본 연구에서는 엽산 의존적 포름산 제거(formate clearance)를 감소시키도록 설계된 메토트렉세이트(methotrexate) 전처치 메탄올 중독 쥐 모델을 사용하여 에탄올과 포메피졸(fomepizole)의 신장 보호 효과를 비교하였습니다. 신장 결과는 신장 기능 측정치, 신장 손상 바이오마커, 염증 마커, 산화환원 관련 바이오마커 및 조직병리학적 소견을 통해 평가되었습니다.
이 논문에서
요약
초록
메탄올 중독은 대사성 산증, 장기 손상 및 사망을 유발하며, 신장 손상은 불량한 예후를 예측합니다. 메토트렉세트로 전처리한 메탄올 중독 쥐 모델에서 에탄올과 포메피졸을 비교하였습니다. 30마리의 수컷 Wistar 쥐를 대조군, 메토트렉세스(MTX)군, MTX + 메탄올군, MTX + 메탄올 + 포메피졸군, MTX + 메탄올 + 에탄올군의 5개 그룹으로 나누었습니다(그룹당 n = 6). MTX를 1~7일차에 0.3 mg/kg/day로 경구 투여하였습니다. 메탄올에 노출된 세 그룹에는 8일차에 3 g/kg의 메탄올을 경구 투여하였습니다. 포메피졸은 메탄올 투여 4시간 후에 15 mg/kg을 복강 내 투여하였고, 이후 12, 24, 36시간에 10 mg/kg씩 투여하였습니다. 에탄올은 메탄올 투여 4시간 후에 0.5 g/kg을 1회 경구 투여하였습니다. 샘플은 10일차에 수집하였습니다. 전향적으로 지정된 일차 결과 지표는 없었습니다. 신기능, 신장 균질물 손상, 염증성 바이오마커, 혈액 유래 산화환원 관련 바이오마커 및 조직병리학적 소견을 평가하였습니다. 분산 분석(ANOVA) 결과, 신장 균질물의 cystatin C (p = 0.003), interleukin-6 (IL-6; p = 0.013), kidney injury molecule-1 (KIM-1; p = 0.017), 혈청 요소 (p = 0.017), 혈청 크레아티닌 (p < 0.001)에서 유의미한 그룹 간 차이가 나타났습니다. Duncan 사후 검정 결과, 두 해독제 투여군 모두 MTX + 메탄올군보다 이러한 파라미터 수치가 낮았습니다. 두 해독제 투여군 간의 유의미한 생화학적 차이는 발견되지 않았습니다. 조직병리학적 점수는 해독제 투여군에서 더 낮았습니다. 포메피졸이 더 유리한 기술적 양상을 보였으나, 이 결과가 에탄올보다 우월하다는 것을 입증하지는 않습니다. 분산의 불균일성, 다중 검정, 서로 다른 해독제 처방, 독성동태학 및 산-염기 측정의 부재, 짧은 추적 관찰 기간이 해석을 제한합니다. 향후 연구에는 메탄올과 포르메이트의 직접 측정, 신장 세포질 알코올 탈수소효소 활성, 신장 생화학적 결과와의 상관관계, 더 긴 추적 관찰 기간 및 비교 가능한 해독제 처방이 포함되어야 합니다.
서론
메틸 알코올(메탄올) 중독은 전 세계적으로 상당한 이환율과 사망률을 초래하는 주요 독성 응급 상황이며, 특히 불법 또는 무허가로 제조된 주류 섭취 후에 빈번하게 발생합니다. 메탄올 자체의 독성은 비교적 낮지만, 주로 간에서 알코올 탈수소효소(ADH)에 의해 포름알데히드로 대사된 후 다시 포름산으로 대사됩니다. 이로 인해 축적된 포름산염은 음이온 차이가 큰 대사성 산증, 시신경 병증 및 다기관 손상을 유발할 수 있습니다1,2. 포름알데히드는 수명이 짧은 중간체인 반면, 포름산염의 축적은 미토콘드리아 시토크롬 산화효소 억제, 세포 저산소증 및 산화 스트레스를 통해 독성을 일으키는 주요 원인으로 간주됩니다 3. 조기 진단, 대사성 산증 교정, 해독제 치료 및 혈액 투석은 사망률을 낮추기 위한 주요 치료 방법입니다2.
메탄올 중독 시, 임상 증상은 일반적으로 잠복기 후에 뚜렷하게 나타납니다. 메스꺼움, 구토, 복통 및 가벼운 중추신경계 억제 증상이 나타난 후, 고음이온차 대사성 산증, 호흡 곤란, 정신 상태 변화 및 시각적 증상이 뒤따를 수 있습니다1,2. 시야 흐림, 광공포증, 산동, 시신경 유두 부종, 그리고 심한 경우 영구적 실명은 포름산으로 인한 미토콘드리아 시토크롬 산화효소 억제와 관련된 가장 특징적인 독성 효과 중 일부입니다1,2. 현재의 치료 전략으로는 보존적 치료, 중탄산나트륨을 이용한 대사성 산증 교정, 폴리닉산 또는 엽산 보충, 에탄올 또는 포메피졸을 이용한 알코올 탈수소효소 억제, 그리고 선택적인 중증 사례의 경우 메탄올과 포름산의 제거를 가속화하기 위한 혈액 투석이 포함됩니다3,4. 포메피졸은 보다 예측 가능한 약동학, 단순한 용법, 그리고 낮은 부작용 위험 덕분에 점점 더 1차 선택 해독제로 간주되고 있습니다. 하지만 에탄올은 접근성이 좋고 비용이 저렴하기 때문에 여전히 중요한 대안으로 남아 있습니다4,5,6,7.
전통적으로 시신경 및 중추신경계 손상이 메탄올 독성의 주된 증상으로 간주되어 왔으나, 최근에는 신장이 임상적으로 유의미한 표적 기관임이 점점 더 많이 인식되고 있습니다8,9,10. 메탄올 특이적 코호트에서 급성 신손상(AKI)은 더 심각한 대사성 산증, 호흡 부전, 다장기 부전, 기계적 환기, 체외 치료, 더 긴 입원 기간 및 더 높은 원내 사망률과 연관이 있는 것으로 나타났으며; 체액 부족, 패혈증, 횡문근융해증 및 급성 췌장염 또한 AKI 발생과 관련된 요인으로 확인되었습니다8,10. Chang 등이 보고한 코호트의 다변량 분석에서 AKI는 원내 사망률과 독립적인 연관성을 유지했습니다. 하지만 후향적 관찰 설계의 특성상 AKI 자체가 사망을 유발했다고 단정할 수는 없습니다8. 따라서 AKI는 메탄올 중독 시 질병의 중증도가 더 높고 예후가 더 나쁨을 나타내는 지표로 해석되어야 합니다. 이와 대조적으로, Wang 등의 체계적 문헌고찰에서는 주로 메탄올과 에틸렌글리콜을 포함한 독성 알코올 중독 후의 신장 결과를 더 광범위하게 평가했으므로, 그 결론이 메탄올에만 국한된 것은 아닙니다9. 해당 문헌고찰에서는 상당한 단기 사망률과 더불어 장기적인 신장 회복, 지속적인 투석 및 표준화된 신장 결과 보고와 관련하여 중요한 근거 공백이 있음이 확인되었습니다9.
메탄올 독성과 AKI 사이의 관계는 다요인적일 가능성이 높습니다. 독성 대사산물의 축적은 미토콘드리아 억제, 세포 저산소증, 심각한 대사성 산증 및 산화환원 불균형을 통해 기여할 수 있으며, 체액 부족, 혈역학적 손상, 횡문근융해증, 패혈증, 호흡 부전 및 다장기 부전을 포함하여 임상 코호트에서 기록된 전신적 요인들이 추가적인 신장 손상을 유발할 수 있습니다1,2,3,8,10. 이러한 경로들은 메탄올 중독과 신장 손상 사이의 생물학적 및 임상적으로 타당한 연결 고리를 제공합니다. 신장의 대사 장애는 혈중 formate 노출, 미토콘드리아 억제, 대사성 산증 및 전신 혈역학적 스트레스로 인해 발생할 수 있습니다. 그러나 본 연구에서는 메탄올, formaldehyde 및 formate 농도, 신장 ADH 활성 및 미토콘드리아 기능을 직접 평가하지 않았기 때문에, 신장 조직 내 알코올 및 알데하이드 대사의 구체적인 기여도는 여전히 불분명합니다.
메탄올 독성에 관한 실험 연구에서 주요한 방법론적 과제는 쥐가 인간보다 포름산을 더 빠르게 대사한다는 점입니다. 인간의 메탄올 독성에서는 포름산의 축적이 주요 결정 요인이지만, 쥐는 엽산 의존적 포름산 대사 효율이 매우 높아 이와 유사한 수준의 축적과 그로 인한 장기 손상을 유도하기가 더 어렵습니다. 따라서 메탄올 독성 실험 모델에서는 엽산 대사를 억제하는 약물이 자주 사용됩니다11,12. 쥐의 엽산 의존적 포름산 제거율을 낮추어 메탄올 독성에 대한 민감도를 높이기 위해 Methotrexate (MTX) 전처리가 사용되었습니다11,12. Methotrexate 자체가 메탄올 독성을 유발하는 것은 아니며, 이 모델이 인간의 메탄올 중독의 모든 양상을 재현하는 것도 아닙니다. Methotrexate가 신장, 산화 및 염증 결과에 독립적으로 영향을 미칠 수 있으므로, 전처리와 관련된 변화를 특성화하기 위해 MTX 단독 투여군을 포함하였습니다. 이러한 제한 사항 내에서, 본 모델은 동일한 methotrexate 전처리와 메탄올 노출 프로토콜을 적용받은 실험군 간의 신장 결과 패턴을 비교하고, 이를 생화학적, 염증성, 산화적 및 조직병리학적 수준에서 평가할 수 있는 통제된 전임상 플랫폼을 제공합니다.
알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)의 억제는 메탄올 중독의 해독 치료에서 핵심적인 역할을 합니다. 임상 현장에서 이 목적으로 가장 흔히 사용되는 두 가지 약제는 에탄올과 포메피졸(fomepizole, 4-methylpyrazole)입니다. 에탄올은 메탄올보다 ADH에 대한 친화력이 더 높기 때문에 독성 대사물질의 형성을 경쟁적으로 억제하며, 강력하고 선택적인 ADH 억제제인 포메피졸은 메탄올이 폼알데히드와 포름산으로 전환되는 것을 직접적으로 차단합니다5,6. 하지만 이 두 해독제의 상대적인 임상적 효능, 안전성, 투여 편의성 및 장기 보호 효과에 대해서는 아직 완전한 합의가 이루어지지 않았습니다. 포메피졸은 표준화된 투여 용량, 혈청 농도 모니터링의 불필요함, 중추신경계 억제 증상의 부재, 그리고 더 예측 가능한 약동학적 특성 덕분에 많은 의료 센터에서 유리한 것으로 간주되는 반면, 에탄올 요법은 저혈당, 간독성, 정신 상태 변화 및 집중적인 모니터링 필요성과 같은 잠재적인 단점이 수반됩니다6,7. 반대로, 대규모 임상 비교 연구에서는 두 해독제가 사망률과 임상 결과에 미치는 영향이 유사할 수 있음을 시사했습니다. 대량 중독 사례를 평가한 Zakharov 등의 연구에서는 포메피졸과 에탄올 간에 생존율의 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다5.
