서도 montelukast 처치 후 지질 과산화의 감소와 항산화 방어 체계의 개선이 유사하게 보고되었습니다9,19,27. 병용 투여 군에서도 유리한 산화 스트레스 파라미터가 관찰되었으나, 병용 처치가 단독 요법보다 일관되게 우수한 성능을 보이지는 않았습니다. 따라서 이러한 결과는 NAC와 montelukast를 함께 투여했을 때의 가산적 또는 시너지적 항산화 효과를 입증하지 않습니다.

KIM-1 및 cystatin C 분석 결과는 조영제 노출 후 신장 손상에 대한 상보적인 증거를 제공했습니다. KIM-1은 주로 세뇨관 상피 세포 손상과 관련이 있는 반면, cystatin C는 신장 여과 및 손상과 관련된 변화의 지표로 사용되며, 두 가지 모두 실험적 CI-AKI 모델에서 조기 바이오마커로 평가되었습니다1,10. 처치를 하지 않은 CI-AKI 군에서는 두 바이오마커 모두 가장 높은 수치를 보였으며, 이는 기존 신장 기능 매개변수의 현저한 악화와 함께 나타났습니다. 이러한 패턴은 조영제 유발 신장 손상 후 KIM-1 및 cystatin C 수치의 상승을 보고한 이전의 실험 연구들과 일치합니다1,10.

처리되지 않은 CI-AKI 군과 비교했을 때, 치료군에서는 KIM-1 및 cystatin C 수치가 더 낮게 나타났으며, 이는 신장 손상의 완화와 일치하는 양상입니다. 이러한 바이오마커 프로필은 치료 후 관찰된 혈청 urea 및 creatinine 농도가 수치상으로 더 낮아진 것과 평행한 결과를 보였습니다. 이전의 실험적 연구들에서는 montelukast 투여가 CI-AKI 및 기타 신장 손상 모델에서 KIM-1 발현 감소, 세뇨관 손상의 완화, 그리고 신장 기능 보존과 연관이 있음을 밝힌 바 있습니다9,18,19. NAC 또한 산화 스트레스 관련 세포 손상의 억제를 통해 잠재적으로 더 유리한 급성 신손상 바이오마커 프로필과 연관되어 왔습니다14,15,16,17. 그러나 병용 치료군과 montelukast 단독 치료군 사이에서 KIM-1 또는 cystatin C의 통계적으로 유의미한 차이는 검출되지 않았습니다 (p > 0.05). 따라서 본 연구 결과는 병용 치료에 의한 추가적인 바이오마커 이점이 있음을 입증하지 않습니다.

CI-AKI 과정에서 산화적 반응과 염증 반응은 서로를 강화할 수 있습니다. 과잉 생성된 ROS는 전염증성 신호 전달을 자극할 수 있으며, 이에 따른 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 증가는 신장 조직 손상을 잠재적으로 증폭시킬 수 있습니다1,12,13,30.

처치를 하지 않은 CI-AKI 군에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 농도가 가장 높게 나타났으며, 이는 조영제 노출 후 염증 반응이 존재함을 뒷받침합니다. 실험적 CI-AKI 모델에서 이러한 사이토카인의 증가는 세뇨관 손상, 염증 세포 침윤 및 신기능 저하와 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다10,12,13. 본 연구에서 관찰된 염증성 사이토카인 프로필은 조영제 투여 후 보고된 이전의 실험적 결과들과 일치합니다1.

NAC 및 montelukast 처리군은 처리되지 않은 CI-AKI 군보다 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 수치가 낮게 나타났으며, 이는 염증 반응의 감쇄와 부합하는 양상입니다. NAC에서 제안된 항염증 활성은 부분적으로 산화적 부담의 감소와 그로 인한 전염증성 사이토카인 생성의 제한에서 기인할 수 있습니다1,14,15,16,17. Montelukast는 시스테이니릴 류코트리엔 수용체 차단뿐만 아니라 다른 염증성 신호 전달 과정의 조절을 통해 사이토카인 발현에 영향을 줄 수 있습니다18,33. 실험적 신손상 연구에서도 montelukast 처리가 NF-κB 관련 신호 전달 및 전염증 활성의 감소와 연관이 있음이 밝혀졌습니다9,19,27. 따라서 본 연구에서 관찰된 사이토카인 프로필은 NF-κB 및 NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) 인플라마좀과 같은 경로가 관여하는 염증 과정의 조절과 부합합니다. 그러나 NF-κB, NLRP3 및 NOX4를 직접 측정하지 않았으므로, 바이오마커 결과는 간접적인 지지 증거만을 제공하며 경로 특이적 활성화 또는 억제를 확증할 수는 없습니다.

