방법 논문

결막하 주사를 이용한 TGF-β 유도 설치류 근시 모델 구축

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DOI:

10.3791/73178

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2026년 10월 6일

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1Department of Veterinary Medicine, National Chung-Hsing University, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Department of Chemistry, National Central University, 4Department of Biomedical Engineering and Environmental Sciences, National Tsing Hua University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, China Medical University Hospital

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 결막하 TGF-β2 주입을 통해 유도되는 고글 및 눈꺼풀 봉합이 필요 없는 설치류 근시 모델을 설명합니다. 이 모델은 NLRP3/IL-1β-MMP2 축을 활성화하여 안축장 연장을 유발하며, 분할 생체 측정 기록 방식을 통해 마취로 인한 인위적 오차를 최소화함으로써 고충실도 데이터를 얻을 수 있습니다.

초록

근시(Myopia)는 과도한 안축장 연장과 공막 세포외 기질(ECM) 재구성이 특징인 주요한 글로벌 공중 보건 문제입니다. 이러한 메커니즘을 연구하는 데 실험 모델이 필수적이지만, 소형 설치류를 이용한 전통적인 광학적 디포커스 방법은 기술적 한계가 있습니다. 본 연구에서는 transforming growth factor-beta (TGF-β)의 반복적인 결막 하 주사를 통해 표준화 가능한 약리학적 근시 모델을 구축하고 평가하였습니다. 표적 전달을 구현하기 위해 상안검을 외전시키는 양손 외과적 고정 기술을 개발하였으며, 이를 통해 33-gauge 바늘로 검결막을 20°–30°의 얕은 각도로 겨냥할 수 있도록 하였습니다. 쥐(rat)를 이용한 in vivo 스크리닝을 통해 TGF-β2 (500 pg/eye)가 안구 후방 성장의 주요 동인임을 확인하였습니다. 이후 생쥐(mouse)에서의 용량-반응 적정 결과, 역U자형 프로파일이 나타났습니다. 1차 검증 코호트에서 최저 용량(250 pg/eye)은 뚜렷한 안축장 연장(0.197 ± 0.012 mm)과 근시성 굴절 변화(−1.58 ± 0.63 D)를 유도하였습니다. 분자 수준에서 반복적인 TGF-β2 투여는 두 종 모두에서 망막의 NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) / interleukin-1β (IL-1β) 인플라마좀 카스케이드를 활성화하고 matrix metalloproteinase 2 (MMP2) 발현을 상향 조절하였습니다. 마취 관련 아티팩트를 최소화하는 2일 분할 생체 측정 기록 체계와 결합된 이 프로토콜은 항근시 중재법을 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다.

서론

근시(Myopia)는 전 세계적으로 주요한 공중 보건 문제가 되었으며, 2050년까지 전 세계 인구의 약 50%가 영향을 받을 것으로 예상됩니다1,2. 진행성 근시의 주요 병리학적 원인은 안구의 과도한 안축장 연장으로, 이는 세포외 기질의 활발한 리모델링과 조직 퇴행을 유발하여 후안벽의 구조적 얇아짐을 초래합니다3. 이러한 역동적인 변화에는 구조적 리모델링(공막 ECM 분해, 콜라겐 소실, 후층 박층화로 특징지어짐)과 기능적 리모델링(생체역학적 강성 감소, 맥락막 혈류 변화, 비정상적인 망막-RPE 염증성 신호 전달로 특징지어짐)이 모두 포함되며, 이는 결과적으로 근시성 황반병증, 망막 박리, 녹내장 및 조기 백내장을 포함하여 시력을 위협하는 합병증과 가역 불가능한 시각 장애의 평생 위험도를 증가시킵니다4,5,6,7. 이 질환의 상당한 임상적 및 사회경제적 부담에도 불구하고, 비정상적인 안구 성장을 조절하는 정확한 상위 분자 기전은 여전히 완전히 밝혀지지 않았습니다. 따라서 안축장 연장을 유도하는 신호 전달 경로를 규명하고 재현 가능하며 표준화된 동물 모델을 개발하는 것은 새로운 치료 표적을 발굴하고 전 세계적인 근시 유행을 관리하는 데 있어 매우 중요한 단계입니다.

형태 박탈 근시(FDM)와 렌즈 유발 근시(LIM)는 광학적 디포커스(optical defocus) 및 정시화(emmetropization)를 연구하는 골드 표준으로 활용되지만8,9,10,11, 이러한 광학적 디포커스 모델을 소형 설치류, 특히 생쥐에 적용하는 것은 상당한 기술적 어려움을 수반합니다. 생쥐의 활발한 그루밍 행동으로 인해 고글이 자주 탈락하며, 이를 방지하기 위해 보호 칼라와 같은 스트레스 유발 조치가 필요합니다12. 또한, 기계적 마찰, 눈꺼풀 봉합 및 차폐물 아래의 미세환경 변화로 인해 각막 혼탁이나 각막 궤양과 같은 이차적인 각막 합병증이 빈번하게 발생합니다13,14,15. FDM과 LIM은 시각적 디포커스를 연구하는 기초적인 패러다임으로 남아 있으나, 각막 혼탁, 기계적 마찰 또는 눈꺼풀 봉합 자극과 같은 이차적인 안구 표면 합병증은 광학적 생체 계측 측정에 간섭을 일으킬 수 있습니다15. 이러한 절차적 아티팩트는 눈물막의 안정성과 각막 투명도를 저하시켜 실험 제외율을 높이고 측정 노이즈를 증가시킵니다13,16. 반면, 약물학적 유도는 물리적 차폐물을 사용하지 않으므로 각막의 투명도를 유지하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 광학 및 초음파 생체 계측을 가능하게 합니다. 근시에서 과도한 안구 연장은 후공막의 세포외 기질(ECM) 리모델링 변화에 의해 유도되며17, 여기서 transforming growth factor-beta (TGF-β) 동형 단백질들이 콜라겐 및 프로테오글리칸 합성의 핵심 조절자로 작용합니다18,19. 최근의 증거들은 TGF-β 신호 전달이 저등급 안구 염증 및 matrix metalloproteinase 2 (MMP2) 매개 기질 분해와 상호작용하여20, 잠재적으로 공막 리모델링과 안축장 연장에 기여할 수 있음을 시사합니다21,22,23,24. 이는 근시안의 방수에서 보고된 transforming growth factor-beta 2 (TGF-β2), interleukin-6 (IL-6) 및 MMP2의 수준 상승25,26,27과 실험 모델에서의 TGF-β / nuclear factor kappa B (NF-κB) / MMP2 축의 활성화에 의해 뒷받침됩니다20,21. 이러한 발견들은 근시 진행 중의 역동적인 안구 내 분자 신호 전달을 반영하지만, 방수 마커에 대한 상대적인 해부학적 기여도(국소 전방 분비, 결막하 저장소 유출 또는 후유리체 확산 여부)는 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 그러나 이 약물학적 모델의 범위와 내재적 한계를 인식해야 합니다. 결막하 TGF-β 전달은 광학적 디포커스와 시각 처리 경로를 우회하므로, 이 모델은 하위 생화학적 폭포 반응, 특히 TGF-β2 / NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) / interleukin-1β (IL-1β) / MMP2 매개 공막 ECM 리모델링을 분석하고 염증 또는 기질 분해 경로를 표적으로 하는 후보 치료제를 스크리닝하는 데 가장 적합합니다. 반대로, 상위 시각 신호 전달, 망막-공막 광학 신호 전달 또는 환경 광원 유도 정시화 메커니즘을 연구하는 데는 적합하지 않으며, 이러한 연구에는 기존의 FDM 또는 LIM 모델이 여전히 필수적입니다.

