연구 논문

양경캡슐(Yangjing Capsule)은 IncRNA NONMMUT031883.2의 상향 조절을 통해 QKI-5/p38 MAPK 경로를 억제함으로써 생쥐의 정자 형성 기능 장애를 완화한다.

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DOI:

10.3791/73166

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2026년 8월 28일

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1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

이 논문에서

요약

본 연구에서는 마우스의 cyclophosphamide 유도 정자 형성 기능 장애에 대한 양경캡슐(Yangjing Capsule)의 보호 효과를 평가하고, lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 신호 전달 경로의 관여 여부를 조사하였습니다.

초록

정자 형성 기능 장애는 남성 불임의 중요한 원인이며, cyclophosphamide (CP)는 비정상적인 정원세포 apoptosis를 유도하여 정자 형성을 손상시킬 수 있습니다. 양경환(Yangjing Capsule, YC)은 생식 기능을 개선하는 데 사용되어 왔으나, 그 기저의 분자적 기전은 여전히 불분명합니다. 본 연구에서는 CP로 유도된 정자 형성 기능 장애 마우스 모델과 GC-1 정원세포에서 YC의 보호 효과를 조사하였습니다. 정자 수와 운동성, 남성 가임력, 혈청 성호르몬 수치, 그리고 고환 및 부고환의 조직병리학적 변화를 평가하였습니다. GC-1 세포에서는 세포 생존율, lactate dehydrogenase 방출, apoptosis 및 apoptosis 관련 단백질을 분석하였습니다. lncRNA NONMMUT031883.2, Quaking-5 (QKI-5), 그리고 p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 신호 전달 체계를 조사하기 위해 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR), RNA pull-down 분석, 면역형광법 및 Western blotting을 사용하였습니다. YC는 CP 처리된 마우스에서 정자 질, 혈청 성호르몬 수치, 생식 기관 형태, 고환 조직병리학 및 가임력을 용량 의존적으로 개선하였습니다. GC-1 세포에서 YC는 세포 생존율을 높이고 세포 손상과 apoptosis를 감소시켰습니다. lncRNA NONMMUT031883.2는 QKI-5와 물리적으로 상호작용했으며, YC 처리는 lncRNA NONMMUT031883.2의 발현을 증가시키는 동시에 QKI-5의 발현과 p38 인산화를 감소시켰습니다. YC 처리는 GC-1 세포에서 lncRNA NONMMUT031883.2 녹다운(knockdown)으로 유도된 apoptosis를 억제한 반면, QKI-5 과발현은 YC의 anti-apoptotic 효과를 감소시켰습니다. 이러한 결과는 YC가 CP로 유도된 정자 형성 기능 장애를 완화하며, 그 보호 효과가 lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 경로의 조절을 통해 매개됨을 시사합니다.

서론

정자 형성 기능 장애는 남성 생식계에서 정자의 생성, 성숙 또는 기능의 이상으로 인해 발생하는 생식 능력 저하를 의미합니다. 이는 정자 수와 운동성의 감소 및 정자 기형률의 증가로 특징지어집니다1,2. 정자 형성 기능 장애의 병태생리는 복잡하며 유전적 요인, 자가면역 질환, 환경 독소, 화학요법으로 인한 손상 및 생식 기관 병변과 관련이 있습니다3-5. cyclophosphamide (CP)와 같은 화학요법 약물은 고환의 세정관을 직접적으로 손상시키고 정원세포의 세포사멸을 유도하여 남성 정자 형성 기능 장애의 원인이 될 수 있습니다6,7. 현재 임상적 중재법으로 호르몬 대체 요법, 항산화제 보충 및 보조 생식 기술이 사용되고 있습니다. 그러나 이러한 접근법들은 효능이 일정하지 않으며 상당한 부작용이 있습니다8,9,10. 따라서 안전하고 효과적인 중재법을 찾고 그 분자적 표적을 명확히 하는 것은 정자 형성 기능 장애 환자의 가임력 결과를 개선하는 데 있어 임상적으로 중요합니다.

중국 약재는 다중 표적 특성과 상대적으로 낮은 독성 덕분에 남성 생식 기능을 보호하고 정자 형성 장애를 치료하는 데 잠재력을 보여주었습니다11,12. 양경 캡슐(Yangjing Capsule, YC)은 Rehmannia glutinosa, Epimedium, 태반, Polygonatum sibiricum, Angelica sinensis 및 기타 중국 약재로 구성된 전통 중국 특허 약제입니다. 이는 신장과 정(essence)을 보하고, 혈액과 골수를 nourishing하며, 생식 기능을 조절하는 데 사용됩니다13. 이전 연구들에 따르면 YC는 수컷 동물의 성호르몬 수치를 조절하고, 정자의 질을 개선하며, 고환 조직 손상을 복구하고, 화학 약물로 유도된 생식 손상을 방지할 수 있음이 밝혀졌습니다14,15. 정조세포는 정자 형성의 기초가 되며, 비정상적인 정조세포의 세포사멸은 정자 형성 장애 발생의 핵심적인 사건입니다16. YC는 또한 정조세포의 생존력을 높이고, S기 세포 비율을 증가시키며, 세포사멸을 억제하는 것으로 보고되었습니다17. 그러나 CP로 유도된 정자 형성 장애에서 YC의 보호 효과와 구체적인 분자 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았습니다.

긴 비코딩 RNA(lncRNA)는 단백질 코딩 능력이 없는 200 뉴클레오타이드 이상의 RNA 분자입니다18. lncRNA는 염색체 침묵, 염색질 수정, 게놈 각인 및 전사 활성화를 포함한 메커니즘을 통해 유전자 발현을 조절할 수 있습니다19,20. RNA 결합 단백질인 Quaking-5 (QKI-5)는 하위 유전자의 선택적 스플라이싱을 조절함으로써 세포 증식 및 세포 사멸을 포함한 생리적 및 병리적 과정에 참여합니다21. p38 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 경로는 세포 사멸 조절에 관여하며 남성 생식 능력 및 고환 발달에서도 중요한 역할을 합니다22,23. 이전 연구에서는 간세포 암종 세포에서 QKI-5 과발현이 p38 MAPK 경로를 활성화한다는 것이 밝혀졌습니다24. 또한, lncRNA NONMMUT074098.2가 정원세포에서 QKI-5와 결합하는 것으로 나타났으며, QKI-5 넉다운은 p38 MAPK 경로를 억제하고 정원세포의 세포 사멸을 감소시켰습니다25. 본 연구에서는 CP 유도 정자 형성 장애 마우스 모델을 사용하여 YC가 lncRNA NONMMUT031883.2 발현과 QKI-5/p38 MAPK 신호 전달 축을 조절함으로써 비정상적인 정원세포 사멸을 줄이고 CP 유도 정자 형성 장애를 완화하는지 조사하였습니다 (Figure 1). 본 연구의 목적은 정자 형성에 대한 YC의 보호 효과에 내재된 분자적 메커니즘을 명확히 하고, 남성 생식 기능 보호에 있어 YC의 약리학적 역할에 대한 이해를 확장하는 것입니다.

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그림 1: 실험 설계의 모식도. 상단 패널은 GC-1 정원세포에서의 in vitro 실험을 요약한 것이다. lncRNA NONMMUT031883.2의 녹다운(knockdown)을 통해 세포 사멸 및 세포 손상을 유도한 후, QKI-5 녹다운을 통해 세포 사멸과 세포 손상에 미치는 영향을 평가하였다. 하단 패널은 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide, CP)로 유도된 생쥐의 정자 형성 기능 장애 모델에서의 in vivo 실험을 요약한 것이다. 생쥐에게 양경캡슐(Yangjing Capsule) 투여 및/또는 lncRNA NONMMUT031883.2 또는 QKI-5 중재를 실시하였다. 이후 가임력, 혈청 호르몬 수치, 고환 및 부고환 조직, 정자 현탁액, 정자 예비력, 정자 품질 및 고환 조직병리학적 손상을 평가하였다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

모든 동물 실험은 ARRIVE 가이드라인 및 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드라인에 따라 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 동남대학교(Southeast University) 동물윤리위원회의 심의 및 승인을 받았습니다(승인 번호 20230216022).