염증성 사이토카인 수치는 비처치 CI-AKI 군보다 병용 치료 군에서 더 낮게 나타났으나, 병용 치료가 몬테루카스트 단독 처리보다 일관되게 낮은 수치를 생성하지는 않았다. TNF-α, IL-1β 또는 IL-6에 대해 CI-AKI + 몬테루카스트 군과 CI-AKI + 몬테루카스트 + NAC 군 사이에 통계적으로 유의미한 차이는 검출되지 않았다 (p > 0.05). 따라서 본 결과는 몬테루카스트에 NAC를 추가하는 것이 추가적인 항염증 효과를 제공한다는 근거를 제시하지 않는다.

조직병리학적 평가 결과, 조영제 투여가 상당한 구조적 신장 손상을 유발했음이 추가로 입증되었습니다. CI-AKI 군에서 관찰된 세뇨관 괴사, 세뇨관 확장, 세포 변성 및 혈관 울혈 소견은 CI-AKI의 전형적인 조직병리학적 특징이며, 이는 신장 관류 장애, 산화 스트레스 및 세뇨관 세포 손상과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다1,12,18,19. 이러한 조직병리학적 변화는 생화학적 결과와 더불어 조영제 투여가 심각한 신장 조직 손상을 초래했음을 확인시켜 줍니다. 몬테루카스트 및 NAC 투여군에서 조직병리학적 손상 정도가 더 낮게 관찰된 것은 이들 약제가 신장 조직에 보호 효과를 나타낼 수 있음을 시사합니다. 특히, 병용 요법 군은 치료군들 중 수치상으로 가장 낮은 조직병리학적 손상 점수를 보였습니다. 또한, Masson’s trichrome 염색 절편의 정성적 평가 결과, 치료군들은 치료를 받지 않은 CI-AKI 군에 비해 간질 콜라겐 침착이 덜 뚜렷하며 세뇨관-간질 구조가 더 잘 보존되어 있음을 보여주었습니다. 급성 관찰 기간과 Masson’s trichrome 평가의 정성적 성격을 고려할 때, 이러한 결과는 장기적인 세포외 기질 재구성의 변화보다는 조사 시점에서의 구조적 보존 상태가 더 양호했다는 증거로 해석되어야 합니다.

반정량적 조직병리학적 평가는 정성적 관찰 결과와 일치하였으며, 치료를 받지 않은 CI-AKI 군에 비해 모든 치료군의 손상 점수가 더 낮게 나타났습니다. 병용 투여군에서 수치상으로 가장 낮은 조직병리학적 손상 점수가 나타났으나, 이러한 결과가 생화학적 결과 전반에 걸친 일관된 우위로 이어지지는 않았습니다. 따라서 병용 치료에서 관찰된 유리한 조직병리학적 소견을 본 연구 설계에 기반하여 가산적 또는 시너지 효과의 증거로 해석해서는 안 됩니다. 이와 유사하게, CI-AKI 및 다른 형태의 급성 신손상 실험 모델에 관한 이전 연구들에서도 산화 스트레스와 염증의 억제가 조직병리학적 손상을 감소시키고 세뇨관의 무결성 유지에 기여한다고 보고된 바 있습니다9,18,19,27.