이러한 방법론적 공백을 해결하기 위해, 쥐와 생쥐의 결막하에 TGF-β를 반복적으로 주입하여 근시 모델을 구축하고 검증함으로써 기계적 외상과 안구 표면 자극을 최소화하는 정교한 접근 방식을 제시하였습니다. 물리적 차폐물의 필요성을 배제함으로써, 본 프로토콜은 머리 장착형 하드웨어와 관련된 잠재적 행동 교란 요인을 상당히 줄이는 동시에 약물 투여량과 실험 일정에 대한 정밀한 제어를 가능하게 합니다. 본 연구에서는 (서열 보존성에 의해 설치류 조직 내 기능적 교차 반응성이 검증된28) 세 가지 재조합 인간 TGF-β 동형 단백질의 효능을 쥐에서 평가하였으며, 생쥐에서 TGF-β2의 비선형 용량-반응 역학을 매핑하였습니다. 중요한 점은, 이 표준화된 요법이 안축장 연장과 근시 굴절 변화가 동시에 나타나는 표현형 근시를 효율적으로 유도하였으며, 망막의 NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) / interleukin-1β (IL-1β) 염증성 복합체 및 MMP2 축을 활성화했다는 것입니다. 궁극적으로, 본 프로토콜은 구체적인 운용 범위를 상세히 설명하는 동시에 하위 공막 리모델링을 표적으로 하는 분자적으로 정의된 실행 가능한 프레임워크를 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 중국의학대학(China Medical University, CMU) 기관동물관리및이용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 지침 및 규정에 따라 수행되었다. 모든 절차는 안과 및 시각 연구에서 동물의 이용에 관한 시각연구학회(Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO) 성명서를 준수하였다. 모든 실험을 시작하기 전에 CMU-IACUC로부터 완전한 승인을 획득하였다. 실험 종료 시점에서 동물은 중국의학대학(CMU) 기관동물관리및이용위원회(IACUC) 및 지역 동물복지 규정에서 제시하는 지침에 따라 엄격히 안락사하였다.

1. 동물 및 윤리 승인

  1. 수컷 브라운 노르웨이(Brown Norway, BN) 래트(3–4주령, 60–80 g) 및 수컷 C57BL/6 (B6) 마우스 (3–4주령, 15–적절한 실험 동물 공급업체로부터 20 g)
  2. 모든 동물을 제어된 환경에서 사육한다(12시간 빛/어두움 주기, 22도). °C ± 2 °C, 50% ± 10% 상대 습도 조건에서 자유롭게 표준 사료와 물을 섭취할 수 있도록 하였다.
  3. 실험 절차를 시작하기 최소 3일 전부터 적응 기간을 가져야 한다.
  4. 흰쥐 또는 생쥐를 무작위로 처리 그룹에 배정한다: 음성 대조군(용매 대조군) 및 TGF-β2회 주입 그룹. 충분한 통계적 검정력을 확보하기 위해 각 코호트당 최소 N = 5마리의 동물을 사용한다.
    참고: 피험자 간 설계가 사용되었다. 개별 동물의 양안에는 동일한 처치가 적용되었다(양측 대조군 [1–2 µL BSS] 또는 양측 활성 rhTGF-β2).
    1. 각 동물의 양안 안구 매개변수(축장 및 굴절오차)를 측정한다.
      참고: 서면으로 된 CMU-IACUC 승인이 확보되었는지 확인하고, 모든 시술을 수행하는 인원이 적절히 훈련 및 인증을 받았는지 확인해야 한다.

2. TGF-의 제조β2가지 용액

참고: 모든 재용해 및 희석 과정은 인증된 생물안전작업대 내에서 엄격한 무균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.

  1. 동결건조된 재조합 인간 TGF-를 재용해하라β멸균된 50% 글리세롤(0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 포함) 2에서 100을 준비하기 위해 µg/mL 저장 용액
  2. 무균 균형 염용액(BSS)에서 원액을 연속 희석하여 작업 용액을 제조한다.
    1. 흰쥐 집단(500 pg 용량)의 경우, 원액을 최종 농도 250 ng/mL(250 pg/µL) 2에 대한 µ눈당 10 µL 주사량
    2. 마우스 용량-반응 코호트의 경우, 250 ng/mL, 375 ng/mL 및 500 ng/mL 농도(250, 375, 500 pg/µL) 1에 대한 µ눈당 100 µL 주사량
  3. 1회용 15 준비–20 µ무균 마이크로원심 튜브에 L 알리쿼트를 넣고 액체 질소에서 급속 냉동한 후 -20에 보관한다 °C. 사용 직전에 얼음 위에서 알리쿼트를 해동한다.
    경고: 액체 질소는 심한 냉동 화상을 유발할 수 있으며 질식 위험이 있습니다. 기관의 안전 절차에 따라 적절한 극저온 보호구를 착용하고 환기가 잘 되는 장소에서 취급하십시오.
  4. 병행하여 멸균 BSS에 50% 글리세롤 및 0.1% BSA를 첨가한 동일한 매트릭스를 보충하여 음성 대조 용액을 준비한다.

3. 결막하 주사 절차

  1. 동물들을 유도 챔버에 넣고 3%의 이소플루란으로 유도–4% 이소플루란을 사용하여 마취 유도. 이후, 동물을 1.5% 이소플루란을 공급하는 코 콘으로 이동–마취 유지용 2% 이소플루란
    주의: 이소플루란은 휘발성 마취제입니다. 적절한 가스 회수 장치를 사용하고 기관의 직업 보건 및 안전 절차에 따라 취급하십시오.
  2. 발가락 압박 반사의 소실을 확인하여 마취의 적절한 깊이를 검증한다.
  3. 동물을 섬유광학 스포트라이트 아래에서 복와위로 놓는다. 미세 끝집게로 상안검을 조심스럽게 잡아 당기고 들어 올린 후 약간 외반시켜 결막포와 결막주머니를 완전히 노출시킨다(그림 1B).
  4. 10을 미리 적신다 µL형 유리 마이크로 시린지 및 33게이지 바늘 2개–3회 반복하여 작동 용액으로 데드 스페이스를 제거한다. 목표 용량(2 µL 또는 1 µ마우스용 L) 및 모든 미세 기포 제거.
    경고: 바늘 및 기타 날카로운 도구는 조심스럽게 다루며, 기관의 규정에 따라 승인된 날카로운 물체 전용 폐기 용기에 폐기해야 한다.
  5. 33게이지 바늘을 베벨면이 위를 향하도록(베벨 업) 위치시킨 후, 노출된 안검 결막면의 지정된 삽입 부위를 향해 대상 지점을 정한다(그림 1B, C).
  6. 결막 상피를 얕은 각도(20도)로 바늘 끝을 삽입한다.°–30° 각도 (그림 1C).
  7. 결막궁을 지나 협소한 점막하 공간을 따라 조심스럽게 바늘을 전진시켜 눈꺼풀 점막하 부위에 도달한다(그림 1C).
    중요한 단계(피해야 할 사항): 아래의 마이봄선을 관통하거나 더 깊은 안구 구조를 실수로 천공하지 않도록 철저히 주의해야 한다. 바늘의 슬랜트가 반투명한 결막 표면 아래에서 진행하는 동안 계속해서 육안으로 확인될 수 있도록 하여, 조명 하에서 바늘의 위치가 적절히 표재적으로 유지되는지 시각적으로 확인한다.
  8. 5분 동안 천천히 용액을 주입한다–10초 동안 유지한 후, 액체의 역류를 방지하기 위해 바늘을 천천히 빼내기 전에 추가로 5초 동안 그 자리에 고정한다.
    ​참고: 적절한 결막하 투여는 국소적인 결막 부종과 창백함(블렙 형성)이 즉시 나타나는 것으로 확인할 수 있다.
    1. 만약 수포 형성이 실패하거나 상당한 누출이 발생하면, 하안검 결막 공간에 한 번 재주사한 후 실험 기록부에 이탈 사항을 기록하라.
      참고: 각 눈당 세션당 재주입은 한 번으로 엄격히 제한하며, 지속적인 투여 실패가 있는 동물은 장기적 분석에서 제외한다.
  9. 동일한 그룹 내 개별 동물 주사 사이에 마이크로 시린지 내부를 소독하기 위해 멸균된 70% 에탄올로 3회 세척한 후, 멸균 생리식염수로 5회 세척한다.
  10. 확대하여 33게이지 바늘 끝을 점검한다.–5회 주사 후에는 바늘 끝이 무뎌지거나 휘는 경우 즉시 바늘을 교체한다.
  11. 모든 음성 대조군 동물을 먼저 주사한 후, 치료 집단을 다루거나 주사하기 전에 약물 간 오염의 위험을 제거하기 위해 음성 대조군 동물에 대한 주사를 완료해야 한다. 치료 집단으로 전환하기 전에 주사기 소독 절차를 다시 반복한다.
  12. 각 실험 후 마이크로 시린지를 전용 세척 용액으로 세척하고, 초순수수와 무수에탄올로 헹군 후 건조하여 보관한다.
  13. 결막하 주사를 연속 3주 동안 매주 1회 반복한다(0일차, 7일차, 14일차). 기저 상태에서 종단적 생체 측정 평가를 수행한다(0일차, 7일차, 14일차). −1 및 0)과 최종 평가 시점(20일 및 21일)을 4절에 자세히 설명된 대로 진행한다.
  14. 주사 후 동물을 페이퍼 타월을 깐 따뜻한 회복 케이지에 넣는다. 흉부 부위가 완전히 회복되고 정상적인 보행 활동이 돌아올 때까지 동물을 지속적으로 관찰한다.
  15. 회복 후 실체현미경으로 눈을 점검하여 안구 내 출혈, 각막 혼탁 또는 급성 기계적 손상을 배제한다. 동물들은 매일 스트레스 징후 또는 국소 감염 여부를 모니터링한다.