1. YC 함유 혈청의 준비
양경캡슐(YC; 캡슐당 0.5 g) 2개를 개봉하여 캡슐 내용물 0.8 g을 정량하였다. 최종 부피가 10 mL가 되도록 생리식염수를 첨가하고, 혼합물을 충분히 볼텍싱하여 80 mg/mL 현탁액을 준비하였다. 체중 22–25 g, 8주령의 무균(SPF) 수컷 BALB/c 마우스를 22 °C, 습도 55%–60%, 12시간 명/암 주기 조건에서 사육하며 먹이와 물을 ad libitum으로 제공하였다. 1주일간의 적응 기간 후, 마우스에 YC를 800 mg/kg 체중 용량으로, 10 mL/kg의 부피로 5일 연속 1일 1회 경구 투여하였다. 마지막 투여 2시간 후, 마우스를 1% 소듐 펜토바르비탈로 복강 마취하고 혈액 샘플을 수집하여 YC 함유 혈청을 준비하였다. 혈청을 56 °C에서 30분 동안 불활성화하고 0.22 µm 멤브레인으로 여과한 후, 사용 시까지 −80 °C에 보관하였다.

2. 세포 배양 및 형질전환
마우스 GC-1 정원세포는 1% penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM에서 배양되었다. 모든 배양물은 5% CO₂ (v/v) 환경의 37 °C에서 유지되었다.

LncRNA 특이적 짧은 헤어핀 RNA(sh-lncRNA), QKI-5 과발현 플라스미드(OE-QKI-5), QKI-5 소형 간섭 RNA(si-QKI-5) 및 그에 대응하는 음성 대조군(sh-NC, OE-NC 및 si-NC)을 합성하고 제작하였다. transfection 시약의 지침에 따라 GC-1 세포에 sh-lncRNA 또는 sh-NC, si-QKI-5 또는 si-NC, 또는 OE-QKI-5 또는 OE-NC를 transfection하였다. 48 h 동안 배양한 후, lncRNA NONMMUT031883.2 또는 QKI-5의 발현을 측정하여 transfection 효율을 평가하였다.

sh-lncRNA + si-QKI-5 + etoposide 군의 경우, GC-1 세포에 sh-lncRNA와 si-QKI-5를 형질전환시킨 후 100 µM etoposide를 12 h 동안 처리하였습니다26. 이후의 세포 생존력 분석을 위해, GC-1 세포를 5%, 10% 또는 20%의 YC 함유 혈청이 보충된 배지에서 배양하였으며, 이를 각각 저용량 YC(L-YC), 중용량 YC(M-YC) 및 고용량 YC(H-YC) 군으로 지정하였습니다. YC 함유 혈청의 농도(5%, 10%, 20% YC)는 사전 농도 구배 실험 결과에 따라 결정되었습니다. sh-lncRNA + H-YC + OE-NC 및 sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5 군의 경우, GC-1 세포에 sh-lncRNA와 OE-NC 또는 sh-lncRNA와 OE-QKI-5를 48 h 동안 형질전환시킨 후, 20% YC 함유 혈청에 24 h 동안 노출시켰습니다.

3. Cell Counting Kit-8 분석
GC-1 세포를 96-well plate에 5 × 103 cells/well 밀도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포가 부착된 후, 기존 배지를 YC가 함유된 혈청이 보충된 완전 배지 100 µL로 교체하고 세포를 6, 12 또는 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 well에 Cell Counting Kit-8 시약 10 µL를 첨가하고 37 °C 암조건에서 2시간 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4. 젖산탈수소효소 분석
sh-NC 또는 sh-lncRNA를 사용하여 48시간 동안 형질전환시킨 후, GC-1 세포 배양액을 수집하고 원심분리를 통해 상층액을 얻었다. 젖산탈수소효소 분석 키트 지침에 따라 상층액을 검출 작업 용액과 부드럽게 혼합하여 96-웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 25 °C의 암소에서 30분 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 세포 손상을 평가하기 위해 젖산탈수소효소 방출량을 계산하였다.

5. Calcein AM/propidium iodide 염색
sh-NC 또는 sh-lncRNA를 transfection한 지 48시간 후, Calcein AM/propidium iodide (PI) 염색을 통해 GC-1 세포의 생존율을 평가하였다. 세포를 12-well plate에 well당 5 × 104 cells로 분주하고 confluence가 60%–70%에 도달할 때까지 배양하였다. 세포를 phosphate-buffered saline으로 가볍게 헹군 후, 각 well에 Calcein AM/PI 염색액 500 µL를 첨가하였다. 세포를 37 °C 암소에서 30분 동안 배양한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 생존 세포와 사멸 세포의 수를 측정하고, 생존 세포의 비율을 계산하였다.

6. 유세포 분석
원심분리를 통해 GC-1 세포를 수집하고 인산염 완충 식염수로 부드럽게 세척하였다. 세포 펠렛을 500 µL의 결합 완충액에 5 × 105 cells/mL 밀도로 재부유시켰다. 이어서 Annexin V-APC와 PI를 각각 5 µL씩 첨가하고, 현탁액을 충분히 혼합한 후 25 °C의 암소에서 10분 동안 배양하였다. APC의 경우 633/660 nm, PI의 경우 488/630 nm의 여기/방출 파장을 사용하여 유세포 분석으로 세포 사멸을 분석하였다. 세포 사멸률은 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.

7. Caspase-3 활성 분석
지정된 처리를 마친 후, 약 1 × 106개의 GC-1 세포를 수집하고 세척한 뒤 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁하였다. 세포를 caspase-3 활성 분석 키트의 reagent II 100 µL와 혼합하고 얼음 위에서 15분 동안 용해시켰다. 원심분리 후, 용해물 상층액 50 µL를 수집하여 reagent I 40 µL 및 reagent III 10 µL와 혼합하였다. 혼합물을 37 °C에서 2시간 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 키트 설명서에 따라 caspase-3 활성을 평가하였다.

8. RNA 풀다운 분석
lncRNA NONMMUT031883.2의 센스 및 안티센스 가닥을 해당 서열에 따라 합성하고 비오틴으로 표지하였다. 세포를 면역침전 세포 용해 버퍼를 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 용해시킨 후, 원심분리를 통해 단백질이 포함된 상층액을 수집하였다. 스트렙타비딘 자기 비즈를 RNA 결합 버퍼로 3회 세척한 다음, 1% bovine serum albumin이 포함된 결합 버퍼에서 30분 동안 배양하였다.

전처리된 비드를 biotin 표지 프로브와 혼합하고 25 °C에서 30분 동안 배양하였다. 결합하지 않은 프로브는 자기 분리를 통해 제거하였다. 그 후 세포 용해물 상층액을 첨가하고, 혼합물을 4 °C에서 4시간 동안 배양하여 자기 비드-RNA-단백질 복합체를 형성하였다. 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하기 위해 자기 비드를 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 완충액을 자기 분리로 제거하고 2× SDS 샘플 로딩 버퍼를 첨가하였다. 샘플을 95 °C에서 10분 동안 가열한 후, 후속 Western blot 분석을 위해 자기 분리로 상층액을 수집하였다.

9. 정자 형성 기능 장애 마우스 모델의 구축
5일간의 적응 기간 후, 체중 22–25 g, 8주령의 특정 병원체 부재(SPF) 수컷 BALB/c 마우스에 정자 형성 기능 장애 모델을 구축하기 위해 cyclophosphamide (CP)를 50 mg/kg의 용량으로 7일 동안 매일 1회 복강 내 투여하였다14,27. 모델 구축이 성공적으로 완료된 마우스들을 난수표를 이용하여 CP군, 200 mg/kg YC군, 400 mg/kg YC군, 800 mg/kg YC군, 800 mg/kg YC + sh-NC군, 800 mg/kg YC + sh-lncRNA군으로 무작위 배정하였으며, 각 군당 6마리씩 배치하였다.

YC 투여군 쥐에게는 30일 동안 1일 1회 해당 용량의 YC를 경구 투여하였다13. 800 mg/kg YC + sh-NC 및 800 mg/kg YC + sh-lncRNA 군의 경우, 모델 구축이 성공적으로 완료된 후 2% isoflurane을 흡입시켜 쥐를 마취했다. 각 쥐의 발Withdrawal reflex(발 회피 반사)가 나타나지 않고 호흡수가 안정적인 것을 확인한 후, 수술 부위를 삭모하고 povidone-iodine으로 소독했다. 무균 상태에서 성기 앞쪽의 피부와 체벽을 통해 복측 정중 절개를 실시했다. 혈관 손상이 발생하지 않도록 주의하며 부고환 지방패드를 조심스럽게 조작하여 고환을 노출시켰다. 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 세정관을 시각화하고, 마이크로인젝션 바늘을 이용해 아데노바이러스 현탁액(1 × 1010 TU/mL) 1 µL를 천천히 주입했다28. 주입 후 바늘을 5분 동안 그대로 둔 다음 천천히 제거했으며, 멸균 면봉으로 지혈했다. 동일한 절차를 반대편 고환에도 수행했다. 이후 절개 부위를 봉합하고, 수술 후 쥐가 가온 패드 위에서 회복하도록 했다. 대조군 쥐에게는 매일 동일한 부피의 생리식염수를 경구 투여 및 주입했다.