생화학적 결과와 조직병리학적 소견 사이에 분명한 차이가 관찰되었습니다. 여러 생화학적 변수들이 수치상으로는 병용 투여군보다 몬테루카스트 단독 요법군에서 더 유리하게 나타났으나, 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았습니다. 반면, 조직병리학적 손상 점수는 병용 투여군에서 수치상 가장 낮게 나타났습니다. 이러한 부분적인 해리는 두 가지 평가 방식이 포착하는 생물학적 과정과 시간적 프로파일의 차이를 반영하는 것일 수 있습니다. 조직병리학적 검사는 신장 조직 내의 국소적인 세포 및 구조적 손상을 직접적으로 평가하므로, 혈청 신기능 마커 및 기타 생화학적 측정값이 동일한 정도로 개선되지 않았더라도 검사 시점에서의 조직 수준 보존 상태를 나타낼 수 있습니다. 이와 대조적으로, 생화학적 결과는 간접적인 기능적 또는 분자적 판독값을 제공하며, 이는 신장의 기능적 예비능, 보상 기전, 개체 간 생물학적 변이 및 샘플 수집 시점에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 모든 종말점이 단일 최종 시점에서 평가되었기 때문에, 구조적 보존과 생화학적 회복이 동기화되지 않았을 가능성이 있습니다. 따라서 병용 투여군에서 나타난 더 유리한 조직병리학적 외형은 전반적인 효능의 우월성에 대한 증거라기보다 평가 방식 간의 차이로 해석되어야 합니다. 그럼에도 불구하고, 관찰자 편향을 최소화하기 위해 눈가림 조건 하에 조직병리학적 평가가 수행되었으나, 모든 조직 절편이 단일 병리학자에 의해 평가되어 관찰자 간 변이 평가가 이루어지지 않았습니다. 향후 다수의 독립적인 평가자를 포함하는 연구를 통해 조직병리학적 소견의 신뢰성과 재현성을 더욱 높일 수 있을 것입니다.

이 모델의 재현 가능한 적용은 여러 절차적 단계의 일관된 수행에 달려 있습니다. 수분 제한 기간, L-NAME, indomethacin 및 iohexol 투여 사이의 미리 정의된 간격, 그리고 iohexol의 느린 정맥 내 투여는 동물 전반에 걸쳐 표준화되어야 합니다. 꼬리 정맥 외혈은 유효 조영제 용량을 감소시키고 신손상 중증도의 변동성을 증가시킬 수 있으므로, 투여 전 과정 동안 주사 부위를 주의 깊게 모니터링해야 합니다. 주사 중 누출, 외혈 또는 상당한 저항이 발생하는 경우, 해당 결과를 해석할 때 조영제 투여가 불완전했을 가능성을 고려해야 합니다. 투여 용량의 일관성은 경구 투여 중의 역류나 montelukast 제제의 불충분한 재현탁에 의해 영향을 받을 수도 있습니다. 모든 동물에 동일한 표준 절차를 적용하고, 가능한 경우 동일한 연구자가 투여를 담당하게 함으로써 피할 수 있는 절차적 변동성을 줄일 수 있습니다.

이 프로토콜을 통해 비교적 짧은 실험 기간 내에 CI-AKI를 유도할 수 있으며, 동일한 동물 모델에서 생화학적 및 조직병리학적 결과를 분석할 수 있습니다1,2,9.

본 연구의 강점은 보완적인 기능적, 생화학적, 염증성 및 조직병리학적 결과물을 사용하여 신장 손상을 특성화했다는 점입니다. 신장 기능 지표를 산화 스트레스 파라미터, 염증성 사이토카인, KIM-1, cystatin C 및 신장 조직 형태와 함께 평가함으로써 CI-AKI의 여러 구성 요소를 동일한 실험 내에서 검토할 수 있었습니다. KIM-1과 cystatin C를 포함함으로써 기존의 혈청 크레아티닌 측정 범위를 넘어 평가 범위를 넓혔습니다. montelukast와 NAC를 각각 단독으로 또는 함께 테스트하여 치료 전략을 직접 비교할 수 있었으나, 평가된 결과 전반에서 병용 요법이 단독 요법보다 일관되게 우월하다는 결과는 나타나지 않았습니다. 또한, 조영제 노출에만 기반한 유도 방식과 달리, 본 모델은 신혈관 수축과 수질 저산소증을 통합하여 치료와 관련된 생물학적 변화를 평가할 수 있는 뚜렷한 신장 손상 환경을 조성하였습니다.