4. 모델 검증 방법

  1. 안구 굴절 이상 평가
    1. 생리학적 체온을 유지하고 마취로 인한 백내장을 예방하기 위해 설치류를 온도 조절이 가능한 가열 패드 위에 올려 놓는다. 동물은 약한 이소플루란 마취(1%) 상태에서 유지한다.–1.5%)를 코 콘을 통해 공급하여 마취 깊이를 일정하게 유지한다.
    2. 각 눈에 미드리안-P(Mydrin-P, 0.5% 트로피카마이드 및 0.5% 페닐레프린 염산염)을 1방울 점안한다. 10분 후–측정 15분 전에 점안하여 완전한 산동마비와 동공 확장을 유도한다.
    3. 동물을 어두운 간접 조명 아래에서 흉와위로 고정한다. 각막 투명도를 유지하기 위해 광학 촬영 직전 순간까지 멸균된 BSS를 지속적으로 공급한다.
    4. 적외선 자동 광굴절계를 사용하여 엄격한 5초 이내에 굴절검사를 실시한다.–마취 유도 후 10분 이내의 시간 창. BN 쥐의 경우, 촬영 중 확장된 동공을 완전히 노출시키기 위해 수동으로 눈꺼풀을 부드럽게 당긴다.
    5. 각 눈당 독립적으로 세 차례의 광학적 측정값을 획득하고, 이 값들을 평균하여 기준 또는 최종 굴절오차를 결정한다.
      ​중요 단계(소요 시간 & 수기 순서): 평가 수기의 1일차(1일)에 광굴절검사를 시행한다( –기준일은 1일차, 종료 시점은 20일차이며, 모든 접촉 절차 전에 어두운 조명 하에서 광굴절검사(photorefraction)를 시행한다. 접촉식 초음파검사 또는 음향 젤 도포 후에 광굴절검사를 수행하면 각막 광학이 크게 방해받고, 적외선 광선이 산란되어 자동 굴절 측정값이 무효화된다.
  2. 고주파 B형 초음파 검사를 통한 축장 측정
    1. 다음 날(기준점 측정의 경우 0일차 또는 최종점 측정의 경우 21일차)에 경미한 이소플루란 마취(1–1.5%) 및 설치류 조직 음속(1532)에 보정된 휴대용 16 MHz 선형 초음파 프로브를 사용하여–1550 m/s
      1. B6 마우스(직접 각막 인터페이스)의 경우: 각막에 직접 진폴 카보머 젤(0.2%)을 기준 보호층으로 도포한 후, 표준 음향 젤 층을 추가한다.
        참고: 젤 층이 공기 방울이 남지 않도록 각막 표면을 완전히 덮어야 하며, 공기 방울은 음향 감쇠를 유발할 수 있다.
      2. BN 래트(경안검 인터페이스)의 경우: 동물을 눈꺼풀이 닫힌 상태로 위치시킨 후, 외측 눈꺼풀 표면에 초음파 젤을 도포하고 경안검적으로 측정값을 획득한다.
        참고: 눈꺼풀을 통한 측정은 각막과의 직접적인 접촉을 제거하여 큰 설치류의 눈에서 각막 찰과상의 위험을 크게 줄인다.
    2. 초음파 프로브를 정렬하고, 안구 전면 계면에서 후부 공막 에코 벽까지 중심 광학 축을 따라 축길이를 측정한다.
    3. 눈당 10개의 독립적인 반복 B-s캔 추적을 획득하고 평균 축장도를 계산한다.
    4. 시술 후 각막 자극을 방지하기 위해, 획득 직후 즉시 멸균된 BSS로 눈에 남아 있는 잔류 음향 젤을 부드럽게 세척한다.
      중요 단계(무압력 접촉): 초음파 프로브를 젤 계면에 극도로 가볍고 무압력으로 접촉시킨다. 각막 정점에 가해지는 하향 물리적 압력은 전방 깊이를 인위적으로 압축하여 축 길이 측정값이 잘못된 짧아짐을 유도할 수 있다.
    5. 평균 축장 및 굴절오차 측정값을 후속 분석을 위해 기록한다.

결과

결막하 주사 모델의 구축 및 해부학적 검증
광학 고글 착용이나 눈꺼풀 봉합과 관련된 기술적 변동성을 해결하기 위해, 표적 국소 약물 저장소로서 검판 결막과 구결막 사이의 결막하 공간을 검증하였다(그림 1A). 상안검 결막 구석(superior fornix)을 통한 해부학적 접근은 안구 표면의 무결성을 유지하면서 표적 부위를 일관되게 노출시켰다(그림 1B). 성공적인 모델 구축은 구체적인 운용 및 생체 측정 기준을 통해 확인되었는데, 여기에는 공막 천공, 조직 출혈 또는 마이봄샘 손상 없이 표적 검판 결막하 공간에 국소적으로 액체가 채워진 점막하 수포(부종)가 형성되었음을 즉각적인 투조 검사로 확인하는 것(그림 1C)과, 대조군 대비 21일 차에 근시성 굴절 변화(Δ Refraction < −1.0 D)를 동반한 동시적 안축장 연장(생쥐 Δ AL > 0.15 mm; 쥐 > 0.40 mm)의 종단적 생체 측정 검증이 포함되었다. 반대로, 성공하지 못했거나 최적화되지 않은 결과는 구체적인 기술적 및 생리학적 실패 모드를 통해 식별되었다. 바늘 제거 시 조기 액체 역류나 의도치 않은 깊은 눈꺼풀/안와 조직 침투와 같은 기술적 실패는 수포 형성이 최소화되거나 나타나지 않게 하여, 불충분한 약물 유지로 이어지고 근시 유도에 실패하게 하였다; 지속적인 누출을 보이는 동물은 기록되었으며 프로토콜 단계 3.8.1에 따라 제외되었다. 또한, 바늘의 깊은 오배치나 과도한 기계적 견인으로 인한 안구 표면 합병증은 국소 결막하 출혈이나 각막 외상을 유발하여 혼란스러운 염증 반응을 야기했다. 최적화되지 않은 표현형 결과는 용량-반응 평가 중에도 관찰되었는데, 임계값 초과 농도(예: 생쥐 안구당 500 pg)를 투여했을 때 안축장 연장이 감소하는 감쇄된 U자형 반응이 나타났으며, 이는 엄격한 용량 최적화의 생리학적 필요성을 강조한다. 이러한 표준화된 기준 하에 검증된 국소 약물 유지는 후속 생체 측정 및 분자 분석을 위한 고정밀 조직 표적화를 보장하였다.

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그림 1: 설치류의 결막하 주사 절차에 대한 해부학적 지표 및 모식도. (A) 눈꺼풀, 각막, 결막낭 및 표적 결막하 공간을 포함한 주요 해부학적 지표를 나타내는 설치류 안구의 시상단면도. (B) 마이크로포셉을 이용한 조직 고정 및 안검결막 노출의 수술적 시연; 파란색 점은 33-gauge 주사기를 이용한 미세주입을 위한 표적 바늘 삽입 부위를 나타냄. (C) 안검결막 표면, 결막궁 및 하부 안구 구조와 관련하여 바늘의 방향과 삽입 경로를 보여주는 고배율 모식도. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.