메탄올 중독에서 AKI의 예후적 중요성에도 불구하고8,9,10, 신장 손상은 안구 및 신경 독성에 비해 상당히 덜 주목받아 왔으며, 에탄올과 포메피졸의 상대적인 신장 영향은 여전히 충분히 규명되지 않은 상태입니다. 따라서 두 가지 해독 전략이 서로 다른 신장 결과 패턴과 연관되어 있는지 확인하기 위해, 전통적인 신장 기능 검사, 조기 세뇨관 손상 바이오마커, 염증성 사이토카인, 산화환원 관련 파라미터 및 조직병리학을 포함하는 신장 중심의 평가가 필요합니다. 또한, 이 제어된 methotrexate 전처치 쥐 모델은 정의된 실험 조건 하에서 후보 해독제, 신장 표적 및 보조적 중재 방법의 전임상 평가를 용이하게 할 수 있습니다. 이 모델의 연구 가치는 인간 메탄올 중독의 임상적 및 대사적 복잡성을 직접 재현하는 것이 아니라, 급성 실험 설정 내에서 비교 평가를 수행하는 데 있습니다.
설치류와 인간 사이의 메탄올 대사 차이와 더불어, 엽산 의존적 포름산 제거를 감소시키기 위한 약리학적 전처리의 사용은 여전히 중요한 방법론적 제한점으로 남아 있습니다. 또한, 실험 조건 하에서 유도된 급성 독성은 임상 실무에서 접하는 다양한 노출 기간과 동반 질환을 완전히 반영하지 못할 수 있습니다. 따라서, 본 동물 모델의 결과는 예비 전임상 증거로 간주되어야 하며, 인간의 치료 결정을 직접적으로 뒷받침하는 데 사용되어서는 안 됩니다. 임상적 추론을 내리기 전에는 적절하게 설계된 임상 연구를 통한 확인이 필요합니다. 이러한 배경에서, 핵심적인 지식 공백은 메토트렉세이트 전처리 쥐 모델에서 에탄올과 fomepizole이 일반적인 신기능 측정치, 세뇨관 손상 바이오마커, 염증성 사이토카인, 산화환원 관련 파라미터 및 조직병리학적 소견에 걸쳐 서로 다른 신장 결과 패턴과 연관되어 있는지 여부입니다. 연구 가설은 에탄올 또는 fomepizole 중 어느 하나로 알코올 탈수소효소를 억제하면 신장 손상이 완화될 것이며, 평가된 결과 영역에 따라 치료제 간에 잠재적인 차이가 있을 것이라는 점이었습니다. 신장 보호는 MTX + Methanol 군보다 더 유리한 신장 결과 패턴을 보이는 것으로 조작적으로 정의되었습니다. 이 패턴은 더 낮은 혈청 urea 및 creatinine 농도, 더 낮은 신장 내 kidney injury molecule-1 (KIM-1), cystatin C, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) 및 interleukin-1 beta (IL-1β) 수준, 더 낮은 혈청 malondialdehyde (MDA) 농도, 더 높은 혈청 superoxide dismutase (SOD) 활성, 혈중 reduced glutathione (GSH) 수준 및 혈중 catalase (CAT) 활성, 그리고 세뇨관 변성, 세뇨관 괴사, 사구체 손상, 혈관 충혈, 간질성 염증 및 섬유화에 대한 더 낮은 조직병리학적 점수를 포함합니다. 신장 보호는 단일 합성 점수로 계산되지 않았으며, 대신 이러한 상호 보완적인 영역 전반에 걸쳐 개별 결과들을 종합적으로 평가하였습니다. 이에 따라, 본 연구는 이 모델에서 에탄올과 fomepizole이 신기능, 세뇨관 손상, 염증, 산화환원 상태 및 신장 조직병리학에 미치는 영향을 비교하는 것을 목표로 하였습니다.
프로토콜
모든 실험 절차는 Kırşehir Ahi Evran University 동물 실험 지역 윤리 위원회(승인 결정 번호 1, 회의 번호 12, 승인 날짜: 2025년 6월 12일)의 승인을 받았으며, 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 국내외 가이드라인에 따라 수행되었습니다. 연구 전 과정 동안 통증과 고통을 최소화하고 필요한 최소한의 동물만을 사용하기 위한 조치가 취해졌습니다.
화학 물질 준비
실험적 메탄올 독성 모델의 확립을 용이하게 하기 위해 전처치제로 Methotrexate를 사용하였다. 쥐의 엽산 의존성 포름산 산화가 인간보다 더 효율적이기 때문에, 포름산 제거를 줄이고 메탄올 독성에 대한 민감도를 높이기 위해 Methotrexate 전처치를 수행하였다. 이는 메탄올 노출의 대용제가 아니라 모델 민감화 중재로 사용되었다11,12. Methotrexate는 500 mg/5 mL 제형으로 공급되었으며, 이는 100 mg/mL의 스톡 농도에 해당한다. 해당 제형을 멸균된 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석하여 최종 작동 농도 0.06 mg/mL를 얻었다. 작동 용액은 5 mL/kg의 용량으로 경구 투여(oral gavage)되었으며, 이는 MTX 용량 0.3 mg/kg에 해당한다. 연구 시작 시 체중이 200–220 g인 쥐의 경우, 일일 투여량은 동물당 1.00에서 1.10 mL 범위였으며 연구 시작 시 기록된 체중을 이용하여 개별적으로 계산하였다. 7일간의 MTX 전처치 기간 동안 체중을 다시 측정하지 않았다. Methotrexate는 7일 연속(연구일 1–7일)으로 1일 1회 투여하였으며, MTX 전처치 프로토콜 완료 후 연구일 8일에 메탄올을 투여하였다. 이 요법은 이전에 발표된 경구 투여 MTX 전처치 모델과 일치한다13.
메탄올(순도 ≥99.8%)은 투여 당일 멸균 증류수로 희석하여 20% (v/v) 수성 작업 용액으로 새로 조제하였다. 작업 용액은 메탄올 1부피와 멸균 증류수 4부피를 혼합하여 조제하였다. 이전에 기술된 methotrexate 전처리를 거친 메탄올 중독 쥐 모델에 따라, 연구 8일차에 그룹 3-5에 메탄올 3 g/kg을 단회 경구 투여하였다. 메탄올 투여 전 음식이나 물의 제한은 두지 않았다. 필요한 투여량은 각 동물의 체중을 기준으로 개별적으로 계산되었으며, 20% 메탄올 용액의 경우 약 18.9 mL/kg이었다. 체중이 약 220 g인 쥐의 경우, 이 용량은 메탄올 0.66 g에 해당하며 최종 경구 투여 부피는 약 4.2 mL였다. 이러한 메탄올 노출 regimen은 이전에 발표된 methotrexate 전처리를 거친 급성 메탄올 독성 쥐 모델과의 비교 가능성을 유지하기 위해 선택되었다13,14,15.
fomepizole 작업 용액은 멸균 0.9% sodium chloride 용액에서 최종 농도가 10 mg/mL가 되도록 조제하였다. 메탄올 투여 4시간 후에 15 mg/kg의 부하 용량을 복강 내 투여하였으며, 이후 12, 24, 36시간에 10 mg/kg의 유지 용량을 복강 내 투여하였다. 10 mg/mL 작업 농도에서 투여 부피는 부하 용량의 경우 1.5 mL/kg, 각 유지 용량의 경우 1.0 mL/kg였다. 연구 시작 시 체중이 약 220 g인 쥐의 경우, 이 용량은 부하 용량 약 0.33 mL 및 각 유지 용량 약 0.22 mL에 해당하였다. 모든 투여 부피는 연구 시작 시 기록된 체중을 사용하여 계산하였다. fomepizole 부하 및 유지 용량은 기established된 메탄올 중독 치료 권고 사항1,6을 참조하여 선정하였다.
에탄올을 해독제 대조군 처리제로 사용하였다. 절대 에탄올(순도 ≥99.8%) 1부피를 멸균 증류수 4부피와 혼합하여 희석함으로써 최종 농도가 20% (v/v)인 수성 작업 용액을 제조하였다. 메탄올 투여 4시간 후, 에탄올 0.5 g/kg을 1회 경구 투여(oral gavage)하였으며, 유지 용량의 에탄올은 투여하지 않았다. 투여 부피는 약 3.2 mL/kg였다. 연구 시작 시 체중이 약 220 g인 쥐의 경우, 이는 최종 경구 투여 부피 약 0.70 mL에 해당하였다. 투여 부피는 연구 시작 시 기록된 체중을 사용하여 계산하였다. 에탄올의 농도, 용량, 투여 경로 및 투여 시점은 에탄올을 해독제 대조군으로 사용한 기존의 methotrexate 전처리 쥐 모델 문헌13,14을 기반으로 선정하였다.
모든 용액은 투여 당일에 새로 조제하였으며, 외관상 균질한지 및 가시적인 입자 물질이 없는지 확인하였다. 경구 투여는 스테인리스 스틸 가바지 캐뉼라(gavage cannula)를 사용하여 수행하였다. 가바지 과정 중 캐뉼라를 구강에서 식도로 조심스럽게 진입시켰으며, 역류, 구강 유출, 흡인 및 호흡 곤란이 발생하지 않도록 주의하였다. 복강 내 주사는 멸균 일회용 주사기와 바늘을 사용하여 무균 조건 하에 수행하였다. 화학 물질의 조제 및 투여와 관련된 모든 절차는 기관의 실험실 안전 규정에 따라 수행되었다.
실험 동물, 사육 조건 및 무작위 배정
터키 크르셰히르(Kırşehir) Ahi Evran 대학교 실험 동물 연구소에서 8–12주령, 체중 220 ± 20 g의 성체 수컷 Wistar albino 랫드 총 30마리를 분양받았다. Wistar 랫드는 실험적 독성 및 신장 보호 연구에 널리 사용되어 왔으며, 기존에 발표된 연구들과의 비교가 가능하기 때문에 선정하였다. 동물은 12시간 명기/12시간 암기 주기 하에 24 ± 2 °C에서 사육되었다. 10일의 실험 기간 동안 표준 펠릿 사료와 수돗물을 자유롭게 섭취(ad libitum)하도록 제공하였다. 실험 절차를 시작하기 전, 모든 동물은 7일간의 적응 기간을 거쳤다.
컴퓨터 보조 무작위 할당 절차를 사용하여 30마리의 쥐를 5개의 실험군으로 할당하였으며, 그룹당 6마리를 목표로 하였다. 각 쥐에 대해 1에서 5 사이의 무작위 정수를 생성하여 해당 실험군에 배정하였다. 특정 그룹에 6마리가 모두 채워지면, 이후 해당 그룹으로 지정된 추첨 결과는 폐기하고 빈 자리가 있는 그룹이 선택될 때까지 새로운 무작위 숫자를 생성하였다. 이 절차는 30마리의 쥐가 모두 할당될 때까지 계속되었으며, 그 결과 그룹당 6마리씩 배정되었다. 동일한 연구자가 무작위 배정을 생성하고 할당을 실행하였으며, 별도의 할당 담당자를 두지 않았다. 1군(대조군)은 실험 약물 처리를 받지 않았으며, 다른 그룹과 동일한 일정으로 종료 시점 샘플링을 거쳤다. 2군(MTX)은 methotrexate를 0.3 mg/kg의 용량으로 7일 동안 경구 투여받았다. 3군(MTX + Methanol)은 7일 동안 methotrexate를 투여받은 후, 연구 8일차에 methanol을 3 g/kg 투여받았다. 4군(MTX + Methanol + Fomepizole)은 methotrexate 전처리와 methanol 투여를 거친 후, 4시간 뒤에 4-methylpyrazole 처리를 시작하였다. 5군(MTX + Methanol + Ethanol)은 methotrexate 전처리와 methanol 투여를 거친 후, 4시간 뒤에 ethanol을 투여받았다.