10. 가임력 평가
약물 투여 완료 후, 각 그룹의 수컷 마우스를 암컷 BALB/c 마우스와 1:2 비율로 7일 동안 자유 교배시켰다. 암컷 마우스의 질 플러그(vaginal plug) 형성을 매일 모니터링하고 기록하였다. 성공적인 교배가 확인된 후 수컷 마우스를 제거하였으며, 암컷 마우스는 자연 분만 시까지 개별 사육하였다. 그룹당 9마리의 임신한 암컷 마우스를 확보하여 분석에 포함시켰다. 각 그룹의 수컷 가임력을 평가하기 위해 평균 산자 수를 기록하였다.

실험 기간이 종료된 후, 마우스에 pentobarbital sodium을 100 mg/kg의 용량으로 복강 내 투여하여 안락사시켰다. 이 안락사 방법은 Southeast University 동물윤리위원회의 승인을 받았다(승인 번호 20230216022). 고환과 부고환을 조심스럽게 분리하여 사진을 찍고 무게를 측정하였다. 고환 및 부고환 지수는 장기 무게/체중으로 계산하였다. 각 마우스에서 부고환 하나를 채취하여 조각낸 뒤, 미리 데워진 phosphate-buffered saline(37 °C) 1 mL에 넣고 20분 동안 배양하여 정자가 밖으로 헤엄쳐 나오게 하였다29. 정자 현탁액을 부드럽게 혼합한 후, 정자 현탁액 10 µL를 예열된 혈구 계수판에 떨어뜨렸다. 광학 현미경 200× 배율에서 정자 수를 수동으로 측정하였으며, 결과는 106/L로 표시하였다. 또한, 전체 정자 수 대비 전진성 운동성을 보이는 정자의 비율을 정자 운동성으로 계산하였다13.

11. 성호르몬 수치 측정
각 군의 마우스 안와정맥에서 혈액을 채취하여 25 °C에서 30분 동안 방치하였다. 3,000 × g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 수집하였다30. 혈청 내 testosterone, 황체형성호르몬(LH) 및 여포자극호르몬(FSH) 수치는 각각의 효소결합면역흡착분석법(ELISA) 키트를 사용하여 측정하였다.

12. RNA 안정성 분석
GC-1 세포를 96-well 배양 플레이트에 분주하고, si-QKI-5 또는 si-NC를 트랜스펙션한 후 48시간 동안 배양하였다. 그 후 5 µg/mL의 Actinomycin D를 첨가하고, 0, 3, 6, 9시간 후에 세포를 수집하였다. 총 RNA를 분리하였으며, 역전사 후 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 통해 lncRNA NONMMUT031883.2의 상대적 발현 수준을 측정하였다. 각 시간대별 상대적 RNA 수준은 0시간의 발현 수준을 100%로 하여 계산하였다.

13. 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응
GC-1 세포와 마우스 고환 조직을 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 후 총 RNA 분리를 위해 용해시켰다. AMV 역전사 효소를 이용한 역전사 반응을 통해 상보적 DNA(cDNA)를 생성하였다. 실시간 PCR 시스템과 정량적 PCR 키트를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 수행하였으며, 이때 상보적 DNA를 증폭 템플릿으로 사용하였다. lncRNA NONMMUT031883.2의 내부 표준 물질로는 U6를 사용하였고, GAPDH는 다음의 내부 표준 물질로 사용하였다. QKI-5의 내부 대조군. 상대적 표적 유전자 발현량은 2^-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산되었습니다.−ΔΔ임계 사이클(Ct) 방법25lncRNA NONMMUT031883.2의 세포 내 국소화를 결정하기 위해 세포질 및 핵 분획으로부터 RNA를 각각 별도로 분리하였다. 프라이머 서열은 다음에서 제공된다. 표 1.

유전자정방향 프라이머 (5'에서 3' 방향)역방향 프라이머 (5'에서 3' 방향)
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

표 1: 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 사용된 프라이머 서열. lncRNA NONMMUT0318883.2, QKI-5, U6 및 GAPDH의 정방향 및 역방향 프라이머 서열이 5′–3′ 방향으로 나열되어 있습니다.

14. 헤마톡실린 및 에오신 염색
마우스 고환 및 부고환 조직을 4% 파라포름알데히드에 담가 4 °C에서 24시간 동안 고정하였다. 인산완충생리식염수로 세척한 후, 조직을 단계별 에탄올 시리즈로 탈수하고 파라핀에 매립하여 5 µm 두께로 절편화하였다. 절편을 60 °C에서 60분 동안 가열하고 자일렌에서 30분 동안 탈파라핀 처리하였다.

단계별 에탄올 시리즈를 통한 수화 과정 후, 절편을 헤마톡실린으로 5분 동안 염색하고, 염산-에탄올 분별 용액으로 10초간 처리한 뒤, 청색화(bluing)를 위해 수돗물로 세척하였으며, 1% 에오신으로 2분 동안 염색하였다. 그 후 절편을 95% 에탄올과 절대 에탄올에서 탈수하고 자일렌에서 30분 동안 투명화하였다. 공기 건조 후, 절편을 중성 검(neutral gum)으로 봉입하였다. 현미경 하에서 정소와 부고환의 형태학적 변화를 관찰하였다.

15. 면역형광염색
마우스 고환 파라핀 절편을 단계별 에탄올 시리즈로 탈파라핀 및 함수화한 후, pH 6.0의 시트르산 완충액에서 마이크로파를 이용한 항원 회복 과정을 거쳤다. 실온에서 자연 냉각시킨 후, 절편을 0.3% Triton X-100에서 10분 동안 배양했다. 절편을 5% 소혈청 알부민으로 25 °C에서 60분 동안 블로킹하고, 인산완충식염수로 세척한 뒤, Ki67에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 배양했다. 다음 날, 형광물질이 표지된 2차 면역글로불린 G 항체를 처리하고, 절편을 37 °C의 암소에서 60분 동안 배양했다. 인산완충식염수로 세척한 후, 절편을 DAPI로 10분 동안 대조염색하고 형광현미경으로 관찰했다. 형광 강도는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석했다.

GC-1 세포의 면역형광 염색을 위해, 세포를 12-well 플레이트에 1 × 105 cells/well 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 4% paraformaldehyde로 30분 동안 고정하고, 0.3% Triton X-100으로 10분 동안 투과화시킨 후, 5% bovine serum albumin으로 블로킹하였으며, QKI-5에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이후의 나머지 과정은 고환 조직 절편에 대해 설명된 방식과 동일하게 수행하였다.

16. TUNEL 염색
마우스 고환 파라핀 절편을 탈파라핀화하고, 단계별 에탄올 시리즈를 통해 함수시킨 후, 세포막 투과성을 높이기 위해 0.1% Triton X-100으로 5분간 처리하였다. DNase가 포함되지 않은 20 µg/mL의 Proteinase K 작동 용액을 절편에 균일하게 도포한 다음, 37 °C에서 15분간 배양하였다. TUNEL 검출 용액을 첨가하고, 절편을 암소의 37 °C에서 90분간 배양하였다. DAPI로 10분간 배양한 후, 항퇴색 마운팅 매질을 도포하고 형광 현미경으로 고환 조직을 관찰하였다.

GC-1 세포를 12-well 플레이트에 분주하고 4% paraformaldehyde로 30분 동안 고정하였습니다. 0.1% Triton X-100으로 5분 동안 투과화시킨 후, TUNEL 검출 용액을 세포에 처리하고 60분 동안 암실에서 배양하였습니다. 그 다음 DAPI로 세포를 10분 동안 염색한 후 형광 현미경으로 관찰하였습니다.