TGF- $\beta$ 스크리닝β 쥐의 동형 단백질 및 TGF-β의 용량-반응 적정β마우스의 축성 신장을 위한 2
실험은 용량 스크리닝 코호트(그림 2) 및 1차 검증 코호트(그림 3). 코호트 전반에 걸쳐 양측성 파라미터를 측정하였으며, 개별 동물(N)을 주요 생물학적 반복수로 지정하였습니다. 안구 간 의존성(동일 동물 내의 우안(OD) 대 좌안(OS))은 적절한 경우 이원 반복측정 분산분석(two-way repeated-measures ANOVA) 또는 혼합 효과 모델(mixed-effects models)을 사용하여 처리하였습니다. 연속형 데이터는 평균으로 표시되었습니다. ± SD. 대조군과 실험군 간의 차이는 양측 Student's t-검정을 사용하여 평가하였다. t적절한 경우 t-검정, 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 또는 이원 반복 측정 분산 분석(two-way repeated-measures ANOVA)을 수행하였다. A p-값 < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.

가장 강력한 형질전환 성장인자-β (TGF-β) 동형 단백질을 결정하고 안축장 연장을 유도하기 위한 최적의 투여 용법을 설정하기 위해, 기초선(0일차)부터 21일차까지(그림 2) 쥐 및 생쥐 코호트를 대상으로 반복적인 결막하 주사의 효과를 평가하였습니다. 마취로 인한 인위적 오차를 방지하기 위해 2일 간격 분할 방식의 생체 측정 기록을 수행하였습니다.

먼저 쥐 코호트에서 세 가지 재조합 인간 TGF-β 이소형(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3)을 500 pg/eye의 표준 농도로 스크리닝하였다(그림 2A). 일원 분산 분석(One-way ANOVA) 후 사후 다중 비교를 실시한 결과, 21일의 기간 동안 세 가지 이소형 모두가 매개체 처리 대조군에 비해 안구 후방 성장을 유의미하게 자극하는 것으로 나타났다. TGF-β1(0.444 ± 0.042 mm)과 TGF-β3(0.454 ± 0.049 mm) 모두 유의미한 안축장 연장을 촉진하였으나(대조군 0.328 ± 0.071 mm 대비 각각 p < 0.05 및 p < 0.01), TGF-β2가 가장 큰 안축장 증가(0.486 ± 0.074 mm)를 유도하였으며 가장 높은 통계적 유의성(p < 0.001)을 보여, 근시 표현형의 가장 효과적인 유도제임을 입증하였다.

쥐 스크리닝 결과를 바탕으로, 마우스 코호트에서 250, 375, 500 pg/eye의 세 가지 농도를 테스트하여 TGF-β2의 용량-반응 적정을 수행하였습니다(그림 2B). 결막하 TGF-β2 투여 결과, 역 U자형의 용량-반응 프로파일이 나타났습니다. 가장 낮은 용량(250 pg/eye)에서 대조군과 비교하여 안축장 신장이 가장 크게 가속화되었습니다(0.177 ± 0.038 mm 대 0.044 ± 0.011 mm; p < 0.0001). 더 높은 용량(375 및 500 pg/eye)에서는 안축장 변화의 크기가 점진적으로 감소하였으나, 여전히 대조군보다는 유의하게 높았습니다(각각 0.123 ± 0.029 mm; p < 0.001 및 0.095 ± 0.024 mm; p < 0.01).

종합하면, 이러한 데이터는 쥐의 경우 안구당 500 pg, 생쥐의 경우 안구당 250 pg을 매주 결막하 투여하는 요법이 이후의 구조적 및 분자적 연구를 위한 최적의 파라미터임을 입증합니다.

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그림 2변형 성장 인자의 용량 선택 스크리닝β (TGF-β쥐와 생쥐 안구의 안축장(axial length)에 미치는 아이소폼(isoform) 및 농도의 영향. (A) 랫드(초기 스크리닝 코호트)의 안축장 변화. 이는 TGF-β를 세 차례 연속으로 결막하 주사한 후, 기저선(0일 차, 첫 주사 전)과 최종 시점(21일 차) 간의 차이로 계산함.β1, TGF-β2, 또는 TGF-β3 (0, 7, 14일차에 안구당 500pg 투여)을 vehicle 처리 대조군과 비교하였다. (B마우스의 안축장 변화(용량 스크리닝 코호트)로, TGF-β를 결막하에 3회 연속 주입한 후 기선(0일 차)과 21일 차 사이의 차이로 계산함.β세 가지 서로 다른 농도(0, 7, 14일에 각각 250, 375 또는 500 pg/eye 투여)의 2를 투여한 군과 vehicle 처리 대조군을 비교하였다. 데이터는 평균값으로 제시되었다. ± SD (N = 그룹당 동물 5마리(그룹당 안구 10개에 해당). 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 사후 다중 비교를 통해 평가하였다; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 매개체 대조군 그룹 대비 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

반복적인 결막하 TGF-β2 주입이 쥐와 생쥐에서 안구 축 길이 연장 및 근시성 변화를 유도함
반복적인 결막하 TGF-β2 전달(주 1회, 총 3회 주입)의 생체 측정학적 영향을 평가하기 위해, 쥐와 생쥐 모델 모두에서 기준 시점부터 3주 차까지의 안구 축 길이 및 굴절 오차의 종단적 변화를 모니터링하였다(그림 3). 2일 분할 프로토콜(20일 차에 굴절 상태 측정, 21일 차에 B-스캔 초음파 검사 수행)을 통해 마취로 인한 잠재적 아티팩트와 안구 스트레스를 최소화하였다. 두 종 모두 이러한 다회 투여 요법 이후 실험적 근시 발생과 일치하는 표현형 변화를 나타냈다.

쥐 코호트에서, 500 pg/eye의 TGF-β2를 반복적으로 결막하 주사한 동물들은 대조군에 비해 21일 동안 안축장이 유의하게 더 많이 증가하였습니다 (0.466 ± 0.045 mm 대 0.388 ± 0.032 mm; p < 0.01; 그림 3A). 이러한 연장은 굴절 오차의 유의한 근시성 변화를 동반하였습니다 (p < 0.05; 그림 3B). 대조군 안구에서는 예상된 약간의 원시성 드리프트(+0.31 ± 0.93 D)가 나타난 반면, TGF-β2 처리 안구는 근시성 굴절 상태(−1.38 ± 0.91 D)로 전환되었습니다.

rat 데이터와 일관되게, 안구당 250 pg의 TGF-β2를 처리한 마우스에서도 뚜렷한 구조적 및 굴절 변화가 나타났습니다. TGF-β2 처리군 마우스의 안축 길이는 대조군에 비해 유의하게 증가하였습니다 (0.197 ± 0.012 mm 대 0.110 ± 0.014 mm; p < 0.0001; 그림 3C). 또한, 이러한 구조적 신장은 유의미한 근시성 이동을 유발하여 (p < 0.05; 그림 3D), 대조군 마우스에서 관찰된 자연적인 원시 굴절(+2.25 ± 1.77 D)을 근시성 프로필(−1.58 ± 0.63 D)로 효과적으로 반전시켰습니다.

안구 간 반응의 대칭성을 검증하고 양측 안구 측정값을 통합하는 것이 통계적 편향을 유발하지 않음을 확인하기 위해, 각 그룹 내의 왼쪽 눈(OS, n = 5)과 오른쪽 눈(OD, n = 5)에 대해 안축장 신장 역학을 개별적으로 평가하였다(Supplementary Figure 1). 쥐(Supplementary Figure 1A)와 생쥐(Supplementary Figure 1B) 모두에서, vehicle 대조군과 TGF-β2 처리군 모두 OS와 OD 안구 사이에 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 안구 간의 대칭적인 반응 역학을 확인시켜 준다. 또한, TGF-β2 처리 동물의 OS 및 OD 안구 모두 해당 vehicle 대조군에 비해 일관되고 뚜렷한 안축장 신장을 보였으며(p < 0.05, 쥐; p < 0.0001, 생쥐), 이는 주요 생체 계측 분석에서 양측 측정값을 산입하는 방식의 타당성을 뒷받침한다.

종합적으로, 이러한 결과는 TGF-β2의 반복적인 결막하 투여가 두 설치류 모델 모두에서 후안부 성장을 효과적으로 유도하며, 이에 상응하는 근시성 굴절 변화를 일으킨다는 것을 입증합니다(그림 3 및 보충 그림 1).