메탄올에 노출된 세 그룹 모두 동일한 MTX 전처치 및 메탄올 투여 프로토콜을 적용받았으며, 노출 후 해독제 치료 여부에서만 차이가 있었습니다. 실험군 배정, 투여 프로토콜, 해독제 치료 시점 및 시료 수집 과정은 그림 1에 요약되어 있습니다. 5개의 독립 그룹을 대상으로 고정 효과 일원 분산 분석(fixed-effects one-way ANOVA)을 위한 사전 검정력 분석을 수행하였습니다. 큰 표준화된 효과 크기(Cohen’s f = 0.70), 유의 수준 0.05, 통계적 검정력 80%를 가정했을 때, 필요한 최소 총 표본 크기는 30마리로 계산되었으며, 이는 그룹당 6마리에 해당합니다. 총 표본 크기가 30일 때 계산된 검정력은 약 80.9%였습니다. 가정된 효과 크기(Cohen’s f = 0.70)는 본 급성 독성 모델에서 그룹 간에 전반적으로 큰 효과가 나타날 것이라는 연구자의 기대에 따라 실험 전에 지정되었습니다. 이 가정은 예비 데이터나 특정 이전 연구에서 도출된 추정치가 아니라 연구자의 판단에 근거한 것입니다. 본 연구에서는 사전에 지정된 단일 일차 결과 지표가 없었으며, 표본 크기 계산은 5개 실험군 간의 옴니버스 비교(omnibus comparison)에서 가정된 전반적인 큰 효과를 기반으로 이루어졌습니다. 일차 결과 지표를 사후적으로 지정하여 사전에 지정된 엔드포인트로 간주할 수는 없습니다. 따라서, 표본 크기 계산 결과는 개별 결과 지표나 쌍별 비교(pairwise comparisons)에 대해 충분한 검정력을 제공하지 않습니다.
메탄올 중독 및 해독 치료 프로토콜
순화 기간 후, 그룹 2-5의 동물들에게 7일 연속(연구일 1-7일)으로 메토트렉세이트를 1일 1회 투여하였다. 연구일 8일에, 그룹 3-5의 동물들에게 20% 메탄올 용액 3 g/kg을 경구 투여하였다. 메탄올 투여 전 금식이나 기타 음식 및 물의 제한은 두지 않았다.
MTX + Methanol + Fomepizole 군에서는 메탄올 투여 4시간 후에 15 mg/kg의 용량을 복강 내 로딩 용량으로 투여하였으며, 이후 메탄올 투여 12, 24, 36시간 후에 10 mg/kg의 유지 용량을 복강 내로 투여하였습니다. MTX + Methanol + Ethanol 군에서는 메탄올 투여 4시간 후에 0.5 g/kg의 에탄올 단회 용량을 경구 투관으로 투여하였으며, 추가적인 에탄올 유지 용량은 투여하지 않았습니다. 이 두 가지 해독 요법은 확립된 fomepizole 용량 권고 사항과 이전에 발표된 에탄올 비교 프로토콜1,6,13,14을 반영하여 선정되었습니다. 해당 요법들은 용량, 투여 경로 또는 노출량을 일치시킨 치료를 제공하도록 설계되지 않았습니다. 따라서 반복적인 복강 내 fomepizole 요법과 단회 경구 에탄올 투여는 불균등한 약리학적 비교에 해당합니다. 성공적인 경구 투관 투여는 시술 중 역류, 구강 누출 또는 호흡 곤란이 없음을 통해 확인하였습니다. 성공적인 복강 내 투여는 주사 부위의 누출, 출혈 또는 뚜렷한 부종이 없음을 통해 확인하였습니다.
투여 후, 동물의 전반적인 건강 상태, 운동성, 식이 섭취량, 자세, 털 상태 및 독성 징후를 정기적으로 모니터링하였습니다. 치료 일정은 메탄올로부터 독성 대사체 형성이 시작되도록 설계되었으며, 동시에 해독제의 보호 및 치료 효과를 평가할 수 있도록 하였습니다.
안락사, 인도적 종료 시점 및 시료 수집
실험 전 기간 동안 모든 동물은 전반적인 건강 상태, 사료 및 음수 섭취량, 운동성 및 행동 변화에 대해 매일 평가되었습니다. 인도적 종료 시점 기준은 현저한 무기력증, 사료 또는 물 섭취 불능, 심각한 체중 감소, 운동 제한, 비정상적인 자세, 지속적인 입모 현상 또는 명백한 고통 징후로 사전 정의되었습니다. 이러한 기준 중 어느 하나라도 충족하는 동물은 인도적 안락사를 시행하기로 계획되었습니다. 그러나 본 연구 기간 동안 사전 정의된 인도적 종료 시점 기준에 도달한 동물은 없었습니다.
5개의 실험군에 속한 모든 동물은 연구 10일 차에 안락사되었습니다. MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, MTX + Methanol + Ethanol 군의 경우, 이 종료 시점은 연구 8일 차에 단회 투여한 메탄올로부터 48시간이 경과한 시점에 해당합니다. 대조군은 연구 10일 차까지 처치를 받지 않았으며, MTX 단독 투여군은 7일간의 MTX 투여 프로토콜을 완료한 후 연구 10일 차까지 관찰되었습니다. 따라서 5개 군 모두 전체 연구 기간이 동일했으며, 동일한 연구 날짜에 안락사 및 시료 수집이 진행되었습니다.
깊은 마취를 유도하기 위해 케타민과 자일라진을 사용하였습니다. 마취 깊이는 발Withdrawal reflex(발제거 반사)의 소실로 확인하였습니다. 깊은 마취가 이루어진 후, 심장 천자를 통해 혈액 샘플을 채취하였습니다. 적절한 주사기와 바늘을 사용하여 약 3–5 mL의 혈액을 얻었습니다. 혈청 요소 및 크레아티닌 농도, 혈청 SOD 활성 및 혈청 MDA 농도 측정을 위해 채취한 혈액은 항응고제가 없는 튜브로 옮겨 완전히 응고되도록 두었습니다. GSH 수준 및 CAT 활성 측정을 위한 혈액은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 포함된 튜브에 별도로 채취하였으며, 응고 단계 없이 처리하였습니다. 혈전이 완전히 형성된 후, 혈청 샘플을 4 °C에서 3,000 × g로 10–15분 동안 원심분리하였습니다. 분리된 혈청은 분석 전까지 −80 °C에 보관하였습니다. 투명하고 용혈되지 않은 외관을 통해 혈청 분리가 성공적으로 이루어졌음을 확인하였습니다. 혈액 채취 후, 깊은 마취 하에 방혈을 통해 안락사를 완료하였습니다. 이어서 정중선 개복술을 시행하여 양쪽 신장을 조심스럽게 제거하였습니다. 주변 지방과 결합 조직을 제거한 후, 신장을 차가운 생리식염수로 세척하였습니다. 조직 샘플은 조직병리학적 분석과 생화학적 분석용으로 나누었습니다. 조직병리학적 검사용 샘플은 10% 중성 완충 포름알데히드에 넣었습니다. 생화학적 분석용 샘플은 적절히 라벨을 붙여 −80 °C에 보관하였습니다.
시료 수집, 생화학적 분석 및 결과 평가는 실험군을 알지 못하는 연구자들에 의해 수행되었습니다. 분석에서 제외된 동물은 없었습니다.
생화학 분석
혈청 요소 농도는 자동 생화학 분석기에서 효소적 urease-glutamate dehydrogenase 키네틱 분석법을 사용하여 측정하였습니다. 요소는 urease에 의해 가수분해되어 암모니아를 생성하며, 이는 이후 glutamate dehydrogenase 존재 하에 2-oxoglutarate 및 환원된 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)와 반응합니다. NADH 소모로 인한 흡광도 감소를 키네틱하게 측정하였습니다. 혈청 크레아티닌 농도는 동일한 자동 생화학 분석기를 사용하여比색법으로 측정하였습니다.
혈청 superoxide dismutase (SOD) 활성은 xanthine-xanthine oxidase 시스템에 의한 superoxide 라디칼 생성과 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride와의 반응을 통해 유색의 formazan 생성물이 형성되는 원리를 이용한 비색법으로 측정하였다. 최종 흡광도는 505 nm에서 측정하였다. 혈청 malondialdehyde (MDA) 농도는 thiobarbituric acid 반응을 이용하여 결정하였다. 혈청 시료를 차가운 trichloroacetic acid와 혼합하여 단백질을 침전시킨 후 4 °C에서 7,500 × g로 5분 동안 원심분리하였다. 얻어진 상층액을 동일한 부피의 thiobarbituric acid와 혼합하여 90 °C에서 60분 동안 배양하였다. 이후 반응 튜브를 냉수욕에서 10분 동안 냉각시킨 후, 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. MDA 농도는 해당 검량선을 이용하여 계산하였다. 환원형 glutathione (GSH)은 EDTA-항응고 처리된 혈액에서 변형된 Ellman법을 사용하여 측정하였다. trichloroacetic acid로 단백질을 침전시킨 후, 탈단백질화된 시료를 pH 8.2의 500 mM Tris 완충액에서 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)와 반응시켰으며, 412 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catalase (CAT) 활성은 EDTA-항응고 처리된 혈액에서 2단계 비색법을 사용하여 측정하였다. 시료를 일정량의 hydrogen peroxide와 함께 배양하고, 효소 반응을 정지시킨 후 잔류 hydrogen peroxide를 발색 시약을 사용하여 405 nm에서 측정하였다.
SOD 활성과 MDA 농도는 혈청에서 측정되었으며, GSH 수준과 CAT 활성은 신장 조직 균질액이 아닌 EDTA 항응고 혈액에서 측정되었기 때문에, 이러한 산화환원 관련 파라미터를 조직 총 단백질 농도로 표준화하는 것은 적용 가능하지 않았습니다. 산화환원 관련 바이오마커 프로파일의 해석을 위해, 혈청 MDA 농도가 더 높으면 지질 과산화가 더 심한 것으로 간주하였고, 혈청 SOD 활성, 혈액 GSH 수준 및 혈액 CAT 활성이 더 낮으면 항산화 능력이 감소한 것으로 간주하였습니다. 이와 반대 방향의 변화는 더 유리한 산화환원 관련 프로파일로 해석되었습니다.
신장 조직의 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA) 측정을 위해, −80 °C에 보관된 약 50 mg의 신장 조직을 프로테아제 억제제 칵테일이 포함된 500 µL의 균질화 완충액에서 얼음 위에서 균질화하였으며, 이는 1:10 (w/v)의 고정된 조직 대 완충액 비율에 해당한다. 쥐 한 마리당 하나의 동물 특이적 신장 조직 균질액을 준비하였다. 서로 다른 동물의 샘플은 독립적으로 처리되었으며 어떤 단계에서도 혼합하지 않았다. 균질액을 4 °C에서 14,000 × g로 10분 동안 원심분리한 후, 각 동물로부터 얻은 상층액을 따로 수집하여 계획된 신장 조직 분석을 위해 소분하였다. 총 단백질 농도는 별도로 측정하지 않았으므로, 조직 ELISA 결과는 단백질 농도로 정규화하지 않았다. 해당 분석별 표준 곡선으로부터 계산된 최종 농도는 TNF-α 및 IL-6의 경우 ng/L로, IL-1β, KIM-1 및 cystatin C의 경우 ng/mL로 표기하였다.