17. 웨스턴 블로팅(Western blotting)
마우스 고환 조직과 GC-1 세포를 면역침전 세포 용해 완충액에 넣고 얼음 위에서 30분 동안 용해시킨 후 초음파 분쇄기로 파쇄하였다. 원심분리 후 단백질이 포함된 상층액을 수집하였으며, bicinchoninic acid 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 상층액을 SDS 로딩 버퍼와 혼합하여 끓는 물에서 10분 동안 가열하였다. 젤 전기영동으로 분리한 후, 단백질을 polyvinylidene fluoride 막으로 전이시키고 5% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 2시간 동안 블로킹하였다31.

멤브레인을 cleaved caspase-3 (1:500), Bcl-2 (1:1000), caspase-3 (1:2000), Bax (1:500), QKI-5 (1:1000), phosphorylated p38 (1:1000) 또는 p38 (1:500)에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날, 멤브레인을 Tween 20이 포함된 Tris-buffered saline으로 세척한 후, goat anti-rabbit immunoglobulin G (1:10000)와 함께 25 °C에서 2 h 동안 배양하였다. 강화 화학발광 작동액을 멤브레인 표면에 도포하고, 젤 이미징 시스템을 사용하여 단백질 밴드를 촬영하였다. 밴드 강도는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였으며, 상대적 단백질 발현량은 GAPDH (1:3000)를 기준으로 표준화하였다.

단백질 합성을 억제하기 위해 50 µg/mL의 Cycloheximide를 사용하였다. QKI-5의 반감기를 측정하기 위해, 0, 3, 6, 9 h에서 세포를 수집한 후 Western blotting25을 통해 QKI-5 단백질 수준을 측정하였다.

18. 통계 분석
모든 데이터는 통계, 그래프 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 통계적으로 분석하고 도식화하였다. 데이터의 정규성을 평가하기 위해 Shapiro-Wilk 검정을 사용하였다. 실험 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 그룹 간의 차이를 평가하기 위해 일원 분산 분석(One-way analysis of variance)을 사용하였다. 분산이 동질한 경우에는 사후 쌍별 비교를 위해 LSD-t 검정을 사용하였으며, 분산이 불균일한 경우에는 Dunnett’s T3 검정을 사용하였다. p < 0.05 값을 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.

결과

lncRNA NONMMUT031883.2의 넉다운은 정원세포의 세포사멸을 유도한다
lncRNA NONMMUT031883.2의 발현을 넉다운시키기 위해 GC-1 세포에 sh-lncRNA를 트랜스펙션하였다. sh-NC를 트랜스펙션한 세포와 비교하여, sh-lncRNA 트랜스펙션 후 lncRNA NONMMUT031883.2의 전사 수준이 현저히 감소하여 넉다운이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다(그림 2A). lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운 후, GC-1 세포의 생존율이 유의하게 감소하였으며(그림 2B), LDH 방출은 유의하게 증가하여 세포 손상이 더 심해졌음을 나타냈다(그림 2C). Calcein-AM/PI 염색 결과, sh-lncRNA 군에서 PI 양성 GC-1 세포 수가 증가하고 생존 세포의 비율이 감소한 것으로 나타났다(그림 2D, E). lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운 이후 GC-1 세포의 세포사멸률이 현저히 증가하였다(그림 2F, G). sh-lncRNA 군에서 TUNEL 양성률 또한 유의하게 상승하여 세포사멸의 증가를 추가적으로 확인하였다(그림 2H, I). 또한, lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운은 GC-1 세포의 caspase-3 활성을 유의하게 증가시켰다(그림 2J). sh-lncRNA 군에서는 Bax 발현이 현저히 증가하고 Bcl-2 발현은 감소하였으며, cleaved caspase-3/caspase-3 비율이 유의하게 상승하였다(그림 2K, L). 이러한 결과들은 lncRNA NONMMUT031883.2의 넉다운이 GC-1 세포의 세포사멸을 유도함을 시사한다. 모든 정량 데이터는 n = 6으로 얻었다.

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그림 2lncRNA NONMMUT031883.2의 넉다운은 정원세포의 세포사멸을 유도한다. (A) GC-1 세포 내 lncRNA NONMMUT031883.2 발현의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석. (B) lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운 후 GC-1 세포 생존율에 대한 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 분석. (C) lncRNA NONMMUT031883.2 녹다운에 따른 GC-1 세포의 젖산탈수소효소(LDH) 방출. (D, E) GC-1 세포 생존율의 Calcein-AM/propidium iodide (PI) 염색 (20×; 스케일 바, 100 µm). (F, G) lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운 후 세포 사멸의 유세포 분석. (H, I) GC-1 세포의 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉-엔드 표지(TUNEL) 분석 (40×; 스케일 바, 50 µm). (J) lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운 후의 Caspase-3 활성. (K, L) sh-lncRNA 트랜스펙션 후 Bcl-2, Bax, caspase-3 및 cleaved caspase-3 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. 데이터는 평균값으로 표시됨 ± 표준 편차; n = 6. ***p < 0.001 대 sh-NC. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

LncRNA NONMMUT031883.2와 QKI-5의 상호작용
정원세포 아포토시스의 기저에 있는 분자적 메커니즘을 규명하기 위해 lncRNA NONMMUT031883.2와 QKI-5 간의 상호작용을 조사하였습니다. 핵 분획물과 세포질 분획물을 분리한 후, qRT-PCR 분석을 통해 lncRNA NONMMUT031883.2가 주로 GC-1 세포의 핵에 위치함을 확인하였습니다 (그림 3A). 면역형광 분석 결과 QKI-5 또한 핵에 집중되어 있어, lncRNA NONMMUT031883.2와 QKI-5 사이의 상호작용을 위한 공간적 근거가 마련되었습니다 (그림 3B). QKI-5가 lncRNA의 안정성을 조절하는지 평가하기 위해 actinomycin D 처리 후 lncRNA NONMMUT031883.2의 반감기를 측정하였습니다. QKI-5 넉다운은 lncRNA 전사체의 반감기에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다 (그림 3C). cycloheximide를 통해 단백질 합성을 억제한 후, lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운이 QKI-5 단백질 발현을 변화시키지 않음을 확인하였습니다 (그림 3D, E). 이어서 lncRNA NONMMUT031883.2를 타겟팅하는 biotin 표지 안티센스 프로브의 캡처 효율을 qRT-PCR로 평가하였습니다. 안티센스 프로브가 타겟 lncRNA를 효율적으로 농축시켰으므로, 이를 후속 RNA 풀다운 분석에 사용하였습니다 (그림 3F). RNA 풀다운 후 Western blotting을 수행한 결과, lncRNA NONMMUT031883.2와 QKI-5 사이에 특이적인 물리적 상호작용이 있음이 나타났습니다 (그림 3G, H). 이러한 결과는 lncRNA NONMMUT031883.2와 QKI-5가 GC-1 세포의 핵 내에 함께 위치하며 특이적으로 상호작용함을 시사합니다. 그림 3C 및 그림 3D, F의 정량 데이터는 n = 3으로 얻었으며, 나머지 정량 데이터는 n = 6으로 얻었습니다.

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그림 3: LncRNA NONMMUT031883.2와 QKI-5의 상호작용. (A) GC-1 세포 내 lncRNA NONMMUT031883.2의 핵 및 세포질 분포에 대한 qRT-PCR 분석. (B) GC-1 세포 내 QKI-5의 세포 내 위치에 대한 면역형광 분석 (40×; 스케일 바, 50 µm). (C) actinomycin D 처리 및 QKI-5 녹다운 후 lncRNA NONMMUT031883.2의 반감기에 대한 qRT-PCR 분석 (n = 3). (D, E) cycloheximide 처리 및 lncRNA NONMMUT031883.2 녹다운 후 QKI-5 단백질 발현에 대한 Western blot 분석 (n = 3). (F) lncRNA NONMMUT031883.2를 표적으로 하는 biotin 표지 antisense probe의 농축 효율에 대한 qRT-PCR 검증. (G, H) lncRNA NONMMUT031883.2와 QKI-5 간의 상호작용에 대한 RNA pull-down 및 Western blot 분석. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됨; n = 6. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