조영제 노출과 치료 시작 사이의 1 h 간격은 본 실험 프로토콜에서 검토된 유일한 시점이며, 이를 임상적으로 검증된 치료 가능 시간대로 해석해서는 안 됩니다. 알려진 조영제 노출 직후의 치료가 향후 중개 연구에 유효할 수 있으나, 본 동물 연구만으로는 임상 환경에서의 실현 가능성이나 효능을 결정할 수 없습니다. 특히 최적의 시작 시간, 용량, 투여 경로, 치료 기간 및 환자군은 아직 알려지지 않았습니다. 조영제 투여 후 NAC 또는 montelukast 투여를 임상적으로 고려하기 전에, 전용 중개 연구 및 임상 연구를 통해 이러한 요인들이 반드시 조사되어야 합니다.

본 연구의 몇 가지 한계점을 인정해야 합니다. 연구 결과는 전임상 동물 모델에서 얻은 것이므로 임상 실무에 직접적으로 일반화할 수 없습니다. 본 프로토콜은 수분 제한과 산화질소 및 프로스타글란딘 경로 억제를 결합했기 때문에, 결과적으로 발생한 신장 손상이 환자에게서 일반적으로 나타나는 조영제 노출 후 손상보다 더 심각했을 수 있습니다. 따라서 결과는 이러한 민감화된 실험 환경의 맥락 내에서 해석되어야 합니다. 이 모델은 후보 신장 보호 치료제에 대한 생물학적 반응을 통제된 상태에서 평가할 수 있게 해주지만, 임상적 CI-AKI의 전체적인 이질성이나 중증도 범위를 그대로 재현하지는 않습니다. 따라서 본 연구에서 관찰된 치료 관련 변화는 위험 프로필이 더 낮거나 다양한 환자들에게서는 다르게 나타날 수 있습니다. 이러한 효과의 크기나 임상적 관련성을 결정하기 전에는, 일반적인 임상 상황에 더 근접한 덜 집중적인 모델에서의 재현과 적절하게 설계된 임상 연구가 필요합니다. 추가적인 한계점은 수컷 쥐만 연구에 포함되었다는 점입니다. 따라서 CI-AKI에 대한 감수성과 NAC 및 montelukast에 대한 반응의 잠재적인 성별 차이가 평가되지 않았으며, 본 결과를 암컷 동물에게 일반화해서는 안 됩니다. 성별이 신장 손상의 중증도나 치료 반응에 영향을 미치는지 확인하기 위해 양쪽 성별을 모두 포함하는 향후 연구가 필요합니다.

또 다른 한계점은 프로토콜 관련 핸들링, 구속, 수분 제한, 주사, 경구 투여 및 용매 투여에 대해 실험군과 일치하는 절차적 가짜(sham) 그룹이 없었다는 점입니다. 대조군은 이러한 절차를 거치지 않았기 때문에, 구속, 반복적인 핸들링, 주사, 경구 투여 및 용매 노출과 관련된 불균등한 절차적 스트레스와 비특이적 효과가 대조군과 실험군 사이에 관찰된 일부 차이의 잠재적 요인일 가능성을 완전히 배제할 수 없습니다. 향후 연구에서 적절하게 매칭된 절차적 가짜 그룹과 용매 대조군을 포함한다면, 이러한 비특이적인 절차 관련 효과와 CI-AKI 유도 및 치료에 구체적으로 기인한 효과를 구분하는 데 도움이 될 것입니다.

사전에 설정된 표본 크기는 5개의 실험군 전체에 걸쳐 가정된 큰 종합 효과를 검출하기 위해 80%의 검정력을 제공하도록 계산되었으나, 본 연구는 단일 요법 군과 병용 치료 군 간의 더 작은 쌍별 차이를 검출하기 위해 특별히 설계된 검정력을 갖추지는 않았습니다. 따라서 본 연구는 이러한 치료제 간의 차이를 검출하는 데 제한적인 검정력을 가졌을 수 있으며, 통계적으로 유의하지 않은 수치적 경향을 동등성의 증거로 해석해서는 안 됩니다. 이러한 경향이 재현 가능한 치료 차이를 나타내는지 결정하기 위해서는 더 큰 표본 크기를 가진 연구가 필요할 것입니다.