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그림 3: TGF-의 1차 검증β독립적인 쥐와 생쥐 코호트에서 안축장 연장 및 굴절 이상에 미치는 2가지 영향. (A) 결막하 TGF-β를 투여한 안구에서 기저치와 3주 차 최종 시점 간의 차이로 계산한 쥐의 안축장 변화β2 (0일, 7일, 14일에 순차적으로 안구당 500 pg 투여) 또는 용매 대조군. (B동일한 쥐의 눈에서 나타난 굴절 오차의 변화로, TGF- 처리군에서 유의미한 근시성 이동(myopic shift)이 나타남을 보여준다.βvehicle 대조군과 비교한 2-처리군. (C) 마우스(독립적 1차 검증 코호트)의 안축장 변화. 이는 결막하 TGF-를 투여받은 안구의 기저치와 3주 차 최종 시점 값의 차이로 산출됨.β2 (0, 7, 14일차에 안구당 250 pg 투여) 또는 용매 대조군. (D) 동일한 마우스 안구에서의 굴절 이상 변화로, 최적의 TGF- 조건 하에서 그에 상응하는 음의 디옵터 이동이 나타남β2 유도. 데이터는 평균으로 표시됨 ± 표준편차 (N = 그룹당 5마리(그룹당 10개의 안구에 해당). 통계적 유의성은 비쌍체 꼬리 양방향 검정을 사용하여 엄격하게 평가되었다. t-검사; *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 해당 벡터 대조군과 비교하여 0.0001. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

결막하 TGF-β2 투여는 실험적 근시 진행 과정 중 공막의 MMP2 발현을 상향 조절한다
망막-공막 축을 따른 하위 조직 재형성을 평가하기 위해, 결막하 TGF-β2 투여 후 공막 횡단면의 matrix metalloproteinase 2 (MMP2) 발현(그림 4)을 분석하였다. 쥐 모델의 후안부 절편에 대한 정량적 면역형광 분석 결과, 21일 차에 TGF-β2를 투여한 안구(500 pg/eye)의 공막 기질 내 MMP2 단백질 수준이 대조군에 비해 유의하게 상향 조절되었음을 확인하였다(p < 0.0001; 그림 4A, B).

망막색소상피(RPE) 및 맥락막 층 아래의 공막 매트릭스 전반에 걸쳐 뚜렷한 MMP2 형광 신호가 국소화되었으며, 이는 실험적 근시 진행 동안 외안구 외벽에서 국소적인 MMP2 관련 세포외 기질(ECM) 리모델링이 일어남을 확인시켜 주었습니다. 공막의 이러한 구조적 변화는 인접한 망막 내 상위 분자 변화에 대한 추가 조사를 촉진했습니다.

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그림 4: 결막하 TGF-β2 투여는 쥐 공막에서 MMP2 발현을 상향 조절한다. (A) 21일째에 vehicle-control군과 TGF-β2 처리군(500 pg/eye) 쥐의 안구 후방 횡단면에서 공막 MMP2 발현(빨간색)을 보여주는 대표 면역형광 이미지. 세포핵은 DAPI(파란색)로 대조 염색하였다. 명시야 중첩 이미지(Merge+BF)는 RPE, 맥락막 및 공막의 해부학적 경계를 나타낸다. 스케일 바 = 50 µm. (B) 형광 염색 강도의 정량적 분석 결과, TGF-β2 처리 쥐의 안구에서 공막 MMP2 발현이 유의하게 증가했음을 확인하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다(그룹당 N = 3개의 독립적인 생물학적 반복 실험, 동물당 1개 안구). 통계적 유의성은 unpaired two-tailed t-test를 사용하여 평가하였다; ****p < 0.0001 (vehicle control 그룹 대비). 약어: RPE, 망막 색소 상피; BF, 명시야. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

TGF-β2 유도는 쥐와 생쥐의 망막 모두에서 MMP2 및 염증 조절 복합체(inflammasome) 관련 단백질을 상향 조절한다
반복적인 결막하 주입으로 유도된 하위 분자 변화를 조사하기 위해, 21일 차의 Brown Norway 쥐와 C57BL/6 생쥐의 후안부 안구 절편을 대상으로 면역형광 염색을 수행하였다(Figure 5A–D). 모든 평가는 일관된 공간적 방향성을 확보하기 위해 시신경 유두에 엄격하게 정렬된 시상면 망막 절편을 대상으로 진행되었다. 정량 분석 결과, 매주 TGF-β2를 투여했을 때 두 종 모두에서 대조군(vehicle controls)과 비교하여 망막 층 전반에 걸쳐 특정 단백질 발현 프로파일이 유의미하게 변화했음을 확인하였다(Figure 5E,F).

쥐 모델에서 안구당 500 pg의 TGF-β2를 투여했을 때 망막 내 TGF-β2 수치가 유의미하게 증가했습니다 (p < 0.0001; 그림 5A,E). 이러한 상향 조절은 matrix metalloproteinase 2 (MMP2)의 발현 증가를 동반하였으며 (p < 0.0001; 그림 5B,E), 이는 세포외 기질의 활발한 재구성이 이루어지고 있음을 나타냅니다. 또한, TGF-β2 처리는 인플라마좀 센서인 NLRP3 (p < 0.0001; 그림 5C,E)와 전염증성 사이토카인인 IL-1β (p < 0.0001; 그림 5D,E)의 상향 조절을 통해 증명된 바와 같이 망막 염증 폭포 반응을 활성화했습니다.

마찬가지로, 안구당 250 pg의 TGF-β2를 처리한 마우스에서도 이러한 바이오마커들의 일관된 상승 경향이 나타났습니다(그림 5F). 망막의 TGF-β2 (p < 0.01; 그림 5A,F) 및 MMP2 (p < 0.001; 그림 5B,F) 발현이 유의하게 증가했습니다. 인플라마좀 경로 또한 마우스 망막에서 활성화되었으며, 대조군에서 거의 검출되지 않은 기저 수준과 비교하여 NLRP3 발현의 유의한 증가(p < 0.01; 그림 5C,F)와 IL-1β의 뚜렷한 상향 조절(p < 0.0001; 그림 5D,F)이 확인되었습니다.

종합하면, 이러한 결과는 결막하 TGF-β2 투여가 두 설치류 종 모두의 후방 망막에서 MMP2 매개 기질 리모델링 인자를 촉진하고 NLRP3/IL-1β 염증조절복합체 경로를 활성화한다는 것을 입증합니다.

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그림 5: 반복적인 결막하 TGF-β2 투여는 쥐와 생쥐의 망막 후방에서 MMP2 및 염증복합체 관련 단백질 발현을 상향 조절한다. (A–D>) 쥐(상단 패널)와 생쥐(하단 패널)의 대조군 및 TGF-β2 처리군 망막 시상면 절편의 대표 면역형광 이미지로, (A) TGF-β2, (B) MMP2, (C) NLRP3, (D) IL-1β (적색)를 염색하였으며, 핵은 DAPI (청색)로 대조 염색하였다. 스케일 바 = 50 µm. 대표 영역은 외망막층 내의 변화를 선택적으로 보여주며, 외망막층(OPL)부터 기저 망막색소상피(RPE) 복합체까지 이르는 뚜렷한 단백질 발현을 강조한다. (E>) 대조군과 TGF-β2 처리군(500 pg) 쥐 망막에서 TGF-β2, MMP2, NLRP3 및 IL-1β의 형광 염색 강도 정량화. (F>) 대조군과 TGF-β2 처리군(250 pg) 생쥐 망막에서 TGF-β2, MMP2, NLRP3 및 IL-1β의 형광 염색 강도 정량화. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다 (그룹당 N = 3개의 독립적인 생물학적 반복 실험, 동물당 1안). 통계적 유의성은 비쌍체 꼬리 t-검정을 통해 엄격하게 평가되었다; **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 (각 차량 대조군 대비). 약어: OPL, 외망막층; ONL, 외핵층; PIS, 광수용체 내절; POS, 광수용체 외절; RPE, 망막색소상피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 결막하 TGF-β2 투여 후 안구 간 대칭성 및 양측 데이터 풀링 평가. (A) Vehicle 대조군 또는 양측 결막하 TGF-β2 (500 pg/eye)를 투여받은 쥐의 왼쪽 눈 (OS, n = 5)과 오른쪽 눈 (OD, n = 5) 간의 안축장 변화 비교 분석. (B) Vehicle 대조군 또는 양측 TGF-β2 처리 (250 pg/eye)를 받은 마우스의 OS (n = 5)와 OD (n = 5) 안구 간의 해당 비교. 통계 검정 결과, 동일 처리 코호트 내에서 OS와 OD 안구 사이에 유의미한 차이가 없음이 확인되어, 양측 측정치 풀링이 안구 간 편향을 유발하지 않음이 입증되었다. 동시에, TGF-β2 처리 동물의 OS 및 OD 안구 모두 각각의 Vehicle 대조군에 비해 유의미한 안축장 연장을 나타냈다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다 (그룹당 N = 5마리 동물, 그룹당 5개의 OS 및 5개의 OD 안구). 통계적 유의성은 two-way repeated-measures ANOVA 후 Sidak의 사후 검정을 사용하여 평가하였다; *p < 0.05, ****p < 0.0001 (해당 Vehicle 대조군 대비). 약어: OS, oculus sinister (왼쪽 눈); OD, oculus dexter (오른쪽 눈). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