신장 손상 분자-1(KIM-1)과 cystatin C를 신장 손상 바이오마커로 평가하였으며, tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) 및 interleukin-1β (IL-1β)를 신장 염증 마커로 평가하였습니다. 다섯 가지 분석물 모두 제조업체의 프로토콜에 따라 쥐 전용 ELISA 키트를 사용하여 신장 조직 균질액에서 측정하였습니다. 각 분석의 분석 민감도와 측정 범위는 TNF-α의 경우 2.51 ng/L 및 5–1,000 ng/L, IL-6의 경우 0.052 ng/L 및 0.1–40 ng/L, IL-1β의 경우 0.08 ng/mL 및 0.2–60 ng/mL, KIM-1의 경우 0.01 ng/mL 및 0.05–10 ng/mL, 그리고 cystatin C의 경우 0.25 ng/mL 및 0.5–100 ng/mL였습니다. 분석 전, 모든 시약, 표준물 및 신장 조직 상층액을 실온으로 맞추었습니다. 표준 곡선은 제조업체의 권장 사항에 따라 각 분석 실행 시마다 별도로 생성하였습니다. 표준물과 신장 조직 상층액을 항체가 미리 코팅된 웰에 첨가한 후, 해당 biotinylated 검출 항체와 streptavidin-horseradish peroxidase 접합체를 순차적으로 첨가하였습니다. 샘플과 ELISA 시약을 37 °C에서 1시간 동안 반응시켰습니다. 자동 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 5회 세척한 후, 기질 용액 A와 B를 첨가하고 37 °C에서 10분 동안 반응시켰습니다. 산성 정지 용액을 사용하여 발색 반응을 종결시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였습니다. 각 분석물에 대해 공백 보정된 흡광도 값을 해당 분석 전용 표준 곡선을 사용하여 농도로 환산하였습니다.
모든 생화학적 분석은 표준화된 조건하에 수행되었으며, 모든 시료는 동일한 절차를 통해 처리되었습니다. 신장 조직 ELISA 측정은 이중으로 수행되었습니다. 각 분석 대상물에 대해 두 개의 기술적 반복 웰(technical replicate wells)의 평균값을 계산하여 단일 개체 수준의 값을 얻었습니다. 동일한 개체별 균질액에서 얻은 기술적 반복 웰과 별도의 분주액은 독립적인 관측치로 간주하지 않았습니다. 개별 동물을 실험 단위로 간주하였으며, 각 파라미터에 대해 동물 한 마리당 하나의 결과값을 통계 분석에 포함하였습니다.
조직병리학적 처리 및 신장 손상 점수 산정
표준 조직병리학적 절차를 사용하여 현미경 평가를 위한 조직 샘플 처리를 수행하였다. 신장 조직을 실온에서 10% 중성 완충 포름알데히드로 72시간 동안 고정하였다. 고정 후, 조직을 50%, 70%, 80%, 96%, 100%의 단계별 에탄올 농도로 각 1시간씩 탈수시켰다. 이어서, 2단계 자일렌 처리를 통해 조직을 투명화한 후 파라핀 블록으로 임베딩하였다. 회전식 마이크로톰을 사용하여 파라핀 블록으로부터 5 µm 두께의 절편을 제작하였다.
헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해, 절편을 탈파라핀화 및 재수화한 후, 헤마톡실린으로 5분 동안 염색하고 흐르는 수돗물에 5분 동안 세척하였다. 산성 알코올을 사용하여 분별법을 수행한 후, 절편을 암모니아수에 1분 동안 유지하였다. 그 후, 에오신으로 2분 동안 대조 염색하였다. 이어서, 절편을 농도가 증가하는 알코올 시리즈로 탈수하고, 자일렌으로 투명화한 후, 적절한 봉입제로 봉입하였다.
Masson’s trichrome 염색을 위해, 절편의 파라핀을 제거하고 재수화시킨 후, 56 °C의 매염액에서 60분 동안 반응시키고 흐르는 물에 10분 동안 세척하였습니다. 그다지 절편을 Weigert’s iron hematoxylin으로 10분, Biebrich scarlet-acid fuchsin으로 15분, phosphotungstic acid로 10분, 그리고 aniline blue로 10분 동안 순차적으로 처리하였습니다. 마지막으로, 절편을 1% acetic acid에 5분 동안 유지한 후 탈수하고 xylene으로 투명화하여 마운팅하였습니다.
명확한 핵 염색, 보존된 세포질 대비, 신장 구조의 유지 및 결합 조직 구조의 뚜렷한 시각화를 통해 염색이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였습니다. 염색된 모든 슬라이드는 디지털 이미징 시스템이 장착된 광학 현미경을 사용하여 표준화된 조건에서 평가되었습니다.
조직병리학적 평가는 실험군을 알지 못하는 한 명의 숙련된 병리 의사에 의해 수행되었습니다. 조직병리학적 점수 측정은 200× 배율에서 진행되었습니다. 각 동물과 각 조직병리학적 파라미터에 대해 무작위로 선택된 10개의 현미경 시야를 검사하였습니다. 평가 중인 파라미터에 대해 가장 심각한 변화를 보이는 시야를 기준으로 해당 동물의 0–4단계 정수 점수를 할당하였습니다. 세뇨관 손상은 세뇨관 확장, 세뇨관 강 내 단백질성 물질의 축적, 세뇨관 상피 변성과 세뇨관 괴사를 기준으로 평가하였습니다. 사구체 손상은 사구체 변성 또는 위축, 보먼 공간의 확장 및 혈관 울혈을 기준으로 평가하였습니다. 간질 손상은 간질 염증 및 섬유화를 기반으로 평가하였습니다. 각 동물의 5 µm 두께 hematoxylin and eosin 및 Masson’s trichrome 염색 신장 절편을 조직병리학적 평가에 사용하였습니다. 대표적인 광학 현미경 사진은 200× 배율로 촬영하였으며, 스케일 바는 100 µm를 나타냅니다. 동물당 검사한 개별 조직 절편의 수는 연구 기록에서 확인되지 않아 보고할 수 없습니다.
Masson’s trichrome 염색 결과는 단순히 청색 염색 강도만이 아니라 콜라겐 침착의 위치와 형태학적 패턴을 고려하여 조직형태학적으로 해석되었습니다. 반정량적 간질성 섬유화 점수는 이러한 조직형태학적 평가를 바탕으로 산출되었으며, 콜라겐 양성 영역의 백분율은 정량화하지 않았습니다. 조직병리학적 점수 측정은 이전에 기술된 신장 손상 평가 기준16,17을 사용하여 반정량적으로 수행되었습니다. 각 동물은 각 조직병리학적 파라미터에 대해 0–4 척도(0 = 없음, 1 = 최소, 2 = 경미함, 3 = 보통, 4 = 심함)로 하나의 정수 점수를 할당받았습니다. 이러한 등급 분류는 연속적인 형태측정학적 측정치가 아니라, 각 병변의 형태학적 중증도에 대한 블라인드 테스트를 거친 병리학자의 종합적인 평가를 나타냅니다.
안전 주의 사항 및 폐기물 관리
methanol, formaldehyde, xylene, 생물학적 시료 및 동물 조직을 취급할 때 적절한 개인 보호 장구를 사용하였습니다. 실험복, 장갑 및 보호 안경을 착용하였습니다. methanol의 전신 독성과 휘발성으로 인해 모든 절차를 주의 깊게 수행하였습니다. formaldehyde 및 xylene이 포함된 절차는 가능한 한 화학 흄 후드 내에서 진행하였습니다. 날카로운 도구는 적절한 손상성 폐기물 전용 수거함에 수집하였습니다. 화학 폐기물 및 생물학적 물질은 기관의 생물 안전 및 유해 폐기물 관리 절차에 따라 폐기하였습니다.
통계 분석
연속적인 생화학적 변수, 신장 손상 바이오마커, 염증성 변수, 신장 기능 및 산화환원 관련 변수는 평균 ± 표준편차(mean ± SD)로 표기하였다. 데이터 분포의 정규성은 Shapiro–Wilk 검정으로 평가하였으며, 분산의 동질성은 Levene 검정으로 평가하였다. 생화학적 결과의 그룹 간 비교는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 수행하였다. 가정 검정 결과, 혈청 크레아티닌의 한 그룹에서 정규성 이탈이 확인되었으며, 여러 생화학적 결과에서 분산 불균일성이 확인되었다. 기존의 ANOVA 방식을 유지하였으나, 이러한 이탈이 결과 p-값의 신뢰성에 영향을 미쳤을 수 있으므로 연구 결과를 신중하게 해석하였다.
ANOVA를 통해 통계적으로 유의미한 차이가 검출된 경우, Duncan의 사후 다중 비교 검정을 사용하여 그룹 간 쌍별 비교를 수행하였습니다. 각 행 내에서 동일한 상첨자 문자를 공유하는 값들은 Duncan의 사후 검정에 따라 유의미한 차이가 없는 것으로 간주하였습니다. 생화학적 결과 전반에 걸쳐 추가적인 다중성 보정은 적용하지 않았습니다. Duncan의 절차는 가족오차율(family-wise type I error rate)에 대한 강력한 제어를 제공하지 않으며, 여러 결과를 테스트함에 따라 위양성 결과의 위험이 더욱 증가하였습니다. 따라서 개별적인 유의성 비교 결과는 신중하게 해석되었습니다.
생화학적 결과의 전체 효과 크기는 df_between = 4 및 df_error = 25로 설정하여 (F × df_between)/(F × df_between + df_error)로 계산된 에타 제곱(η2)을 사용하여 추정하였습니다. 양측 95% 신뢰 구간은 비중심 F 분포를 반전시키고 N = 30일 때 λ/(λ + N)를 사용하여 비중심성 한계(λ)를 변환하여 계산하였습니다. 이러한 보충 계산은 과학 계산 환경을 통해 수행되었습니다. 추정치는 1차 통계 분석에서 얻은 반올림된 F 통계량을 기반으로 도출되었으므로 근사치입니다. 신뢰 구간은 ANOVA 모델의 정규성 및 등분산 가정을 전제로 하며, 다중 결과에 대해 보정되지 않았습니다.
조직병리학적 점수는 서열 척도의 반정량적 관찰 결과이며, 평균으로 기술적으로 요약되었다. ± SD는 그룹 수준의 평균 병변 부하 및 개체 간 변동성을 나타냅니다. 조직병리학적 점수에 대해서는 추론적 가설 검정이나 사후 쌍별 비교를 수행하지 않았습니다. 따라서 ANOVA, Duncan의 사후 검정 및 pp-값 보고는 생화학적 지표, 신장 손상 바이오마커, 염증 지표, 신장 기능 및 산화-환원 관련 결과에만 적용되었습니다. p-값 < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
결과
모든 30마리의 동물을 5개의 실험군으로 나누어 각 군당 6마리씩 분류한 후 분석에 포함시켰다. 5개 군의 모든 동물은 연구 10일차에 안락사되었으며 시료를 채취하였다. 메탄올 노출군 3개 군의 경우, 이 시점은 메탄올 투여 후 48시간에 해당하였다. 따라서 모든 실험군에서 총 연구 기간 및 시료 채취 시점이 일관되게 유지되었다. 신장 손상 및 염증성 생물학적 지표, 신기능 및 산화환원 관련 인자, 조직병리학적 소견은 아래에 기술된 대로 평가하였다.