QKI-5 넉다운은 p38 MAPK 경로를 억제함으로써 정원세포의 세포사멸을 저해한다
정원세포의 세포사멸에서 QKI-5와 하위 p38 MAPK 경로의 역할을 조사하였다. si-QKI-5를 통한 형질전환 후, GC-1 세포에서 QKI-5 단백질 수준이 유의하게 감소하여 넉다운이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다(Figure 4A, B). LncRNA NONMMUT031883.2 넉다운은 p-p38/p38 비율을 유의하게 증가시킨 반면, QKI-5를 동시에 넉다운시키면 이 비율이 감소하여 p38 MAPK 경로의 활성화가 억제됨을 나타냈다(Figure 4C, D). QKI-5 넉다운은 lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운으로 인해 발생한 GC-1 세포의 손상을 완화시켰으나, 세포사멸 유도제인 etoposide 처리는 세포 생존율을 유의하게 감소시켰다(Figure 4E). QKI-5 넉다운은 GC-1 세포의 세포사멸률을 유의하게 낮춘 반면, etoposide 처리는 세포사멸을 현저히 증가시켰다(Figure 4F, G). si-QKI-5 형질전환 또한 caspase-3 활성을 유의하게 감소시켰으나, etoposide 처리는 caspase-3 활성을 증가시켰다(Figure 4H). QKI-5 넉다운은 Bax 발현을 감소시키고 Bcl-2 발현을 증가시켰으며 cleaved caspase-3/caspase-3 비율을 유의하게 낮춘 반면, etoposide 처리는 이러한 발현 양상을 반전시켰다(Figure 4I, J). 이러한 결과는 QKI-5 넉다운이 p38 MAPK 경로를 억제함으로써 GC-1 정원세포의 세포사멸을 억제한다는 것을 보여준다. 모든 정량 데이터는 n = 6으로 얻었다.

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그림 4: QKI-5 넉다운은 p38 MAPK 경로를 억제하여 정원세포의 세포사멸을 저해한다. (A, B) si-NC 또는 si-QKI-5를 트랜스펙션한 후 GC-1 세포에서의 QKI-5 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. (C, D) 인산화된 p38 (p-p38) 및 전체 p38 발현의 웨스턴 블롯 분석. (E) 서로 다른 처리군에서 GC-1 세포 생존율에 대한 CCK-8 분석. (F, G) etoposide 처리 후 세포사멸에 대한 유세포 분석. (H) 서로 다른 처리군에서의 Caspase-3 활성. (I, J) GC-1 세포에서 Bax, Bcl-2, caspase-3 및 cleaved caspase-3 발현의 웨스턴 블롯 분석. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시됨; n = 6. ***p < 0.001 대 si-NC 또는 sh-NC; ###p < 0.001 대 sh-lncRNA; &&&p < 0.001 대 sh-lncRNA + si-QKI-5. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

YC는 lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 경로를 통해 정원세포의 세포사멸을 억제한다
GC-1 세포를 YC 함유 혈청으로 6, 12, 24시간 동안 처리한 결과, YC 농도가 높아지고 노출 시간이 길어질수록 세포 생존능이 점진적으로 증가하였다. 따라서 이후 실험을 위해 해당 농도들을 선택하였으며, 처리 시간은 24시간으로 설정하였다(그림 5A). 24시간 동안 YC를 처리했을 때, GC-1 세포에서 lncRNA NONMMUT031883.2의 전사 수준이 현저히 증가하였으며(그림 5B), QKI-5와의 결합 능력이 향상되었다(그림 5C, D). YC 처리 후 GC-1 세포에서 QKI-5 발현과 p-p38/p38 비율이 눈에 띄게 감소하여 p38 MAPK 경로가 억제됨을 시사하였다(그림 5E, F). 또한 YC 처리는 세포사멸률을 현저히 감소시켰으며(그림 5G, H), caspase-3 활성을 낮추고(그림 5I), Bcl-2 발현을 증가시키고 Bax 발현 및 cleaved caspase-3/caspase-3 비율을 감소시켰다(그림 5J, K).

경로 특이성을 추가로 평가하기 위해, GC-1 세포에 OE-NC 또는 OE-QKI-5를 transfection하였습니다. OE-QKI-5가 transfection된 세포에서 QKI-5 단백질 발현이 유의하게 증가하여 과발현이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였습니다(그림 5L, M). lncRNA NONMMUT031883.2의 knockdown은 세포 생존력을 유의하게 감소시킨 반면, YC 처리는 이러한 효과를 역전시켰습니다. QKI-5 과발현은 YC의 세포 보호 효과를 약화시켰습니다(그림 5N). 또한 YC 처리는 lncRNA NONMMUT031883.2 knockdown으로 유도된 apoptosis를 감소시키고(그림 5O, P), caspase-3 활성을 낮추었으며(그림 5Q), Bax 발현을 감소시키고 Bcl-2 발현을 증가시켰으며, cleaved caspase-3/caspase-3 비율을 감소시켰습니다(그림 5R, S). 이와 대조적으로, QKI-5 과발현은 YC의 anti-apoptotic 효과를 약화시켰습니다. 이러한 결과는 YC가 lncRNA NONMMUT031883.2를 상향 조절하고 QKI-5와의 결합을 촉진함으로써 p38 MAPK 경로를 억제하고 GC-1 세포의 apoptosis를 억제한다는 것을 나타냅니다. 모든 정량 데이터는 n = 6으로 얻어졌습니다.

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그림 5YC는 정원세포의 세포사멸을 억제한다 ~을 통해 lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 경로. (A) 양경캡슐(Yangjing Capsule, YC) 함유 혈청에 6, 12, 24시간 동안 노출시킨 후 GC-1 세포 생존율에 대한 CCK-8 분석. (B) YC 처리 24시간 후 GC-1 세포 내 lncRNA NONMMUT031883.2 발현에 대한 qRT-PCR 분석. (C, D) YC 처리 후 lncRNA NONMMUT031883.2와 QKI-5의 결합에 대한 RNA 풀다운 분석. (E, F) YC 처리 후 QKI-5, p-p38 및 p38 발현의 웨스턴 블롯 분석. (G, H) YC 처리 후 GC-1 세포 세포사멸의 유세포 분석. (I) YC 처리 후 Caspase-3 활성. (J, K) YC 처리 후 Bcl-2, Bax, caspase-3 및 cleaved caspase-3 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. (L, M) OE-NC 또는 OE-QKI-5 형질전환 후 QKI-5 발현의 웨스턴 블롯 분석. (N) GC-1 세포 생존능력에 대한 CCK-8 분석. (O, P) QKI-5 과발현 후 GC-1 세포의 세포사멸에 대한 유세포 분석. (Q) QKI-5 과발현에 따른 Caspase-3 활성. (R, S) QKI-5 과발현 후 Bax, Bcl-2, caspase-3 및 cleaved caspase-3 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. 데이터는 평균값으로 표시됨 ± 표준 편차; n = 6. ***p < 대조군 대비 0.001; ###p < 0.001 대 sh-lncRNA; &&&p < 0.001 대 sh-lncRNA + H-YC + OE-NC. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

YC는 마우스의 CP 유도 정자 형성 기능 장애를 개선한다
정자 형성 기능 장애가 있는 마우스에서 YC의 보호 효과를 평가하였다. CP군의 마우스 고환과 부고환은 뚜렷한 위축, 부피 감소 및 탁한 외관을 보였다. 서로 다른 용량의 YC를 투여한 후, 생식 기관의 형태, 충만도 및 색상이 점진적으로 개선되었다(그림 6A). 고환과 부고환의 상대적 무게는 유의하게 증가했으며, 800 mg/kg YC 투여군에서 가장 큰 효과가 관찰되었다(그림 6B, C).

CP 군에서 정자 기형률이 유의하게 증가하였으며, 머리 왜곡, 꼬리 말림 및 구조적 손상을 포함한 이상이 빈번하게 관찰되었다. 정자 수와 운동성 또한 현저하게 감소하였다. YC 처리 후, 정자 형태가 개선되었으며(그림 6D), 정자 수가 증가하고(그림 6E), 정자 운동성이 유의하게 향상되었다(그림 6F). 교배 실험 결과, CP 군에서는 가임력과 산자수가 현저히 감소한 반면, YC 처리는 가임력을 개선시켰다(그림 6G). 혈청 테스토스테론, 여포 자극 호르몬 및 황체 형성 호르몬 수치 또한 CP 군에서 현저히 감소하였으며 YC 처리 후 증가하였다(그림 6H-J). 이러한 결과는 YC가 정자 형성 장애가 있는 마우스의 생식 기관 위축, 정자 품질, 가임력 및 성호르몬 분비를 개선함을 나타낸다. 그림 6G의 정량 데이터는 n = 9로 얻었으며, 나머지 정량 데이터는 n = 6으로 얻었다.