부록 그림 2: 결막하 TGF-β 투여 후 망막 구조적 무결성 및 전기생리학적 기능의 안전성 평가β2 투여. (A) 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 (H&대조군 및 TGF-β로 염색된 시상면 망막 횡단면β21일 차에 2를 투여한 마우스(안구당 250 pg)와 랫드(안구당 500 pg)의 결과로, 종 전반에 걸쳐 망막 층 구조가 보존되었음을 보여줌(그룹당 N = 3개의 독립적인 생물학적 반복 실험). 스케일 바 = 20 µm. (B) 21일 차 마우스에서 기록된 대표적인 암소 전정망막전도(scotopic electroretinography, ERG) 파형으로, vehicle 대조군 안구(회색 선)와 TGF-β2-처리군 안구(적색 선). 유사한 a파 및 b파 반응 역학은 보존된 망막 광반응성과 전기생리학적 안전성을 확인시켜 준다(그룹당 마우스 N = 3마리, 그룹당 안구 6개에 해당). 약어: GCL, 신경절세포층; INL, 내핵층; ONL, 외핵층. 이 파일을 다운로드하시려면 여기를 클릭하십시오.

토론

연구에서 주목할 만한 결과는 TGF-에 의해 유도된 비선형적인 역U자형 용량-반응 프로파일이다.β2로, 투여한 용량이 가장 낮은 군(250 pg/눈)에서 가장 두드러진 축성 신장이 유도되었다(그림 2B). 이러한 이중 위상적 현상은 TGF-를 포함한 많은 강력한 사이토카인 신호전달 경로의 특징이다.β 수퍼패밀리29,30. 외부에서 첨가한 TGF-의 농도가 지나치게 높을 경우β2는 수용체 포화를 유도하거나 세포 내 부정적 피드백 루프를 유발할 수 있다—억제성 SMAD 가족 구성원 7(Smad7)의 발현 증가 또는 수용체 매개 엔도사이토시스와 같음—하류 생물학적 반응을 약화시킴31,32. 면역형광 데이터는 이 약리학적 윈도우를 추가로 뒷받침한다. 마우스에서 250 pg 용량(그리고 래트에서 500 pg)은 망막 TGF-β2 보존이 동시에 강력한 하류 염증 캐스케이드를 유발함)그림 5F). 이는 최적화된 저용량 한계가 매우 민감한 생리적 범위 내에 존재함을 시사하며, 리간드 유도 탈감작 또는 국소 억제를 피하면서 표적 조직에 대한 효능을 극대화한다는 것을 의미한다.33따라서 이러한 결과는 화학 유도 근시의 재현 가능한 설치류 모델을 구축할 때 철저한 용량 적정이 필요하다는 점을 강조한다.

기존의 형태 박탈 근시(FDM) 또는 원시적 초점 이완 렌즈 유도 근시(LIM) 모델과 비교하여—맞춤형 하드웨어를 필요로 하며 렌즈 이탈, 손질 동작에 의한 분리 및 각막 합병증이 발생하기 쉬움—결막하 투여 프로토콜은 직접적인 약리학적 조절이 가능하며 장비 비용이 최소화된다13,34. 선행 연구에서 안구 주위 투여가 공막 및 망막의 TGF-β 신호전달35, 이러한 데이터는 전구부 막하에 주입한 TGF- 이후 후부 안구 구조의 생물학적 반응을 보여준다.β2회 투여 (그림 4 그리고 그림 5). 이러한 효율적인 후부 타겟팅은 소형 설치류의 독특한 안구 구조와 체액 역학에 기인한다. 설치류의 눈은 축 길이가 짧기 때문에(생쥐 약 3 mm, 흰쥐 약 6 mm) 결막하 투여 시 공막외면의 비교적 넓은 부위가 약물에 노출된다. 공막을 통한 높은 투과성과 테논하 공간의 해부학적 연속성에 의해 주사된 제제는 공막과 맥락막을 통과하여 후극부 방향으로 확산될 수 있다. 특히 중요한 점은, 이 투여 경로는 깊은 후부 테논하 주사나 유리체 내 주사 시 발생할 수 있는 안구 천공 및 시신경 손상의 심각한 위험을 피하면서도 후부 안구 조직에서 생물학적 효과를 유도할 수 있다는 것이다. 이 방법은 착용형 렌즈 사용 시 발생하는 기계적 및 행동적 간섭 요소를 회피할 수 있다.13,36, 망막박리 및 유리체강 내 주사와 관련된 안내막염의 잘 알려진 위험성도 포함된다37,38. 또한, 생체 측정을 두 차례의 짧은 세션으로 나누는 것은 기존의 단일 세션 방식을 개선한다. 장시간의 마취 노출은 종종 안구 기능 장애를 유발한다.—예를 들어 마우스의 마취성 백내장과 래트의 자발적 안검 폐쇄—굴절 및 축 길이 측정의 정확성을 저하시킨다39,40. 굴절 오차를 분리함으로써(일 –1일 및 20일)과 축장 평가(0일 및 21일)를 수행할 때, 본 프로토콜은 누적적인 눈 부담의 가능성을 최소화하고 일관된 영상 촬영 조건을 유지하도록 설계되어 실험 내 변동성을 줄이는 데 도움이 될 수 있다. 전신적 교차 오염으로 인해 발생할 수 있는 잠재적 혼란 변수를 추가로 제거하기 위해—전신 혈관 흡수 또는 비표적 조직에 영향을 미치는 림프관 운반과 같은—대조군에서 대측성 교감 반응을 포함하여 엄격한 피험자 간 설계를 적용하였다. 양측에 차량 대조제 또는 양측에 활성 rhTGF-β개체 내에서 좌우 눈을 각각 분석함으로써 이 패러다임은 양안 간 오염을 방지하면서도 강력한 약리학적 평가를 보장한다. 일관되게, 쌍을 이룬 왼쪽 및 오른쪽 눈에 대한 개별 생체 측정 분석을 통해 높은 양안 대칭성이 확인되었으며, 이는 치료 집단 간에 양안 데이터를 통합하더라도 통계적 또는 생리학적 편향이 유발되지 않았음을 입증한다.보충 그림 1).