생화학적 소견: 신장 손상 및 염증성 생물학적 표지자
신장 조직 동질화액에서 측정된 신장 손상 및 염증성 생물학적 지표의 결과는 다음에 제시되어 있다. 표 1일원배치 분산분석(One-way ANOVA) 결과, 5개 집단 간의 cystatin C에서 전체적으로 유의한 차이가 있었음[F(4,25) = 5.329, p = 0.003], IL-6 [F(4,25) = 3.907, p = 0.013], KIM-1 [F(4,25) = 3.673, p = 0.017], TNF-α [F(4,25) = 7.660, p < 0.001], 그리고 IL-1β [F(4,25) = 11.584, p < 0.001]. 사후 집단 간 비교는 던컨(Duncan) 검정을 사용하여 수행하였다.’다중 범위 검정에서 군 배정은 상첨 문자로 표시함 표 1. 신장 조직 동질화액의 cystatin C, IL-6 및 KIM-1 농도는 MTX + 메탄올 군에서 가장 높았으나, 대조군, MTX 단독 투여군, MTX + 메탄올 + 포메피졸 군, MTX + 메탄올 + 에탄올 군 간에는 이들 변수에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 신장 조직 동질화액의 TNF-α 및 IL-1β MTX + 메탄올 군에서도 가장 높았다. MTX 단독 군은 TNF-α 및 IL-1β 대조군에 비해 신장 조직 동질화액에서 더 높은 수치를 보였으나, 해독제 투여군은 그 중간값을 나타내었다(표 1).
신장 기능 및 산화환원 관련 파라미터
혈청 신기능 지표 및 혈액 유래 산화환원 관련 파라미터는 다음에 제시되어 있다. 표 2일원배치 분산분석(One-way ANOVA) 결과, 5개 집단 간 혈청 요소 농도에 있어 전체적으로 유의한 차이가 있었다[F(4,25) = 3.694, p = 0.017], 혈청 크레아티닌 [F(4,25) = 12.988, p < 0.001], 혈청 SOD 활성 [F(4,25) = 11.621, p < 0.001], 혈중 GSH 농도 [F(4,25) = 10.164, p < 0.001], 혈액 CAT 활성 [F(4,25) = 10.631, p < 0.001], 그리고 혈청 MDA 농도 [F(4,25) = 8.814, p < 0.001]. 사후 집단 간 비교는 던컨(Duncan) 검정을 사용하여 수행하였다.’다중 범위 검정으로, 집단 배정은 상첨 문자로 표시함 표 2.
혈청 요소, 혈청 크레아티닌 및 혈청 MDA 농도는 MTX + 메탄올 군에서 가장 높았다. 혈청 요소 및 혈청 MDA 농도는 대조군, MTX 단독 투여군, MTX + 메탄올 + 포메피졸 군, MTX + 메탄올 + 에탄올 군 간에 유의한 차이가 없었으나, 혈청 크레아티닌 농도는 대조군에서 가장 낮았다(표 2).
MTX + 메탄올 군은 또한 혈청 SOD 활성, 혈중 GSH 농도 및 혈중 CAT 활성이 가장 낮았다. MTX + 메탄올 군과 비교할 때, 포메피졸 투여 군은 혈청 SOD 활성과 혈중 CAT 활성이 유의하게 높았으나, 에탄올 투여 군의 해당 증가는 통계적으로 유의하지 않았다. 혈중 GSH 농도는 MTX 단독 투여 군, MTX + 메탄올 군 및 두 가지 해독제 투여 군 간에 유의한 차이가 없었다.표 2).
대조군에 비해 MTX 단독 투여군은 신장 조직 동질화액에서 TNF-α 수준이 더 높았다.α 및 IL-1β 혈청 SOD 활성, 혈중 GSH 농도 및 혈중 CAT 활성이 낮아졌으나, 신장 조직 동질액 내 cystatin C, IL-6 또는 KIM-1 농도 및 혈청 요소, 혈청 크레아티닌 또는 혈청 MDA 농도는 유의한 차이를 보이지 않았다.
조직병리학적 소견 및 신장 손상 점수
신장 조직의 조직병리학적 평가 결과는 다음에 제시되어 있다. 표 3. 그룹 간에 세뇨관 확장, 단백질성 물질 축적, 세뇨관 상피 퇴행, 세뇨관 괴사, 사구체 퇴행, 보우만 캡슐 확대에서 형태학적 변이가 관찰되었다.’공간, 혈관 충혈, 간질성 염증 및 간질성 섬유화.
대조군에서 신장 조직은 사구체 및 세뇨관 구조에서 뚜렷한 병리학적 변화 없이 정상적인 조직학적 구조를 유지하였다. MTX 군에서는 경한 세뇨관 퇴행성 변화, 혈관 충혈 및 간질성 염증이 관찰되었다.
MTX + 메탄올 군은 평가된 세뇨관, 사구체, 혈관 및 간질 매개변수 전반에 걸쳐 가장 높은 관찰 손상 점수를 보였다. 해독제 투여군 모두 MTX + 메탄올 군보다 기술적으로 낮은 관찰 점수를 나타냈다. 기술적 비교에서, 대부분의 매개변수 특히 세뇨관 확장, 세뇨관 괴사, 사구체 퇴행성 변화 및 보우만 캡슐 확대에서 포메피졸 투여군이 에탄올 투여군보다 낮은 관찰 점수를 보였다.’s 공간, 혈관 충혈 및 간질 섬유화 (표 3). 이러한 비교는 기술적인 것이었으며, 조직병리학적 점수에 대해 통계적 유추 검정은 수행하지 않았다. 헤마톡실린-에오신 및 마슨 삼색 염색을 사용하여 획득한 대표적인 신장 조직병리학 이미지’s 트리크롬 염색 결과는 다음에서 확인할 수 있다. 그림 2.
전반적으로 MTX + 메탄올 군은 가장 높은 신장 손상 및 염증성 생물학적 마커 수치, 가장 불리한 신장 기능 및 산화환원 프로파일, 그리고 가장 높은 조직병리학적 손상 점수를 나타냈다. 해독제 투여군은 모두 MTX + 메탄올 군에 비해 더 양호한 신장 결과 양상을 보였으며, 포메피졸 투여군은 평가된 모든 영역에서 더욱 일관되게 양호한 양상을 보였다. MTX 단독 투여군도 대조군에 비해 선택된 염증 및 산화환원 관련 매개변수에서 변화를 나타냈다.
데이터 이용 가능성:
생화학적, 신장 손상 바이오마커, 염증, 신기능 및 산화환원 관련 분석을 뒷받침하는 개체 수준의 원시 데이터는 다음에 제공되어 있다. 보충 파일 1.
그림 1실험 설계 및 처리 일정 메탄올 중독 실험용 흰색 와이스터 수컷 래트 모델의 개요도. 성숙한 수컷 와이스터 흰색 래트를 5개 그룹으로 분류하였다: 대조군, 메토트렉세이트(MTX) 단독 투여군, MTX + 메탄올 투여군, MTX + 메탄올 + 포메피졸 투여군, 그리고 MTX + 메탄올 + 에탄올 투여군(n = 6/그룹). 10일간의 연구 기간 동안 모든 동물에게 표준 펠렛 사료와 수돗물을 자유롭게 공급하였으며, 메탄올 투여 전후로 금식이나 기타 사료 또는 물 제한을 가하지 않았다. 대조군은 어떠한 실험적 처치도 받지 않았다. 2군의 동물들은–5은 7일 연속으로 매일 1회 경구 투여를 통해 0.3 mg/kg의 MTX를 투여받았다(연구 1일차부터 7일차까지)–7). 3군의 동물들–5는 연구 8일차에 경구 투여를 통해 3 g/kg의 일회성 메탄올을 투여받았다. MTX + 메탄올 + 포메피졸 군에서는 메탄올 투여 후 4시간 뒤 복강 내 경로로 15 mg/kg의 포메피졸 로딩 용량을 투여하였으며, 이후 12, 24, 36시간에 각각 10 mg/kg의 유지 용량을 투여하였다. MTX + 메탄올 + 에탄올 군에서는 메탄올 투여 후 4시간 뒤 경구 투여를 통해 0.5 g/kg의 일회성 에탄올을 투여하였다. 모든 동물은 연구 10일차에 안락사되었다. 3군의 경우–5는 메탄올 투여 후 48시간에 해당하는 시점이다. 신기능, 신장 손상 바이오마커, 염증성 사이토카인, 산화환원 관련 바이오마커 및 신장 조직병리학 분석을 위해 혈액 및 신장 시료를 채취하였다. 약어: MTX = 메토트렉세이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 실험군에서 채취한 신장 조직의 대표적인 조직병리학적 소견. 대표적인 신장 절편은 대조군, MTX군, MTX + 메탄올군, MTX + 메탄올 + 포메피졸군, 그리고 MTX + 메탄올 + 에탄올군에서 채취한 것이다. 상단 행은 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색을 보여준다.&E) 염색이며, 하단 행은 매슨’삼색 염색. 대조군에서는 정상적인 사구체 및 세뇨관 형태를 가진 보존된 신장 구조를 나타내었다. 대조군의 사구체 및 세뇨관 기저막, 혈관벽, 간질 결합조직에서 관찰된 파란색으로 염색된 콜라겐은 병리적 섬유화의 증거라기보다는 생리적 콜라겐으로 간주되었다. MTX 군에서는 경미한 세뇨관 퇴행성 변화, 혈관 충혈 및 염증성 변화가 나타났다. MTX + 메탄올 군에서는 세뇨관 퇴행성 변화(*), 혈관 충혈(+), 보우만 캡슐 간격 확장 등이 특징적인 더욱 두드러진 신장 손상이 관찰되었다.’s 공간(x), 세관 � ho 괴사(↑), 간질성 염증 (↕), 및 조직형태학적 섬유화 변화와 일치하는 사구체 주위 콜라겐 축적 (‡), 매슨에서 관찰된 바와 같이’삼색 염색된 절편. 포메피졸 처리군은 MTX + 메탄올 군에 비해 낮은 조직병리학적 손상 점수를 보였으며, 상대적으로 보존된 세뇨관 및 사구체 구조와 괴사, 염증, 혈관 충혈 및 콜라겐 관련 변화의 범위가 더 적었다. 에탄올 처리군 역시 MTX + 메탄올 군에 비해 낮은 조직병리학적 손상 점수를 보였으나, 포메피졸 처리군에 비해 잔존하는 세뇨관, 사구체 및 혈관의 이상 소견이 더 뚜렷하게 나타났다. 현미경 사진은 200배에서 촬영하였다.× 배율 및 스케일 바는 100을 나타냄 µm. 마송’Masson 트리크롬 염색은 보조적인 조직형태학적 증거로 평가되었으며, 각 패널 간 파란색 염색 강도의 차이는 섬유화의 군 간 정량적 비교를 위한 지표로 사용되지 않았다. 기호: * 세뇨관 퇴행성 변화; + 혈관 충혈; x 보우만 캡슐 간격 확장’s 공간; ↑ 세뇨관 괴사; ↕ 질질성 염증; ‡ 사구체 주위 콜라겐 축적이 조직형태학적으로 섬유화 변화와 일치함. MTX, 메토트렉세이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 가변 | 대조군 (n = 6) | MTX (n = 6) | MTX + 메탄올 (n = 6) | MTX + 메탄올 + 포메피졸 (n = 6) | MTX + 메탄올 + 에탄올 (n = 6) | p | η² (95% 신뢰구간) |
| 시스테이틴 C (ng/mL) | 26.07 ± 12.05a | 32.01 ± 1.86a | 45.23 ± 10.51b | 32.49 ± 1.60a | 31.27 ± 4.60a | 0.003 | 0.460 (0.084 – 0.597) |
| IL-6 (ng/L) | 7.66 ± 1.38a | 8.72 ± 2.45a | 11.02 ± 0.83b | 7.96 ± 1.54a | 8.12 ± 1.77a | 0.013 | 0.385 (0.023 – 0.535) |
| KIM-1 (ng/mL) | 2.21 ± 1.00a | 2.47 ± 0.24a | 3.45 ± 0.81b | 2.28 ± 0.58a | 2.32 ± 0.37a | 0.017 | 0.370 (0.013 – 0.522) |
| TNF-α (ng/L) | 118.66 ± 22.95a | 190.51 ± 5.84b | 238.29 ± 34.68c | 147.10 ± 24.31ab | 168.41 ± 75.41ab | <0.001 | 0.551 (0.181 – 0.668) |
| IL-1β (ng/mL) | 8.43 ± 0.59a | 12.53 ± 1.05c | 15.26 ± 1.46d | 10.05 ± 2.86ab | 11.17 ± 2.37비씨 | <0.001 | 0.650 (0.316 – 0.743) |
표 1: 실험군에서의 신장 손상 및 염증성 생물학적 지표 데이터는 평균으로 제시된다 ± 표준편차(SD)로 표시하며, 각 그룹당 6마리의 동물을 사용하였다. 모든 생물학적 마커는 신장 조직 동질화액에서 측정하였다. Cystatin C, KIM-1 및 IL-1β 농도는 ng/mL로 표시함; IL-6 및 TNF-α 농도는 ng/L로 표시한다. 보고됨 p 값은 5개 그룹 간의 종합적 일원분산분석(omnibus one-way ANOVA)에 기초한 것이다. 종합적 검정에서 유의미한 결과가 나타난 후, 사후 비교는 던컨(Duncan) 검정을 사용하여 수행하였다.’다중 범위 검정. 각 행 내에서 적어도 하나의 위첨자 문자를 공유하는 집단 간에는 유의한 차이가 없으며, 공통된 문자가 없는 집단 간에는 0.05 수준에서 유의한 차이가 있다. 생체지표물질들 사이에서는 추가적인 다중성 보정을 적용하지 않았다. 일부 생체지표물질들에서 분산의 이질성이 확인되었으므로, 분산분석(ANOVA) 및 던컨(Duncan) 검정 결과는 주의하여 해석해야 한다. 약어: MTX = 메토트렉세이트; KIM-1 = 신장 손상 분자-1; IL-6 = 인터루킨-6; TNF-α = 종양 괴사 인자-알파; IL-1β = 인터루킨-1 베타; SD = 표준편차; ANOVA = 분산 분석; CI = 신뢰 구간. η2 5개 그룹 전체에 걸친 전반적인 효과 크기를 나타낸다. 양측 95% 신뢰구간은 모형 기반으로 계산되었으며, 오차가 정규분포를 따르고 분산이 동일하다는 가정 하에 산출되었고, 다중 결과에 대한 보정은 적용되지 않았다. 따라서 이러한 가정이 위배되는 경우 신뢰구간을 해석할 때 주의를 기울여야 한다.