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그림 6: YC는 마우스의 CP 유도 정자 형성 기능 장애를 개선한다. (A-C) 대조군, cyclophosphamide (CP)군 및 YC 처리군의 생식 기관 형태 (A), 고환 지수 (B), 및 부고환 지수 (C). (D-F) 정자 형태 (D) (40×; 스케일 바, 50 µm), 정자 밀도 (E), 및 정자 운동성 (F). (G) 교배 실험(n = 9)을 통해 평가한 수컷 생식 능력. (H-J) 효소 결합 면역 흡착 분석 키트를 사용하여 측정한 혈청 follicle-stimulating hormone (FSH), testosterone 및 luteinizing hormone (LH) 수치. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됨; n = 6. ***p < 0.001 대조군 대비; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 CP 대비. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

YC는 정자 형성 장애가 있는 생쥐의 고환 조직병리학적 손상을 개선함
YC의 고환 조직 손상 회복 효과를 조직학적 염색을 통해 평가하였다. Hematoxylin and eosin 염색 결과, 대조군에서는 조직 구조가 온전하고 세포층이 뚜렷하며 세포 수가 적절하게 유지됨을 확인하였다. 반면, CP 군에서는 세정관의 현저한 위축과 구조적 무질서, 세포 수 감소 및 부고환 관강의 허탈이 관찰되었다. YC 처리 후에는 고환 및 부고환의 손상이 감소하고 세정관 구조가 점차 회복되었으며, 세포 배열이 더 정돈되고 그 수가 증가하였다(그림 7A, B).

고환 조직 내 TUNEL 양성 세포의 비율은 CP 군에서 유의하게 증가하였으며, YC 처리 후에는 유의하게 감소하였다(그림 7C, D). Bax 발현과 cleaved caspase-3/caspase-3 비율은 CP 군에서 현저히 증가한 반면, Bcl-2 발현은 감소하였다. YC 처리는 이러한 발현 패턴을 역전시켰다(그림 7E, F). 면역형광 분석 결과, Ki67 형광 강도는 CP 군에서 현저히 감소하였고 YC 처리 후에는 유의하게 증가하여, 정자 형성 세포의 증식이 회복되었음을 시사하였다(그림 7G, H). 이러한 결과는 YC가 CP로 유도된 고환 및 부고환의 조직병리학적 손상을 감소시키고, 과도한 세포 사멸을 억제하며, 정자 형성 세포의 증식을 촉진함을 나타낸다. 모든 정량 데이터는 n = 6으로 얻었다.

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그림 7: YC는 마우스 고환 조직의 CP 유도 조직병리학적 손상을 개선한다. (A, B) YC 처리 후 고환 (A) 및 부고환 (B) 의 Hematoxylin and eosin (HE) 염색 (20×; 스케일 바, 100 µm). (C, D) 마우스 고환 조직 내 세포 사멸의 TUNEL 분석 (40×; 스케일 바, 50 µm). (E, F) YC 처리 후 고환 조직에서 Bax, Bcl-2, caspase-3 및 cleaved caspase-3 발현의 Western blot 분석. (G, H) 마우스 고환 조직 내 Ki67 발현의 면역형광 분석 (40×; 스케일 바, 50 µm). 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시됨; n = 6. ***p < 0.001 대조군 대비; p < 0.001 CP 대비. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

YC는 마우스의 정자 형성 기능 장애 및 고환 병리적 손상을 개선한다 ~을 통해 lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 경로
YC의 효과에 있어 lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 경로의 관여 여부를 추가로 평가하였다. CP 군 생쥐의 고환 조직에서 lncRNA NONMMUT031883.2의 발현은 유의하게 감소한 반면, QKI-5의 발현과 p-p38/p38 비율은 현저히 증가하였다.그림 8A-DYC 처리 후, lncRNA NONMMUT031883.2의 발현은 증가한 반면, QKI-5의 발현과 p-p38/p38 비율은 감소하였다.

경로 특이성을 추가로 평가하기 위해, sh-lncRNA를 사용하여 마우스에서 lncRNA NONMMUT031883.2를 넉다운시켰다. lncRNA NONMMUT031883.2의 발현 수준이 유의하게 감소하여 넉다운이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다(Figure 8E). lncRNA NONMMUT031883.2를 넉다운시킨 후, 고환 조직 내 QKI-5 수준은 유의하게 변하지 않았으나, p-p38/p38 수준은 유의하게 증가하였다(Figure 8F, G). Sh-lncRNA 처리는 800 mg/kg YC의 효과를 약화시켜, 고환 조직 내 lncRNA NONMMUT031883.2의 발현을 감소시키고(Figure 8H) p-p38/p38 수준을 증가시켰다(Figure 8I, J). YC 처리는 CP 유도 후 정자 수와 운동성을 유의하게 증가시켰으나, lncRNA NONMMUT031883.2의 넉다운은 이러한 효과를 약화시켰다(Figure 8K, L). 또한 YC 처리는 CP 군에서 테스토스테론, 여포 자극 호르몬 및 황체 형성 호르몬 수준을 증가시켰으나, lncRNA 넉다운은 이러한 효과를 약화시켰다(Figure 8M-O).

Hematoxylin and eosin 염색 결과, YC는 세정관 위축 및 정자 형성 세포 배열의 무질서함을 포함하여 CP로 유도된 고환 손상을 개선하는 것으로 나타났습니다. LncRNA NONMMUT031883.2 녹다운은 이러한 보호 효과를 약화시켰습니다 (Figure 8P). YC 처리 후 Bax 발현과 cleaved caspase-3/caspase-3 비율은 감소한 반면, Bcl-2 발현은 증가했습니다. LncRNA NONMMUT031883.2 녹다운은 이러한 세포사멸 관련 단백질에 미치는 효과를 역전시켰습니다 (Figure 8Q, R). 이러한 결과는 YC가 lncRNA NONMMUT031883.2를 상향 조절하고 QKI-5를 하향 조절하며 p38 MAPK 경로를 억제함으로써, CP 유도 후 정자의 질을 개선하고 고환 조직 손상을 감소시킨다는 것을 나타냅니다. 모든 정량 데이터는 n = 6으로 얻었습니다.

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그림 8YC는 정자 형성을 개선하고 고환의 조직병리학적 손상을 감소시킨다 ~을 통해 lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 경로. (A) 마우스 고환 조직 내 lncRNA NONMMUT031883.2 발현의 qRT-PCR 분석. (B-D) YC 처리 후 마우스 정소 조직 내 QKI-5, p-p38 및 p38 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. (E) sh-lncRNA 투여 후 생쥐 고환 조직 내 lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운의 qRT-PCR 검증 (F, G) lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운 후 마우스 고환 조직 내 QKI-5 및 p-p38/p38 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석. (H) YC 처리 및 sh-lncRNA 투여 후 생쥐 고환 조직 내 lncRNA NONMMUT031883.2 발현의 qRT-PCR 분석. (I, J) 마우스 고환 조직 내 p-p38 및 p38 발현의 웨스턴 블롯 분석. (K, L) 정자 수 (K) 및 정자 운동성 (L) 각기 다른 처리군에서. (M-O) 효소 결합 면역 흡착 분석 키트를 사용하여 혈청 FSH, 테스토스테론 및 LH 수치를 측정하였다. (P) CP 처리 마우스의 고환 조직 HE 염색 (20×; 스케일 바, 100 µm). (Q, R) 마우스 고환 조직 내 Bcl-2, Bax, cleaved caspase-3 및 caspase-3 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. 데이터는 평균값으로 표시됨 ± 표준편차; n = 6. ***p < 대조군 대비 0.001; p < 0.001 대 CP; p < 0.001 versus 800 mg/kg YC + sh-NC. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

데이터 가용성:
본 연구의 결과를 뒷받침하는 원시 데이터는 보충 파일 1(Supplementary File 1)로 제공됩니다.

보충 파일 1: 원본 데이터. 이 Excel 파일에는 그림 2-8에 제시된 정량 분석의 기초가 되는 가공되지 않은 수치 데이터가 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

화학요법으로 유도된 후천적 정자 형성 기능 장애는 남성 불임의 중요한 원인입니다32,33,34. 그러나 구체적인 분자적 기제는 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 본 연구의 결과는 양정환(Yangjing Capsule, YC)이 사이클로포스파미드(cyclophosphamide, CP)로 유도된 수컷 생쥐의 성호르몬 이상, 고환 조직병리학적 손상 및 가임력 저하를 용량 의존적으로 개선한다는 것을 보여줍니다. 이러한 개선은 lncRNA NONMMUT031883.2의 상향 조절 및 QKI-5/p38 MAPK 경로의 억제와 관련이 있으며, 이는 YC가 이 축을 통해 작용하여 정원세포의 비정상적인 세포 사멸을 감소시킬 수 있음을 시사합니다.