이 설치류 모델은 TGF-β2–저자들이 이전 연구에서 규명한 염증 유도 및 기질 재형성 축 수컷 원숭이와 브라운 노르웨이 쥐에서21,41. 저자들의 이전 연구에 따르면, 외부에서 공급한 TGF-β 또는 TGF-β2배 증폭된 유리체 내 염증—특히 NF-κB 및 IL-1β 활성화—MMP2 발현을 상향조절하고 공막의 콜라겐 I를 고갈시키며 축상 길이 증가를 유도함42,43반대로, 보체 분해 촉진 인자(CD55)를 통해 보체 및 인플라마좀 활성을 억제하면 국소 염증과 근시 진행 모두가 억제되었다.41,44만성 염증 반응의 유사한 특징으로, MMP2 활성화 증가 및 이후 콜라겐 I 손실이 나타나는 현상은 전형적인 형태 박탈 모델과 병적 고도 근시 환자에서도 명확히 관찰된다.42,43,45,46중요하게도, TGF-는 모든 조직 전반에 걸쳐 고립적이거나 보편적인 일차 유도인자로 균일하게 작용하는 것이 아니라,β (특히 TGF-β2 아이소폼)은 상황에 따라 달라지는 신호 전달 브리지 역할을 한다. 이는 초기 단계의 망막/망막색소상피(RPE) 염증 신호 전달을 연결한다.—특히 NLRP3 인플라마좀 및 보체 활성화를 매개로 하여—후속 결막 하부 세포외기질(ECM) 작용21,41. 이와 같은 공간적-시간적 전이를 인식하면 TGF-에 관한 문헌상의 명백한 불일치를 해결할 수 있다.β 발현은 망막/RPE에서 초기 국소 염증 증폭 단계와 후기의 스클레라에서 MMP 매개 기질 분해 단계 사이에서 그 동역학이 변화함47,48. 구체적으로 말하면, 공막 ECM의 분해라는 구조적 과정이 궁극적으로 눈의 물리적 신장을 결정한다(그림 4), 분자적 소견은 외부 망막과 망막색소상피(RPE)를 주요 상류 신호 발생 원으로 강조한다(그림 5). 여기서 본 연구는 정량적 면역형광법(IF)을 전적으로 이용하여 이들 마커의 생체 내 공간 분포 및 층별 상향 조절을 지도화하였으나, 망막 내 인산화된 핵인자 카파 B(p-NF-κB)/IL-1β종양괴사인자-알파(TNF-α)/NLRP3 신호 경로는 동일한 TGF-β이전 연구에서 저자들에 의해 2가지 유도 양식이 독립적으로 확립되었다46,49. 결막하 TGF-β2는 NLRP3/IL-1을 활성화한다β–망막/RPE 내의 MMP2 캐스케이드는 망막-맥락막-공막 축을 따라 전파되어 하류의 공막에서 MMP2 발현과 기질 재형성을 유도한다. 이러한 유사성들은 낮은 수준의 염증과 MMP 매개 공막 세포외기질(ECM) 재형성이 눈의 가속 성장에 핵심적인 역할을 한다는 점을 강력하게 뒷받침한다.

이러한 절차상의 장점에도 불구하고, 현재의 프로토콜에는 고려해야 할 몇 가지 제한점이 있다. 첫째, 외인성 사이토카인 투여에 의해 유도되는 순수한 약리학적 모델로서, 이 접근법은 전통적인 형태 박탈 근시(FDM) 또는 렌즈 유도 근시(LIM) 모델에서 특징적으로 나타나는 광학적 초점 불일치 및 망막에서 공막으로의 빛 신호 전달 경로를 우회한다.16,50따라서, 하류 생화학적 캐스케이드를 표적화하는 데 매우 적합함—특히 염증성 MMP2 리모델링 축—상위 시각 정보 처리나 광학적 조작을 연구하는 모델을 대체하는 것이 아니라, 이러한 모델과 보완적인 관계에 있다51둘째, 결막하 주사는 전신 독성과 유리체 내 주사의 위험을 피할 수 있지만, 반복적인 미세 주사(3주 동안 매주 1회)가 필요하다는 점에서 일시적인 국소 기계적 자극과 짧은 기간의 마취제 노출이 발생할 수 있으며, 이를 철저히 시행하지 않을 경우 눈 표면의 항상성에 미세하게 영향을 줄 수 있다.38,52. 이 경로를 통한 실험성 근시의 재현 가능한 유도는 결막하 투여 시 정밀한 기술적 시행에 크게 의존한다. 성공의 주요 기술적 결정 요소는 눈꺼풀 결막 아래로 적절한 얕은 각도로 바늘을 삽입하여 국소적이고 경계가 명확한 점막하 수포(chemosis)를 형성하는 것이다. 즉시 광투과 검사를 통해 액체가 조직 평면 내에 머무르는지 확인함으로써 망막 천공, 심부 안와로의 액체 누출 또는 미세혈관 절단을 예방할 수 있다. 주사 후 액체의 역류나 활성 누출을 방지하기 위해—효과적인 약리학적 투여를 저해하는 일반적인 실패 양상—마이크로 니들을 투여 후에는 시각적 조절 하에 천천하고 일정한 속도로 빼내기 전에 5초 동안 그 자리에 유지해야 한다. 빠져나올 때 즉각적인 역류, 충분하지 않은 블렙 높이, 또는 실수로 조직 출혈이 발생하는 경우, 혼란을 유발하는 변동성을 피하기 위해 사전에 명시된 기준에 따라 동물들을 기록하고 제외해야 한다. 이러한 엄격한 기술적 기준을 준수함으로써 눈 표면 손상을 최소화하면서도 높은 정확도로 후부에 약물을 유지시킬 수 있다. 또한, 쥐 모델에서의 절대 굴절 상태(예: 쥐에서 -1.58 D, 쥐에서 -1.38 D)가 기본 굴절력에 비해 다소 낮아 보일 수 있으나, 대조군에 비해 유의미한 근시성 변화가 나타났다(쥐에서 +3.83 D, 쥐에서 +1.69 D; 모두 p<0.05). < 0.05)이며, 두 종 모두에서 구조적 축상 신장과 하류의 공막 MMP2 발현 증가와 엄격히 일치하였다. 중요하게도, 안전성 및 생리적 내용성 평가를 통해 이 저용량 결막하 투여 방식의 비세포독성 특성이 확인되었다. 조직학적 단면 이미지(H&E) 마우스와 래트 모두에서 잘 보존된 망막 층 구조를 나타내었으며, 생후 21일째의 암순응 전기망막검사(ERG)에서는 잠복기 지연이나 진폭 저하 없이 a-파와 b-파 반응이 유지되는 것을 확인하였다(보충 그림 2), 국소화된 TGF-β2회 투여는 구조적 망막병증이나 전기생리학적 손상을 유발하지 않으면서도 표적화된 축상 신장을 유도한다. 세 번째로, 3주 시점의 평가를 통해 급성에서 아급성 염증 반응과 기질 재형성을 확인할 수 있으나, 이러한 표현형 변화가 치료 후에도 지속되는지 또는 약물 제거 후 회복 역학을 보이는지 판단하기 위해서는 장기 연구가 필요하다.41,53마지막으로, 외인성 TGF-의 직접적인 약물동력학 및 안구 조직 침투 분석이 제한적이기는 하지만β2는 본 모델 검증 연구의 범위를 벗어나지만, 축 장축화 및 굴절 이상 변화와 같은 강건하고 일관된 생체측정 변화와 더불어 저자들이 이전 연구에서 확인한 특정 망막/RPE 분자 활성화46,49, 후안구 구조에서 효과적인 생물학적 작용을 지원한다. 향후 연구에서는 추가적인 단백질 발현 프로파일링(예: 웨스턴 블롯팅), RT-qPCR 또는 형광 태그가 부착된 TGF-β2 추적은 그 정확한 조직 분포와 제거 동역학을 더욱 명확히 밝혀줄 것이다. 이러한 한계점을 인식하는 것은 연구자들이 적절한 치료제 스크리닝 및 기전 검증을 위해 이 모델을 선택하는 데 있어 방향을 제시할 것이다.

결막하 TGF-β2는 NLRP3/IL-1을 활성화한다β–브라운 노르웨이 쥐와 C57BL/6 마우스의 외층 망막 및 망막색소상피(RPE)에서 MMP2 축을 분석함으로써, 본 프로토콜은 이러한 염증 경로 및 기질 재형성 경로가 설치류 종을 통해 보존되어 있음을 약리학적으로 입증하는 체계를 제공한다. 따라서 TGF-β2–유도 모델은 축성 신장을 유도하기 위한 표준화된 플랫폼으로서, 망막-공막 신호 전달 경로를 분석하고 TGF-를 표적으로 하는 전임상 중재를 스크리닝하는 데 신뢰할 수 있는 수단을 제공한다.β2, 보체 성분, 인플라마좀, 또는 MMP2.

공개 사항

저자들은 본 연구와 관련하여 공개하거나 선언할 이해관계 또는 이해상충이 없음을 밝힙니다. 원고 작성 과정에서 AI 기반 언어 도구는 문법 수정 및 영어 구문 개선 목적으로만 사용되었습니다. 데이터 수집, 이미지 처리, 정량 분석 또는 도표 작성에는 생성형 AI 도구가 사용되지 않았습니다.