| 가변 | 대조군 | MTX | MTX + 메탄올 | MTX + 메탄올 + 포메피졸 | MTX + 메탄올 + 에탄올 | p | η² (95% 신뢰구간) |
| 혈청 요소 (mg/dL) | 39.64 ± 13.69a | 46.88 ± 9.49a | 98.75 ± 59.24b | 48.03 ± 19.64a | 60.44 ± 18.53a | 0.017 | 0.371 (0.014–0.523) |
| 혈청 크레아티닌 (mg/dL) | 0.50 ± 0.10a | 0.54 ± 0.05ab | 0.72 ± 0.03c | 0.54 ± 0.03ab | 0.60 ± 0.05b | <0.001 | 0.675 (0.356–0.762) |
| 혈청 SOD 활성도 (U/mL) | 470.40 ± 40.49d | 371.16 ± 17.64c | 219.29 ± 85.06a | 319.38 ± 107.20비씨 | 256.22 ± 67.89ab | <0.001 | 0.650 (0.317–0.743) |
| 혈액 GSH (mmol/L) | 58.74 ± 31.90b | 26.36 ± 5.92a | 11.10 ± 3.73a | 19.56 ± 1.66a | 13.66 ± 5.32a | <0.001 | 0.619 (0.272–0.720) |
| 혈액 CAT 활성(U/mL) | 220.82 ± 74.08c | 160.88 ± 55.18b | 68.90 ± 13.41a | 129.45 ± 7.49b | 110.14 ± 20.18ab | <0.001 | 0.630 (0.287–0.728) |
| 혈청 MDA (nmol/mL) | 13.17 ± 2.03a | 17.29 ± 6.36a | 31.83 ± 9.94b | 17.93 ± 2.04a | 19.34 ± 4.65a | <0.001 | 0.585 (0.225–0.694) |
표 2: 실험군의 신기능 및 산화환원 관련 매개변수. 데이터는 평균으로 제시된다 ± 표준편차(SD)와 함께, 각 그룹당 6마리의 동물을 사용하였다. 혈청 요소, 혈청 크레아티닌, 슈퍼옥사이드디스뮤타제(SOD) 활성 및 말론디알데히드(MDA) 농도는 혈청에서 측정하였으며, 환원형 글루타티온(GSH) 농도와 카탈라제(CAT) 활성은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 항응고 처리한 혈액에서 측정하였다. 혈청 요소 및 크레아티닌 농도는 mg/dL로, SOD 및 CAT 활성은 U/mL로, GSH 농도는 mmol/L로, MDA 농도는 nmol/mL로 나타내었다. 보고됨 p 값은 5개 그룹 간의 종합적 일원분산분석(omnibus one-way ANOVA)에 기초한 것이다. 종합적 검정에서 유의미한 결과가 나타난 후, 사후 비교는 던컨(Duncan) 검정을 사용하여 수행하였다.’다중 범위 검정. 각 행 내에서 적어도 하나의 위첨자 문자를 공유하는 집단 간에는 유의한 차이가 없으며, 공통된 문자가 없는 집단 간에는 0.05 수준에서 유의한 차이가 있다. 생체지표들 간에는 추가적인 다중성 보정을 적용하지 않았다. 일부 결과에서 분산의 이질성이 확인되었으므로, ANOVA 및 던컨 검정 결과는 신중하게 해석해야 한다. 산화환원 상태 관련 생체지표는 간접적인 지표일 뿐이며, 미토콘드리아 기능이나 손상의 분자 기전에 대한 직접적인 측정을 의미하지 않는다. η2 5개 그룹 전반에 걸친 전체 효과 크기를 나타낸다. 양측 95% 신뢰구간은 모형 기반으로 계산되었으며, 오차가 정규분포를 따르고 등분산을 가진다는 가정 하에 산출되었고, 다중 결과에 대해 조정되지 않았다. 따라서 이러한 가정이 위배되는 경우 신뢰구간은 신중하게 해석해야 한다. 약어: MTX = 메토트렉세이트; SOD = 슈퍼옥사이드 디스무타제; GSH = 환원형 글루타티온; CAT = 카탈라제; MDA = 말론디알데히드; EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산; SD = 표준편차; ANOVA = 분산분석; CI = 신뢰구간.
| 가변 | 대조군 | MTX | MTX + 메탄올 | MTX + 메탄올 + 포메피졸 | MTX + 메탄올 + 에탄올 |
| 세관 확장 | 0.16 ± 0.40 | 1.50 ± 0.54 | 3.50 ± 0.54 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| 단백질성 물질 축적 | 0.00 ± 0.00 | 1.33 ± 0.51 | 3.16 ± 0.40 | 0.66 ± 0.51 | 1.33 ± 0.51 |
| 세관 상피 퇴행성 변화 | 0.16 ± 0.40 | 1.83 ± 0.40 | 3.83 ± 0.40 | 1.00 ± 0.00 | 2.00 ± 0.00 |
| 세뇨관 괴사 | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 3.33 ± 0.51 | 0.83 ± 0.40 | 1.33 ± 0.51 |
| 사구체 퇴행성 변화 | 0.16 ± 0.40 | 1.33 ± 0.51 | 3.33 ± 0.51 | 1.00 ± 0.00 | 1.66 ± 0.51 |
| 보우먼's 공간 확장 | 0.00 ± 0.00 | 1.16 ± 0.40 | 3.00 ± 0.00 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| 혈관 혈류 정체 | 0.00 ± 0.00 | 1.33 ± 0.51 | 3.16 ± 0.40 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| 간질성 염증 | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 3.00 ± 0.63 | 0.83 ± 0.40 | 1.16 ± 0.40 |
| 간질성 섬유화 | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 2.83 ± 0.40 | 0.66 ± 0.51 | 1.16 ± 0.40 |
표 3: 실험군의 기술적 조직병리학적 점수 데이터는 평균으로 기술적으로 제시된다. ± 표준편차(SD)를 사용하여 각 그룹당 6마리의 동물을 대상으로 분석하였다. 조직병리학적 점수는 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색한 신장 절편으로부터 획득하였다.&E) 및 매슨’s 트리크롬; 점수는 무차원이다. 각 동물은 0에서 시작하는 척도에서 각 조직병리학적 매개변수에 대해 하나의 정수 점수를 부여받았다.–4로, 0은 없음, 1은 최소, 2는 경도, 3은 중등도, 4는 중증을 의미한다. 표에 제시된 소수 값은 각 실험군의 6마리 동물로부터 얻어진 개별 정수 점수의 산술 평균을 나타내며, 개별 동물에게 부여된 점수나 연속적 채점 체계를 나타내는 것은 아니다. 표준편차는 각 군 내 개체 간 변동성을 나타낸다. 조직병리학적 점수에 대해서는 추론 통계 검정이나 사후 쌍별 비교가 수행되지 않았으므로, 군 간 관찰된 양상은 통계적으로 유의미한 차이로 해석하기보다 기술적으로 해석되어야 한다. 조직병리학적 평가에는 세뇨관 확장, 단백성 물질 축적, 세뇨관 상피 퇴행성 변화, 세뇨관 괴사, 사구체 퇴행성 변화, 보우만 캡슐 확대가 포함되었다.’공간, 혈관 충혈, 간질성 염증 및 간질성 섬유화.