CP의 생식 독성은 널리 입증되어 왔습니다. CP의 대사물질인 acrolein은 정소 조직에 축적되어 산화 스트레스, DNA 손상 및 기타 경로를 통해 생식세포의 apoptosis를 유도할 수 있습니다. 정자 형성의 초기 세포인 정조세포는 CP의 세포독성 효과에 특히 민감합니다35,36. Cao et al.은 CP 화학요법 후 무정자증 환자의 정소 조직에서 DNA 손상 체크포인트 신호 전달이 유의하게 증가한 반면, 정자 발달과 관련된 유전자는 유의하게 하향 조절되었으며 세정관의 구조적 무결성이 파괴되었음을 발견했습니다37. Bcl-2는 미토콘드리아 막의 무결성을 유지함으로써 기능하는 항-apoptosis 단백질입니다38. Bax는 pro-apoptosis 단백질로, Bax의 상향 조절은 미토콘드리아에서 세포질로의 cytochrome c 방출을 촉진하고, caspase 연쇄 반응을 활성화하여 apoptosis를 유도할 수 있습니다39,40. Saleh et al.은 생쥐에서 CP 노출이 Bcl-2 하향 조절 및 Bax 상향 조절을 동반하여 세정관 위축과 간질 부종을 일으키며, 최종적으로 정자 수와 운동성을 감소시킨다는 것을 입증했습니다41. 따라서 과도한 CP 유도 정조세포 apoptosis의 억제는 화학요법 후 생식 기능을 보호하기 위한 중요한 표적이 될 수 있습니다. 본 연구에서 YC 중재는 CP로 유도된 혈청 성호르몬 분비 이상을 용량 의존적으로 감소시켰으며, 세정관 손상을 복구하고 정자 운동성과 남성 가임력을 개선했습니다. 또한 YC는 정소 조직에서 Bcl-2 발현을 증가시키고 Bax 발현, cleaved caspase-3/caspase-3 비율 및 TUNEL 양성 세포 수를 감소시켰습니다. In vitro 실험에서 YC 함유 혈청은 GC-1 세포의 apoptosis를 현저히 감소시키고 세포 생존율을 증가시켜, 정조세포 apoptosis에 대한 억제 효과를 더욱 뒷받침하였습니다.

긴 비코딩 RNA(lncRNA)는 정자 형성 및 생식세포 세포사멸을 포함한 생리적 및 병리적 과정에서 중요한 조절 역할을 수행합니다42,43. 비정상적인 lncRNA 발현은 산화 스트레스 및 세포사멸 경로의 조절을 통해 고환의 정자 형성 기능을 손상시킬 수 있으며, 이는 남성 불임의 중요한 분자적 기전을 나타냅니다44. Wang et al.은 lncRNA DNM3OS가 miR-214-5p/E2F2 축을 조절하여 정조세포 활성을 감소시키고 세포사멸과 노화를 증가시키며, 결과적으로 비폐쇄성 무정자증의 원인이 된다는 것을 발견했습니다45. 이전 연구에서는 정조세포에서 lncRNA NONMMUT074098.2의 넉다운이 세포사멸을 유도한다는 것이 밝혀졌습니다25. 이러한 연구들은 lncRNA가 정조세포 세포사멸 및 정자 형성의 중요한 조절자임을 시사합니다. 본 연구에서 lncRNA NONMMUT031883.2의 넉다운은 정조세포 세포사멸을 유도했습니다. CP 유도 후 마우스 고환 조직에서 이의 발현이 유의하게 감소한 반면, YC 처리는 이의 발현을 부분적으로 회복시켰습니다. 또한, YC 처리는 lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운으로 인해 유도된 비정상적인 정조세포 세포사멸을 완화시켰으며, 이는 YC의 보호 효과가 이 lncRNA의 조절과 관련이 있을 수 있음을 시사합니다.

QKI-5는 STAR 가족에 속하는 RNA 결합 단백질로, 표적 mRNA의 스플라이싱, 안정성 및 번역 효율을 조절함으로써 여러 생리적 및 병리학적 과정에 참여합니다46,47. 이전 연구를 통해 QKI-5가 생식계의 중요한 조절 인자이며, QKI-5의 비정상적인 발현은 하위 p38 MAPK 경로의 활성화를 통해 생식 세포의 세포사멸을 촉진하고 정자 기능을 손상시킬 수 있음이 밝혀졌습니다25. Li et al.은 p38 MAPK 경로의 활성화를 억제하면 쥐에서 CP로 유도된 고환 조직 손상이 감소하고 혈액-고환 장벽 기능이 회복된다는 것을 발견했습니다48. 이러한 발견은 QKI-5/p38 MAPK 축이 정원세포 세포사멸을 조절하는 중요한 경로이자 정자 형성 기능 장애 치료의 잠재적 표적이 될 수 있음을 시사합니다. 본 연구에서 CP 유도 후 마우스 고환 조직의 QKI-5 발현과 p38 인산화가 유의하게 증가한 반면, YC 처리는 QKI-5 발현과 p38 MAPK 경로 활성화를 감소시켰습니다. LncRNA NONMMUT031883.2는 QKI-5에 직접 결합하였으나, QKI-5 발현은 lncRNA의 안정성에 영향을 미치지 않았으며, 이는 lncRNA NONMMUT031883.2가 직접적인 상호작용을 통해 QKI-5 기능을 조절할 수 있음을 시사합니다. QKI-5 넉다운은 lncRNA NONMMUT031883.2 넉다운으로 인해 유발된 GC-1 세포의 손상을 완화시킨 반면, QKI-5 과발현은 GC-1 세포에 대한 YC의 보호 효과를 감소시켰습니다. Li et al.은 lncRNA NONMMUT074098.2가 QKI-5에 결합하여 생식 세포 세포사멸을 조절한다고 보고했습니다25. 본 연구 결과는 lncRNA NONMMUT031883.2 또한 QKI-5에 결합하며 정원세포 세포사멸 조절에 관여함을 보여줍니다. 종합하면, 이러한 데이터는 YC가 lncRNA NONMMUT031883.2를 상향 조절하고, QKI-5/p38 MAPK 경로를 억제하며, 비정상적인 정원세포 세포사멸을 줄여 CP로 유도된 정자 형성 기능 장애를 완화할 수 있음을 시사합니다. 다만, YC는 다성분 한약 제제로 여러 표적에 작용할 가능성이 높다는 점에 유의해야 합니다. YC 성분의 직접적인 항산화 효과, 다른 신호 전달 경로의 조절, 또는 lncRNA-QKI-5 축과 독립적인 후성유전적 조절과 같은 다른 메커니즘을 배제할 수 없으며, 이러한 요인들이 관찰된 보호 효과에 기여했을 수 있습니다.

몇 가지 제한 사항을 인정해야 합니다. 본 연구는 마우스 모델과 GC-1 세포주에서만 수행되었으며, 불임 환자의 임상 샘플을 이용한 검증이 부족했습니다. 정자 형성은 복잡한 과정이며, 마우스의 전체 정자 형성 주기는 약 35일이 소요됩니다49,50. 본 연구에서 사용된 30일간의 YC 요법은 전체 정자 형성 주기를 포괄하지 못했습니다. 따라서 전체 정자 형성 주기 동안 YC의 치료 효과를 체계적으로 평가하기 위해 35일 이상의 중재 프로토콜을 적용한 향후 연구가 필요합니다. 또한, lncRNA NONMMUT031883.2가 QKI-5에 결합한 후 발생하는 정밀한 분자적 사건, 예를 들어 QKI-5 스플라이싱 활성의 변화와 세포 내 위치 변화, 그리고 하위 스플라이싱 표적의 인식 및 조절 등에 대해서는 추가적인 탐색이 필요합니다. 더욱이, YC 처리가 lncRNA NONMMUT031883.2의 발현을 상향 조절했지만, 상위 전사 인자와 후성유전학적 기전은 아직 밝혀지지 않았습니다. YC에 의한 lncRNA NONMMUT031883.2 발현의 분자적 근거를 명확히 하기 위해 프로모터 분석 및 염색질 면역침강법(chromatin immunoprecipitation assays)을 포함한 향후 연구가 필요합니다. 나아가, 향후 연구에서는 화학요법 관련 남성 불임 환자를 대상으로 YC의 효과를 평가하고, 고환 조직이나 정액에서 lncRNA NONMMUT031883.2의 발현을 측정하여 진단 또는 치료 마커로서의 잠재적 임상 가치를 결정해야 합니다.