감사의 글

Experiments and data analysis were performed in part through the use of the Medical Research Core Facilities, Office of Research & Development, at China Medical University, Taichung, Taiwan, R.O.C. The authors sincerely thank the National Center for Biomodels (NCB, NIAR, Taiwan) and BioLASCO Taiwan Co., Ltd. for their exceptional technical support in contract breeding and animal supply services. Additionally, the schematic architecture and microsurgical procedures illustrated in Figure 1 were designed and custom-tailored using high-resolution vector assets from Mind the Graph (mindthegraph.com, Premium License) and were professionally compiled and refined utilizing Affinity Designer (Serif Europe Ltd.). Research funding was provided in part by the National Science and Technology Council, Taiwan, R.O.C. (NSTC-112-2314-B-039-029; 115-2320-B-039-056), China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan (DMR-114-091; DMR-115-117), and China Medical University, Taichung, Taiwan (CMU114-MF-78; CMU-114-ASIA-10). The funders had no role in the study design, data collection and analysis, the decision to publish, or preparation of the manuscript. The sponsor or funding organization had no role in the design or conduct of this research.

재료

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이름회사카탈로그 번호댓글
자동 적외선 광굴절계StriaTech GmbH (Tü빙엔, 독일)ST-PR.01마우스/랫트 종 특이적 프리셋 포함
평형염 용액 (BSS)Alcon Laboratories, Inc. (미국 포트워스)입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주시기 바랍니다.멸균 안구 내 세척액
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)A3059동결건조 분말, 0.1% 분획 V
Brown Norway (BN) 랫드BioLASCO Taiwan Co., Ltd. 및/또는 국립바이오모델센터(National Center for Biomodels)브라운 노르웨이 랫(Brown Norway Rats) 브라운 노르웨이 랫은 전 세계적으로 가장 널리 사용되는 실험용 랫 계통 중 하나입니다. 이 계통은 온순한 성격과 뛰어난 생식 능력을 갖추고 있어 다양한 생물 의학 연구에 매우 적합합니다. 주요 특성: - 성격: 매우 온순하고 다루기 쉬워 연구자와의 상호작용이 원활하며, 이는 스트레스 감소와 실험 결과의 신뢰성 향상으로 이어집니다. - 생식력: 높은 번식률과 효율적인 번식 능력을 갖추고 있어 대규모 연구를 위한 개체군 확보가 용이합니다. - 유전적 안정성: 일관된 유전적 배경을 가지고 있어 실험 데이터의 재현성이 높습니다. 주요 활용 분야: - 신경과학 및 행동 연구: 온순한 기질 덕분에 학습, 기억 및 행동 분석 연구에 널리 활용됩니다. - 대사 질환 및 내분비 연구: 당뇨, 비만 및 기타 대사성 질환 모델 연구에 적합합니다. - 약리학 및 독성학: 신약 스크리닝 및 약물 효능 및 안전성 평가를 위한 표준 모델로 사용됩니다. - 면역학 및 염증 연구: 다양한 면역 반응 및 염증성 질환 모델링에 사용됩니다. 제공 서비스: - 엄격한 품질 관리: 모든 개체는 표준화된 사육 환경에서 관리되며, 철저한 건강 모니터링을 통해 무균 및 병원균-부재(SPF) 상태를 유지합니다. - 다양한 연령 및 성별 제공: 연구 목적에 맞게 다양한 주령의 수컷 및 암컷 랫을 제공합니다. - 맞춤형 주문: 특정 실험 설계에 따른 대량 주문 및 정기 공급이 가능합니다.
C57BL/6 (B6) 마우스BioLASCO Taiwan Co., Ltd. 및/또는 국립생체모델연구센터(National Center for Biomodels)**1. 실험동물** **1.1. 표준 실험동물** 본 센터에서는 국제적으로 공인된 표준 실험동물을 제공하고 있습니다. **1.2. 제공 품종** - **마우스 (Mouse):** C57BL/6, BALB/c, ICR 등 - **랫드 (Rat):** SD (Sprague Dawley), Wistar 등 - **기타:** 연구 목적에 따른 특수 품종 (별도 문의) **1.3. 관리 및 품질 보증** 모든 실험동물은 엄격한 SPF(Specific Pathogen Free, 특정 병원체 부재) 환경에서 관리되며, 정기적인 건강 모니터링을 통해 최상의 생물학적 상태를 유지하고 있습니다. **1.4. 주문 및 공급 절차** - **주문:** 웹사이트 내 신청서 작성 또는 공식 요청 서신 제출 - **심의:** 동물실험윤리위원회(IACUC)의 승인서 확인 후 공급 - **인도:** 지정된 일시에 지정된 장소로 운송 또는 직접 수령&nid=3&페이지=0&유형=1
DAPI 용액 (1 mg/mL)Thermo Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)62248면역형광염색을 위해 1:500의 작동 희석 배율로 사용되었습니다.
무수 에탄올 (≥99.5%)J.T.Baker (Avantor Performance Materials, Radnor, USA)제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.시약 등급, 세척용 75%, 20%–탈수를 위한 100% 농도
Fiber-Lite 조명기 (150W, 듀얼 구스넥)Stoelting Co. (미국 우드데일)해당 사항 없음고강도 광원
미세 팁 마이크로포셉Stephens Instruments (Lexington, USA)S5-1375직선형, 톱니형, 가이드 핀 포함
긴폴 점안 겔Winston Medical Supply Co., Ltd. (대만 타이난)제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.카보머 0.2%, 각막 보호
글리세롤 (분자생물학용, ≥99.0%)Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)G5516시약 등급, 50% 작동 매트릭스
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor Plus 555Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)A32732면역형광법을 위해 1:800의 작동 희석 배율로 사용되었습니다.
휴대용 다종 망막전위도 측정 시스템 (HMSERG)OcuScience (미국 헨더슨)Model 2000 (HMsERG-2000), ERGView 소프트웨어가 탑재된 설치류용 전면 플래시 망막전위도(ERG) 시스템.
하트만′고정액 (Davidson 고정액)Sigma-Aldrich (미국 세인트루이스)H0290안구 기하학적 구조를 위한 신속 고정 칵테일
고주파 초음파 프로브ASUSTeK Computer Inc. (대만 타이베이)LU710LH휴대용, 16 MHz 주파수
미세주입 바늘 (33-G)Hamilton Company (Reno, USA)7803-05포인트 스타일 4, 얕은 베벨 각도
미세주입 주사기(10 µL)Hamilton Company (Reno, USA)80014 (#1701)기밀 마이크로리터 주사기
Mydrin-P 점안액Santen Pharmaceutical Co., Ltd. (일본 오사카)제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주세요.0.5% 트로피카미드 / 0.5% 페닐에프린
정상 염소 혈청Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (미국 웨스트 그로브)005-000-121면역형광법을 위한 10% 블로킹 용액으로 사용됨.
광굴절 측정 데이터 수집 소프트웨어StriaTech GmbH (Tü빈겐, 독일)제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.자동화된 평균 구면 등가치 처리
토끼 항-IL1 베타 단클론 항체 (HL1421)GeneTex, Inc. (Irvine, USA)GTX636887면역형광염색을 위해 1:500의 작동 희석 배율로 사용하였습니다.
토끼 항-MMP2 다클론 항체GeneTex, Inc. (USA, Irvine)GTX104577면역형광염색을 위해 1:500의 작동 희석 배율로 사용되었습니다.
토끼 항-NLRP3 다클론 항체Abcam (Cambridge, UK)ab214185면역형광염색을 위해 1:400의 희석 배율로 사용하였습니다.
토끼 항-TGF-beta 2 다클론 항체AbboMax, Inc. (미국 산호세)500-3784면역형광염색을 위해 1:250의 작동 희석 배율로 사용하였습니다.
재조합 인간 TGF-β1PeproTech (Thermo Fisher Scientific, Cranbury, USA)100-21동결건조 분말, 고순도
재조합 인간 TGF-β2PeproTech (Thermo Fisher Scientific, Cranbury, USA)100-35동결건조 분말, 고순도
재조합 인간 TGF-β3PeproTech (Thermo Fisher Scientific, Cranbury, USA)100-36동결건조 분말, 고순도
멸균 Aquasonic 100 초음파 젤Parker Laboratories, Inc. (Fairfield, USA)해당 사항 없음표준 음향 결합 매트릭스
초음파 영상 소프트웨어ASUSTeK Computer Inc. (대만 타이베이)제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다.실시간 B-스캔 시각화 및 캘리퍼스 측정용

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