보조 파일 1: 생화학적 분석을 뒷받침하는 원시 데이터이 스프레드시트에는 원고에서 보고된 생화학적, 신장 손상 바이오마커, 염증 및 산화환원 관련 분석에 사용된 개체 수준의 원시값이 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
본 연구의 주요 결과는 MTX + Methanol 그룹이 기능적, 염증성, 산화환원 관련 및 조직병리학적 결과 전반에 걸쳐 가장 심각한 신장 손상 양상을 보였다는 것입니다. 이 그룹은 혈청 urea, 혈청 creatinine, 신장 cystatin C, KIM-1, TNF-α, IL-6, IL-1β 및 MDA 수치가 가장 높았으며, SOD 활성, GSH 수준 및 CAT 활성은 가장 낮았고, 조직병리학적 손상 점수는 가장 높게 관찰되었습니다. 두 가지 해독제 치료 그룹 모두 MTX + Methanol 그룹보다 더 양호한 신장 결과 패턴을 보였으며, 특히 fomepizole 치료 그룹이 평가된 모든 영역에서 더 일관되게 양호한 패턴을 나타냈습니다. 하지만 이러한 결과는 불균등한 해독제 투여법(fomepizole의 반복적 복강 내 투여 대 ethanol의 단회 경구 투여)을 사용한 급성 MTX 전처치 쥐 모델에서 얻어진 것입니다. 이러한 투여 경로 및 빈도의 차이는 신장 보호 효능의 직접적인 비교를 제한하며, 관찰된 결과 패턴만으로는 ethanol 대비 fomepizole의 우월성을 입증할 수 없습니다. MTX 단독 그룹은 대조군에 비해 TNF-α 및 IL-1β 수치가 더 높았고 SOD 활성, GSH 수준 및 CAT 활성은 더 낮았으나, 신장 cystatin C, IL-6, KIM-1, 혈청 urea, 혈청 creatinine 및 MDA 수치는 그룹 간에 통계적으로 유사하게 유지되었습니다. 이러한 패턴은 MTX 전처치가 기저 염증 및 산화환원 관련 프로파일에 기여했음을 나타냅니다. 따라서 MTX + Methanol 그룹에서 관찰된 추가적인 변화는 MTX가 전처치된 배경에서 발생한 것이며, 오직 methanol에 의해서만 기인한 것으로 볼 수 없습니다. methanol 단독 그룹이 포함되지 않았기 때문에, methanol의 독립적인 기여도와 잠재적인 MTX-methanol 상호작용을 완전히 분리하여 분석할 수 없었습니다.
기존의 메탄올 독성학에 근거할 때, 독성 대사산물의 축적은 신장 손상의 가능성 있는 요인으로 생각되었다. 메탄올은 주로 간에서 ADH에 의해 포름알데히드로 대사되고, 이후 포름산으로 대사된다1,3,18,19,20. 따라서 신장은 광범위한 국소적 메탄올 대사보다는 혈중 포름산 및 그로 인한 전신성 대사 장애에 의해 주로 영향을 받았을 수 있다. 다만 메탄올, 포름알데히드, 포름산의 농도와 신장 ADH 활성을 측정하지 않았으므로, 신장 조직 내의 알코올 또는 알데히드 대사의 기여 가능성을 배제할 수 없다. 포름산은 미토콘드리아 cytochrome c oxidase를 억제하여 산화적 인산화를 저해하고 ATP 생성을 감소시키며 조직 독성 저산소증을 유발한다. 이러한 과정은 젖산 산증, 활성 산소 생성 증가 및 세포막 손상으로 이어질 수 있다1,2,3,19,20. 메탄올 대사의 주된 장소인 간과 비교하여, 신장은 포름산의 하위 효과 및 전신성 대사 장애에 특히 취약할 수 있다. 근위 세뇨관 상피세포는 에너지 요구량이 높으며 미토콘드리아 기능 장애, 산화적 스트레스 및 미세혈류 장애에 특히 취약하다. 결과적으로 포름산 매개 저산소증, 대사성 산증 및 염증이 신장 손상에 기여할 수 있다2,8,9,21,22,23. 급성 신손상과 대사성 산증, 호흡 부전, 횡문근융해증, 패혈증 및 다장기 부전 사이의 연관성을 보여주는 임상 연구들은 신장 손상이 전신적인 독성 부담을 반영할 수 있음을 시사한다8,9,10,21. 쥐의 포름산 엽산 의존적 산화 속도가 인간보다 더 빠르다는 점은 실험 모델의 중요한 한계였다1,11,12. 따라서 methotrexate 전처리는 인간 메탄올 중독의 완전한 임상적 및 대사적 특징을 재현하기보다는, 포름산 제거율을 낮추어 메탄올 독성에 대한 민감도를 높이기 위해 사용되었다.
신장 기능 장애는 기존의 생화학적 파라미터와 신장 손상 바이오마커의 종합적인 평가를 통해 입증되었습니다. MTX + Methanol 군에서 나타난 혈청 urea 및 creatinine 농도의 상승은 신장의 여과 및 배설 능력의 저하를 뒷받침했습니다. 신장 cystatin C 및 KIM-1 수치의 증가는 기능적 손상과 더불어 세뇨관 손상이 동반되었음을 시사했습니다. KIM-1이 근위 세뇨관 손상과 연관되어 있다는 점을 고려할 때, 이러한 수치 증가는 세뇨관 상피의 퇴행, 확장 및 괴사와 일치합니다24,25. 또한 cystatin C 수치의 증가는 신장 기능 장애의 존재를 뒷받침했습니다26,27. fomepizole 및 ethanol 투여 군에서 이러한 바이오마커 수치가 낮게 나타난 것은 신장 손상이 완화되었음을 시사하며, 특히 fomepizole 투여 군에서 더 일관된 패턴이 관찰되었습니다. 산화-환원 관련 바이오마커 패턴은 확정된 메커니즘의 증거라기보다 산화적 스트레스가 신장 손상의 잠재적 기여 요인일 수 있음을 나타냈습니다. MDA는 일반적으로 지질 과산화의 지표로 사용되며, GSH는 세포 내 산화-환원 항상성 유지에 기여합니다28,29. 메탄올 중독 및 메탄올 관련 시신경 병증의 실험 모델에서 산화적 스트레스, 지질 과산화 및 항산화 능력의 감소 또한 조직 손상과 연관된 것으로 보고되었습니다10,15,20. MTX + Methanol 군에서 나타난 낮은 혈청 SOD 활성, 높은 혈청 MDA 농도, 낮은 혈액 GSH 수치 및 CAT 활성은 항산화 능력의 감소와 지질 과산화의 증가와 일치했습니다. 다만, 이러한 측정값들이 기저의 미토콘드리아 또는 분자적 메커니즘을 규명한 것은 아닙니다. 해독제 투여 군에서 나타난 낮은 혈청 MDA 농도와 혈청 SOD 및 혈액 CAT 활성의 부분적 회복은 더 양호한 산화-환원 관련 바이오마커 프로필과 부합하며, fomepizole 투여 군에서 보다 일관되게 양호한 패턴이 관찰되었습니다.
MTX + Methanol 군에서 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 수치가 더 높게 나타난 것은 염증성 신장 프로필과 일치했습니다. 이러한 사이토카인들은 경로 특이적이지 않았으며 MTX 자체가 선택된 염증 마커의 변화와 관련이 있었기 때문에, 이 결과는 염증이 신장 손상의 확정된 기전이라기보다 가능한 기여 요인임을 뒷받침했습니다. 포름산으로 매개된 미토콘드리아 기능 장애, 세포 저산소증 및 산화적 스트레스는 염증 경로 활성화의 근거가 될 수 있으며, 따라서 산화적 스트레스와 염증은 메탄올 독성에서 상호 보완적인 과정으로 진행될 수 있습니다1,2,3,15. 메탄올 중독 실험 모델에서는 메탄올 노출과 염증 세포 침윤, 조직병리학적 손상, 그리고 IL-1β 및 TNF-α와 같은 염증성 마커의 수치 증가 사이의 연관성이 보고되었습니다13,15. 이러한 결과는 MTX + Methanol 군에서 관찰된 염증성 사이토카인 수치의 증가와 간질성 염증, 세뇨관 퇴행 및 세뇨관 괴사에 대한 점수 상승과 일치했습니다. 종합적으로, 이 결과들은 독성 대사산물의 영향, 산화적 스트레스, 염증, 미세순환 장애 및 전신 독성 부담을 포함하는 다요인적 과정과 부합하였으나, 이러한 경로들이 직접적으로 평가된 것은 아니었습니다. 해독제 투여군에서 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 수치가 더 낮게 나타난 것은 독성 대사산물의 형성 억제가 염증 반응 또한 제한했을 수 있음을 시사했습니다. 조직병리학적 소견은 신장 손상의 조직 수준 상관관계를 제공하였으며, MTX + Methanol 군은 세뇨관, 사구체, 혈관 및 간질 파라미터 전반에 걸쳐 가장 높은 손상 점수를 보였습니다. 두 해독제 투여군 모두 기술적으로 더 낮은 조직병리학적 손상 점수를 보였으며, fomepizole 투여군이 대부분의 파라미터에서 ethanol 투여군보다 기술적으로 더 낮은 점수를 보였습니다. 그러나 조직병리학적 점수에 대해 추론적 통계 검정이 수행되지 않았기 때문에, 이러한 관찰 결과가 두 해독제 중 어느 하나에 대해 통계적으로 유의미한 조직병리학적 보호 효과나 우월성을 입증한 것은 아니었습니다16,17.
메탄올 중독에서 에탄올과 fomepizole의 해독 효과는 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 매개 대사를 억제하여 포름알데히드와 포름산의 형성을 감소시키는 원리에 기반합니다. 에탄올은 경쟁적 기질로 작용하는 반면, fomepizole는 알코올 탈수소효소의 직접적이고 강력한 억제제로 작용합니다1,3,4,6,7,30,31,32. 두 해독제 치료군 모두에서 관찰된 더 유리한 신장 결과 패턴은 알코올 탈수소효소 억제의 예상 효과와 일치했습니다. 그럼에도 불구하고, 현재의 문헌들은 에탄올 대비 fomepizole의 결정적인 임상적 우월성을 입증하지 않고 있습니다. fomepizole는 투여가 더 간편하고 약동학이 예측 가능하며 부작용 프로파일이 낮아 흔히 선호되지만, 에탄올 역시 여전히 효과적인 대안입니다1,3,4,6,7,30,32. Zakharov 등이 보고한 대규모 메탄올 중독 데이터에서는 사망률, 중환자실 체류 기간 또는 투석 필요성 측면에서 두 해독제 간의 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았으며, 따라서 임상적 우월성에 관한 해석에는 주의가 필요합니다5. Duncan의 사후 검정을 이용한 생화학적 결과 분석에서 fomepizole 치료군과 에탄올 치료군 사이에 통계적으로 유의미한 직접적 차이는 확인되지 않았습니다. 또한, fomepizole는 반복 투여된 반면 에탄올은 단회 투여되었습니다. 투여 경로, 투여 빈도 또는 전신 노출 정도에 대해 요법이 일치하지 않았습니다. 결과적으로 fomepizole와 관련된 기술적으로 더 유리한 패턴은 해독제 간의 차이 외에도 투여 일정, 투여 경로 또는 약물 노출의 차이를 반영했을 수 있으며, 더 뛰어난 생화학적 효능, 임상적 우월성 또는 임상적 치료 선호도를 입증한 것은 아닙니다5,6,30,32. 본 연구의 주요 강점은 혈청 요소 및 크레아티닌, cystatin C, KIM-1, 염증성 사이토카인, 산화환원 관련 바이오마커, 그리고 조직병리학적 점수를 상보적인 기능적, 세뇨관적, 염증성, 산화환원 관련 및 구조적 영역 전반에 걸쳐 통합적으로 평가했다는 점입니다. 이러한 신장 손상 중심 모델은 엽산 의존적 포름산 제거가 감소된 조건 하에서 해독 요법, 보조적 신장 보호 중재 및 신장 손상 바이오마커를 평가하기 위한 유용한 전임상 프레임워크를 제공할 수 있습니다8,9,10,21.