각 약물을 단일 용량으로만 평가했기 때문에, 본 연구에서는 NAC–montelukast의 최적 용량 조합을 결정하거나, 용량 의존적인 시너지 또는 길항 작용을 규명하거나, 병용 투여 시 관찰된 효과에 대한 각 약물의 상대적 기여도를 정량화할 수 없었습니다. 따라서 특정 결과에 대해 어느 한 약물이 더 강하게 기여했을 가능성이 있으나, 현재의 연구 설계로는 이를 확립할 수 없습니다. 용량-반응 관계를 규명하고 최적의 병용 요법을 식별하기 위해서는 다양한 용량 수준과 공식적인 약물 상호작용 분석을 포함하는 향후 연구가 필요할 것입니다.

본 연구에서는 산화적 스트레스와 염증의 생화학적 지표를 평가하였으나, 이와 관련된 세포 내 신호 전달 경로를 직접적으로 조사하지는 않았다. 따라서 관찰된 바이오마커 프로파일만으로는 NF-κB, NLRP3 또는 NOX4 관련 신호 전달이 처리에 의해 활성화되었는지 또는 억제되었는지를 입증할 수 없다. montelukast와 NAC의 신장 효과에 이러한 경로들이 어떻게 기여하는지 결정하기 위해서는 Western blotting 및 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 포함한 분자 생물학적 접근법을 이용한 향후 연구가 필요하다.

평가가 급성기에 국한되었기 때문에, 본 연구는 이후의 신장 회복이나 장기적인 조직 재형성에 관한 정보를 제공하지 않습니다. 따라서 분석 시점에 치료군에서 관찰된 상대적으로 제한적인 콜라겐 침착은 만성 신섬유화가 예방되었다는 증거라기보다는 초기 구조적 소견으로 간주되어야 합니다. 이 결과는 대신 초기 신장 손상의 완화를 반영하는 것일 수 있습니다. 이러한 초기 변화가 지속되는지, 그리고 장기적인 신장 기능이나 조직 재형성에 영향을 미치는지 확인하기 위해서는 더 늦은 시점의 평가를 포함하는 종단적 연구가 필요합니다.

전반적으로, montelukast와 NAC를 단독 또는 병용하여 조영제 투여 후 처리한 결과, 본 실험적 CI-AKI 모델에서 신장 기능 장애, 산화 스트레스, 염증 반응 및 조직병리학적 손상이 완화되는 것과 연관이 있었습니다. 하지만, 병용 요법이 평가된 모든 결과 지표에서 단독 요법보다 일관되게 우월함을 입증하지는 않았습니다. 이러한 발견은 현재의 전임상 모델에 국한되며, 임상 적용으로의 직접적인 외삽보다는 추가적인 실험적 연구의 필요성을 뒷받침합니다.

결론적으로, 이 실험적 CI-AKI 모델에서 조영제 투여 후 montelukast, NAC 또는 이들의 병용 치료를 실시했을 때 보다 양호한 생화학적 및 조직병리학적 결과가 나타났습니다. 그러나 병용 요법이 평가된 모든 결과 항목에서 단독 요법보다 일관되게 우월한 성능을 보이지는 않았습니다. 이러한 관찰 결과는 전임상 동물 연구를 통해 얻어진 것이므로, 임상적 효능이나 적용 가능성의 증거가 아니라 추가적인 실험적 검증을 위한 기초 자료로 간주되어야 합니다. 이러한 조영제 후 치료 접근법이 임상적 CI-AKI에 미치는 잠재적 관련성을 결정하기 위해 추가 연구가 필요합니다.

공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없음을 밝힙니다. 본 원고를 준비하는 동안, AI 지원 도구는 오직 언어 교정 및 문법 수정 용도로만 사용되었습니다. 데이터의 생성, 분석 또는 해석이나 도표, 표 또는 그래픽 요소의 제작에는 어떠한 인공지능 도구도 사용되지 않았습니다. 저자들은 원고의 내용에 대해 모든 책임을 집니다.

저자 기여도:

YS, CS, OK는 연구의 개념 설정 및 설계에 기여하였습니다. YS는 실험 절차 수행 및 데이터 수집을 담당하였습니다. OK는 조직병리학적 검사를 수행하였습니다. YS와 CS는 통계 분석을 수행하고 데이터를 해석하였습니다. YS가 원고를 작성하였습니다. 모든 저자는 원고를 비판적으로 검토하고 최종본을 승인하였습니다.