결론적으로, YC는 lncRNA NONMMUT031883.2를 상향 조절하고 QKI-5/p38 MAPK 경로의 활성화를 억제함으로써, 정원세포의 세포사멸과 고환 손상을 줄이고 마우스의 정자 형성 기능 장애를 완화합니다. 이러한 발견은 정자 형성 기능 장애에 대한 YC의 보호 효과 기저에 있는 분자적 메커니즘을 규명하며, 정자 형성 조절에서 lncRNA NONMMUT031883.2와 QKI-5/p38 MAPK 경로의 역할에 대한 현재의 이해를 확장합니다. LncRNA NONMMUT031883.2와 QKI-5는 남성 정자 형성 기능 장애의 잠재적인 치료 표적이 될 수 있습니다.

공개 사항

저자들은 재정적 또는 비재정적 이해관계의 충돌이 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 중국 국가자연과학재단(지원 번호 82374257), 강소성 중의병원의 제4차 최고학술인재 양성 프로그램(지원 번호 k2026yrc74), 그리고 강소성 중의학 및 중서의결합의학 과학연구 프로젝트(지원 번호 CYTF2026019)의 지원을 받아 수행되었습니다.

재료

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이름회사카탈로그 번호댓글
액티노마이신 DMedChemExpress, 미국 뉴저지주 먼머스 정션HY-17559RNA 안정성 분석에 사용되는 전사 억제제
AMV 역전사 효소Takara, 도쿄, 일본2621상보적 DNA 합성을 위한 효소
Annexin V-APC/PI 검출 키트BioLab Technology, 중국 베이징KFS191세포 사멸의 유세포 분석용 키트
항퇴색 봉입제MedChemExpress, 미국 뉴저지주 먼머스 정션HY-K1042형광 보존을 위한 봉입제
Bax 1차 항체Affinity Biosciences, OH, USAAF0120Bax 검출을 위한 1차 항체
BCA 키트맥클린, 상하이, 중국B917925단백질 농도 측정 키트
Bcl-2 1차 항체Affinity Biosciences, OH, USAAF0769Bcl-2 검출을 위한 1차 항체
우혈청알부민BioLab Technology, 중국 베이징BTN131070블로킹 시약
Calcein/PI 검출 키트Beyotime, 중국 상하이C2015M생존/사멸 세포 염색 키트
Caspase-3 활성 분석 키트BioLab Technology, 중국 베이징QN2866caspase-3 활성 측정 키트
Caspase-3 일차 항체Abcam, MA, USAab184787caspase-3 검출을 위한 1차 항체
CCK-8 시약MedChemExpress, 미국 뉴저지주 먼머스 정션HY-K0301세포 생존능 평가용 시약
절단된 caspase-3 1차 항체Abcam, MA, USAab32042cleaved caspase-3 검출을 위한 1차 항체
사이클로헥시마이드(Cycloheximide)Macklin, 중국 상하이H823111단백질 안정성 분석에 사용되는 단백질 합성 억제제
시클로포스파마이드MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420정자 형성 기능 장애를 유도하는 데 사용됨
DAPI 시약Beyotime, 중국 상하이C1006핵 대조염색
DMEM 배지Wuhan Sunncell Biotechnology, 중국 후베이성SNLM-302GC-1 세포 배양 배지
ECL 작동액Solarbio, 중국 베이징SW2030단백질 밴드 검출용 화학발광 기질
에토포사이드MedChemExpress, 미국 뉴저지주 먼머스 정션HY-13629세포사멸 유도제
유세포 분석계BD Biosciences, CA, USABD FACSCalibur세포사멸 분석 기기
FlowJo 소프트웨어BD Biosciences, CA, USAv10.8유세포 분석 데이터 분석용 소프트웨어
형광 현미경Leica, Heidelberg, GermanyDM3000형광 이미징 장비
형광 표지 2차 항체 IgGServicebio, 중국 우한GB22303면역형광 검출을 위한 2차 항체
여포자극호르몬 ELISA 키트Huamei Biotech, 중국 우한CSB-E06871m혈청 난포자극호르몬 측정 키트
GAPDH 1차 항체Affinity Biosciences, OH, USAT0004웨스턴 블로팅을 위한 로딩 컨트롤 항체
GC-1 세포Wuhan Sunncell Biotechnology, 후베이성, 중국SNL-302마우스 정원세포주
겔 이미지 분석 시스템Jinpeng Analysis Instrument, 중국 상하이JP-2880겔 및 블롯 시각화를 위한 이미징 시스템
겔 이미징 시스템Invitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500웨스턴 블롯용 화학발광 이미징 시스템
염소 항-토끼 IgGServicebio, 중국 우한GB23303웨스턴 블로팅용 2차 항체
헤마톡실린 용액BioLab Technology, 중국 베이징YT165조직학적 분석을 위한 핵 염색
염산 에탄올 분별 용액Beyotime, 중국 상하이C0163S헤마토실린 염색용 분별 시약
ImageJ 소프트웨어미국 국립보건원1.54시간이미지 정량화를 위한 소프트웨어
IP 세포 용해 완충액Beyotime, 중국 상하이P0013면역침강 및 단백질 추출용 용해 완충액
Ki67 1차 항체Affinity Biosciences, OH, USAAF0198Ki67 검출을 위한 1차 항체
LDH 세포독성 분석 키트Beyotime, 중국 상하이C0016젖산탈수소효소 방출 및 세포 손상 측정 키트
광학 현미경Olympus, 일본 도쿄CKX53정자 수 측정 및 형태학적 관찰에 사용됨
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001형질전환 시약
마이크로플레이트 리더Molecular Devices, CA, USASpectraMax Mini흡광도 측정 장비
마우스 황체형성호르몬 ELISA 키트Huamei Biotech, 중국 우한CSB-E12770m혈청 황체 형성 호르몬 측정 키트
마우스 테스토스테론 ELISA 키트Huamei Biotech, 중국 우한CSB-E05101m혈청 테스토스테론 측정 키트
중성 검BioLab Technology, 중국 베이징QN1253조직 절편용 봉입제
p38 1차 항체Affinity Biosciences, OH, USAAF6456총 p38 검출을 위한 1차 항체
파라포름알데히드MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333세포 및 조직용 고정제
PARIS 키트Invitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921핵 및 세포질 RNA 분획 키트
PCR 시스템ABI, CA, USAABI PRISM 7300실시간 PCR 기기
p-p38 1차 항체Affinity Biosciences, OH, USAAF3455인산화된 p38 검출을 위한 1차 항체
프로테이나제 K 용액Beyotime, 중국 상하이ST532TUNEL 염색 전 조직 투과화를 위한 시약
PVDF 막Millipore, MA, USAISEQ00010웨스턴 블로팅의 단백질 전이를 위한 막
QKI-5 1차 항체Abcam, MA, USAab126742QKI-5 검출을 위한 1차 항체
RNA 결합 버퍼Invitrogen, Carlsbad, CA, USA65040DRNA-단백질 결합 반응용 완충액
SDS 로딩 버퍼Beyotime, 중국 상하이P0286SDS-PAGE용 시료 로딩 버퍼
스트렙타비딘 자성 비드MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208비오틴 표지 RNA 프로브 캡처를 위한 자성 비즈
TB Green FAST qPCR 키트Takara, 도쿄, 일본CN830S정량적 PCR용 시약 키트
Triton X-100Macklin, 중국 상하이T824275투과화 시약
TRIzol 시약Invitrogen, Carlsbad, CA, USA죄송합니다. 제공해주신 텍스트 "15596018CN"은 번역할 내용이 없는 식별 번호나 코드 형태로 보입니다. 번역이 필요한 원문 텍스트를 제공해주시면, 요청하신 지침에 따라 전문적인 학술 한국어로 번역해 드리겠습니다.총 RNA 추출용 시약
TUNEL 검출 용액Beyotime, 중국 상하이C1086DNA 단편화 검출용 시약
자일렌Macklin, 중국 상하이X821391파라핀 제거 및 조직 투명화용 시약

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