몇 가지 제한 사항이 해석에 영향을 미쳤습니다. 실험 동물 모델과 종 간 대사 차이로 인해 임상적 메탄올 중독으로의 직접적인 일반화에는 한계가 있었습니다. Methotrexate는 신장, 염증 및 산화 결과에 독립적으로 영향을 미칠 수 있으며33, 메탄올 단독 투여군이 없어 메탄올의 효과를 잠재적인 MTX-메탄올 상호작용과 완전히 분리하여 분석하는 것이 불가능했습니다. 메탄올, 포름알데히드, 포르메이트, 에탄올 및 fomepizole의 혈청 또는 조직 농도를 측정하지 않았으며, 조 정제 신장 세포질 분획에서의 ADH 활성을 평가하지 않았습니다. 따라서 대사 민감화, 독성 대사물 형성, 해독제 노출 및 메탄올 대사 억제 여부를 직접적으로 확인할 수 없었으며, 신장 생화학적 결과와의 상관관계 분석을 수행할 수 없었습니다. pH, 중탄산염, 염기 과잉 및 음이온 간격을 포함한 산-염기 변수를 측정하지 않았습니다. 48 h 추적 관찰로는 급성 신장 결과만 평가할 수 있었으며, 신장 회복, 손상의 지속성 또는 가역성, 혹은 만성 구조적 변화를 확립하지 못했습니다. Masson’s trichrome 염색은 콜라겐 양성 영역의 정량적 측정 없이 조직 형태학적으로 평가되었으며, α-smooth muscle actin 발현, 콜라겐 함량 및 4-hydroxyproline 농도를 포함한 분자 또는 생화학적 섬유화 마커는 평가되지 않았습니다. 단일 맹검 병리학자에 의한 조직병리학적 평가는 관찰자 간 일치도 평가를 배제하였으며, 반정량적 병변 등급 분류는 관찰자에 따른 분류의 영향을 받았을 가능성이 있습니다. 해독제 투여 요법이 약리학적으로 동일하지 않았고, 신장 조직 ELISA 농도가 총 단백질 농도로 정규화되지 않았으며, 미토콘드리아 기능 및 세포 사멸 경로에 대한 분자 분석이 수행되지 않았습니다. 또한 표본 크기가 제한적이었으며 수컷 쥐만 포함되었습니다. 향후 연구에는 메탄올 단독 및 MTX 단독 투여군, 비교 가능한 해독제 요법, 메탄올, 포르메이트 및 해독제 농도의 연속 측정, 신장 ADH 활성, 산-염기 측정, 정량적 섬유화 평가, 더 긴 추적 관찰 기간 및 적절하게 설계된 임상 검증이 포함되어야 합니다. 결론적으로, 이 methotrexate 전처리 쥐 모델에서의 메탄올 노출은 신장 기능 저하, 신장 손상 및 염증 바이오마커 증가, 불리한 산화환원 관련 프로파일 및 조직병리학적 손상과 연관이 있었습니다. 두 해독제 치료군 모두 MTX + Methanol 군보다 더 유리한 신장 결과 패턴을 보였습니다. Fomepizole은 평가된 영역 전반에 걸쳐 더 일관되게 유리한 기술적 패턴을 보였습니다. 그러나 해독제 군 간의 유의미한 직접적 생화학적 차이가 없었고, 조직병리학적 비교의 기술적 특성, 불균등한 해독제 요법 및 독성동태학적 측정의 부재로 인해 에탄올 대비 우월성에 대한 결론을 내릴 수 없었습니다. 이러한 발견은 methotrexate 전처리 쥐 모델에 국한되며, methotrexate 전처리 없는 메탄올 노출 후 또는 인간의 메탄올 중독 시 각 해독제의 신장 효과를 확립하는 것은 아닙니다. 이러한 발견의 재현성과 더 넓은 적용 가능성을 평가하기 위해서는 직접적인 독성동태학적 측정, 기전 평가, 비교 가능한 해독제 투여 요법 및 더 긴 추적 관찰을 포함하는 추가 연구가 필요합니다.
공개 사항
저자들은 이해 상충 관계가 없음을 밝힙니다. 본 원고를 작성하는 동안 AI 보조 도구는 언어 편집 및 문법 교정 목적으로만 사용되었습니다. 데이터의 생성, 분석 또는 해석이나 그림, 표 또는 그래픽 요소의 제작에는 어떠한 인공지능 도구도 사용되지 않았습니다. 저자들은 원고의 내용에 대해 모든 책임을 집니다.
감사의 글
본 연구는 Kırşehir Ahi Evran University의 과학 연구 프로젝트 조정 부서(Project No: TIP.A3.26.011)의 지원을 받았습니다. 지원 기관은 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 데이터 해석 또는 원고 작성에 관여하지 않았습니다.
재료
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| 벤치탑 원심분리기 | Nüve | NF048 | 시료 준비 및 원심분리. |
| 비오틴 접합 항체 | BT Lab ELISA 키트 구성 요소 | 키트에 포함됨 | 검출 항체 |
| CAT (카탈라아제) 키트 | Otto Scientific | Otto3051 | EDTA 항응고 혈액 내 카탈라아제(CAT) 활성의 비색 측정법 |
| cOmplete Mini EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche / Sigma-Aldrich | 11836170001 | ELISA 분석을 위한 신장 조직 균질액 준비 과정 중 균질화 완충액에 첨가되었습니다. |
| 크레아티닌 키트 | Otto Scientific | OttoBC139 | 혈청 크레아티닌 수치 측정. |
| 디지털 균질기 | 대한과학 | HG-15D | 조직 균질화 |
| ELx50 자동 스트립 세척기 | Bio-Tek Instruments, USA | ELx50 | ELISA 세척 |
| ELx800 마이크로플레이트 리더 | Bio-Tek Instruments, USA | ELx800 | ELISA 및 비색 분석을 위한 흡광도 측정; ELISA 흡광도는 450 nm에서 측정되었습니다. |
| 에오신 Y (황색) | Merck | 1.15935.0025 | 조직병리학적 염색 |
| 포메피졸 (4-메틸피라졸) | Hüsnü 아르산 <이미지 대체 텍스트="식 1" 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 제공해 주시기 바랍니다."/files/ftp_upload/73284/73284eq1.jpg" 스타일="margin: auto;"/> A.<이미지 대체 텍스트="식 2" 제공된 원본 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요."/files/ftp_upload/73284/73284eq2.jpg" 스타일="margin: auto;"/>., 앙카라, Tü튀르키예 | 기록되지 않음 | 최종 농도 10 mg/mL가 되도록 멸균된 0.9% 염화나트륨 용액에 조제하여, 메탄올 투여 4시간 후 15 mg/kg의 부하 용량을 복강 내 투여하고, 이후 메탄올 투여 12, 24, 36시간 후에 10 mg/kg의 유지 용량을 투여하였다. |
| GSH (글루타치온) 키트 | Otto Scientific | Otto3053 | EDTA 항응고 혈액 내 환원형 글루타치온(GSH) 수치의 비색 측정법. |
| 해리스 헤마톡실린 용액 | BSLAB | BS-002 | 조직병리학적 염색 |
| 염산 (HCl) | Merck | 7647-01-0 | pH 조절 |
| IBM SPSS Statistics | IBM Corp. | IBM SPSS Statistics 버전 29.0 | 통계 분석; RRID:SCR_016479. |
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| 광학 현미경 | Nikon Eclipse | Ni-U | 조직병리학적 검사 |
| Masson's Trichrome 염색 키트 | MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. <이미지 대체 텍스트="식 2" 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 원문 텍스트를 입력해 주세요."/files/ftp_upload/73284/73284eq2.jpg" 스타일="margin: auto;"/>ti., Tü튀르키예) | BKMTO001 | 조직병리학적 염색 |
| MDA (말론디알데하이드) 키트 | Otto Scientific | Otto1001 | 지질 과산화의 지표로서 혈청 내 말론디알데히드(MDA) 수치의 비색법 측정. |
| 메탄올 (≥99.8%) | Sigma-Aldrich, USA | 322415 | 실험적 메탄올 중독을 유도하기 위해 경구 투여(3 g/kg)하였다. |
| 메토트렉세이트 (Emthexate 500 mg/5 mL) | Teva Pharma Belgium | 기록되지 않음 | 시판되는 100 mg/mL 제형을 멸균 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석하여 최종 작동 농도를 0.06 mg/mL로 조절한 후, 5 mL/kg(0.3 mg/kg에 해당)의 용량으로 7일 연속 매일 1회 경구 투여하였다. |
| Mindray 화학 분석기 | Mindray | BS-400 | 혈청 요소 및 크레아티닌 측정. |
| 파라핀 왁스, 조직학 등급 | 기록되지 않음 | 기록되지 않음 | 조직 포매. |
| 인산완충식염수 (PBS) | Merck | P4417 | 조직 헹굼/세척 |
| Rat Cystatin-C ELISA 키트 | BT Lab, 중국 | E0145Ra | 신장 조직 균질액 내 cystatin C 수준의 정량 분석; 분석 민감도, 0.25 ng/mL; 검출 범위, 0.5–100 ng/mL. |
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| Rat IL-6 ELISA 키트 | BT Lab, 중국 | E0135Ra | 신장 조직 균질액 내 IL-6 수준의 정량 분석; 분석 민감도, 0.052 ng/L; 검출 범위, 0.1–40 ng/L. |
| Rat KIM-1 ELISA 키트 | BT Lab, 중국 | E0549Ra | 신장 조직 균질액 내 KIM-1 수치의 정량 분석; 분석 감도, 0.01 ng/mL; 검출 범위, 0.05–10 ng/mL. |
| 쥐 TNF-αα ELISA 키트 | BT Lab, 중국 | E0764Ra | TNF-α 정량 분석α 신장 조직 균질액 내 농도; 분석 민감도, 2.51 ng/L; 검출 범위, 5–1,000 ng/L. |
| RIPA 용해 및 추출 완충액 | Thermo Scientific | 89900 | ELISA 분석을 위한 신장 조직 균질화 및 용해. |
| SOD (Superoxide Dismutase) 키트 | Otto Scientific | Otto3047 | 혈청 내 superoxide dismutase (SOD) 활성의 비색법 측정 |
| 시트르산나트륨 | Merck | 03-04-6132 | 완충액 준비 |
| 수산화나트륨 (NaOH) | Merck | 1310-73-2 | pH 조절 |
| 스테인리스강 급여 바늘 (22 G 경구 투여 캐뉼라) | Instech Laboratories, USA | 기록되지 않음 | 래트의 경구 투여(oral gavage)에 사용되는 재사용 가능한 스테인리스 스틸 캐뉼라. |
| 정지액 | BT Lab ELISA 키트 구성품 | 키트 포함 구성품 | ELISA 반응 종결 |
| 스트렙타비딘 퍼옥시다아제 | Thermo Scientific | SHRP248-B | ELISA 검출 시스템 |
| TMB 기질 용액 | BT Lab ELISA 키트 구성 요소 | 키트 포함 구성품 | 발색 기질 |
| Tris-HCl | Thermo Scientific | 1185-53-1 | 완충액 제조 |
| 요소 키트 | Otto Scientific | OttoBC157 | 혈청 요소 수치 측정. |
| 세척 완충액 농축액 | BT Lab ELISA 키트 구성품 | 키트에 포함됨 | 플레이트 세척 |
| Wistar 알비노 쥐 | Ahi Evran University 실험동물연구소, <이미지 대체 텍스트="식 3" 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주세요."/files/ftp_upload/73284/73284eq3.jpg" 스타일="margin: auto;"/>, Tü튀르키예 | 번식/생산 허가 번호 184 | 남성; 8–12주령; 체중 220g ± 20 g |
| 자일라진 염산염(Rompun) | Bayer, 독일 | 기록되지 않음 | 혈액 및 신장 조직 채취 전 전신 마취. |
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