감사의 글

본 연구는 Kırşehir Ahi Evran 대학교의 과학 연구 프로젝트 조정 부서(프로젝트 번호: TIP.A3.26.006)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
 자동 스트립 워셔Bio-Tek Instruments, USAELx50자동화된 ELISA 플레이트 세척.
 마이크로플레이트 리더Bio-Tek Instruments, USAELx800ELISA 흡광도 측정.
RRID:SCR_028651
10% 중성 완충 포르말린Merck기록 없음조직병리학적 검사를 위한 조직 고정.
벤치톱 원심분리기NüveNF048시료 준비 및 원심분리.
카복시메틸셀룰로오스(CMC)Sigma-Aldrich, USAC5678몬텔루카스트 현탁액의 용매로 사용.
CAT 키트 유니버설Otto ScientificOtto3051Mindray BS-400 화학분석기를 이용한 혈청 내 CAT 활성의 비색법적 측정.
디지털 균질기Daihan ScientificHG-15D조직 균질화.
에오신 Y(황색)Merck1.15935.0025HE 염색.
해리스 헤마톡실린 용액BSLABBS-002HE 염색.
인도메타신Sigma-Aldrich, USAI7378CI-AKI 유도에 사용.
요헥솔(Omnipaque 300)GE HealthCare기록 없음CI-AKI 유도를 위한 조영제로 사용.
케타민 염산염(Ketalar)Pfizer, USA기록 없음시료 채취 전 전신 마취용.
광학 현미경(Nikon Eclipse)NikonNi-U조직병리학적 검사 및 영상 촬영.
RRID:SCR_024835
L-NAME(Nω-nitro-L-arginine methyl ester)Sigma-Aldrich, USAN5751CI-AKI 유도에 사용.
매슨 트라이크롬 염색 키트MOSLAB, TürkiyeBKMTO001매슨 트라이크롬 염색.
Mindray 화학분석기MindrayBS-400생화학적 분석.
몬텔루카스트 나트륨Sigma-Aldrich, USASML0101경구 투여를 통해 치료제로 투여.
N-아세틸시스테인(ASIST 300 mg/2 mL)MAC figure-materials-1laç, Türkiye기록 없음복강 내 투여를 통해 치료제로 사용.
쥐 Cystatin C ELISA 키트BT Lab, ChinaE0145Ra신장 조직 상등액 내 cystatin C의 ELISA 측정.
쥐 IL-1β ELISA 키트BT Lab, ChinaE0119Ra신장 조직 상등액 내 IL-1β의 ELISA 측정.
쥐 IL-6 ELISA 키트BT Lab, ChinaE0135Ra신장 조직 상등액 내 IL-6의 ELISA 측정.
쥐 KIM-1 ELISA 키트BT Lab, ChinaE0549Ra신장 조직 상등액 내 KIM-1의 ELISA 측정.
쥐 TNF-α ELISA 키트BT Lab, ChinaE0764Ra신장 조직 상등액 내 TNF-α의 ELISA 측정.
스테인리스강 투여용 주사침(22 G 경구 투여 카뉼라)Instech Laboratories, USA기록 없음경구 투여.
표준 과립형 설치류 사료(Optima)Optima, Türkiye기록 없음로트 번호 58931. 영양 성분: 조단백 24%, 조섬유소 3.94%, 조지방 5.08%, 조회 8.8%, 라이신 1.44%, 메티오닌 0.61%, 칼슘 1.14%, 인 0.89%, 나트륨 0.28%.
유니버설 크레아티닌 키트Otto ScientificOttoBC139혈청 내 크레아티닌의 비색법적 측정.
유니버설 GSH 키트Otto ScientificOtto3053수정된 엘만법을 이용한 EDTA 항응고 혈액 내 GSH의 비색법적 측정.
유니버설 MDA 키트Otto ScientificOtto1001ELx800 마이크로플레이트 리더를 이용한 혈청 내 MDA의 비색법적 측정.
유니버설 SOD 키트Otto ScientificOtto3047Mindray BS-400 화학분석기를 이용한 혈청 내 SOD 활성의 비색법적 측정.
유니버설 요소 키트Otto ScientificOttoBC157혈청 내 요소 및 BUN의 비색법적 측정.
자일라진 염산염(Rompun)Bayer, Germany기록 없음시료 채취 전 전신 마취용.

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