방법 논문

자기 입자 프로세서를 이용한 인간 분변 시료 수집 및 자동화된 데옥시리보핵산 추출의 표준화된 작업 흐름

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2026년 9월 11일

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1Gut Microbiome Division, SKAN Research Trust, 2Stem Cells Division, SKAN Research Trust

이 논문에서

요약

본 프로토콜의 목적은 자기 입자 프로세서를 이용한 인간 분변 샘플 수집 및 자동 deoxyribonucleic acid 추출 과정을 표준화하는 것입니다.

초록

장내 마이크로바이옴 시퀀싱은 건강한 상태와 질환 상태에서 미생물 군집의 역동성을 조사하는 중요한 접근법이 되었습니다. 미생물 구성의 변화는 당뇨병, 백혈병 및 신경퇴행성 질환을 포함한 여러 생활 습관 및 연령 관련 질환과 연관되어 있습니다. 서로 다른 미생물은 뚜렷한 생리적 특성과 환경적 요구 조건을 나타내므로, 시료의 무결성을 유지하고 기술적 변동성을 최소화하기 위해서는 표준화된 분변 시료 수집, 운송 및 처리가 필수적입니다. 분석 전 처리 과정과 deoxyribonucleic acid (DNA) 추출 중에 발생하는 변동은 후속 마이크로바이옴 분석에 영향을 미치고 데이터 해석에 영향을 줄 수 있습니다. 본 프로토콜의 목적은 MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (핵산 추출 키트)와 KingFisher Flex System (자동 자기 입자 처리 장치)을 이용한 인간 분변 시료 수집 및 자동 DNA 추출을 위한 표준화된 워크플로우를 제공하는 것입니다. 이 워크플로우는 제어된 시료 처리와 자동 핵산 추출을 통합하여 수동 작업의 변동성을 줄이고 절차적 일관성을 향상시킵니다. 본 프로토콜에는 표준화된 분변 시료 수집, 보관, 준비, 자동 추출 및 복잡한 분변 매질로부터의 핵산 회수가 포함됩니다. 대표 결과는 16S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) 유전자 시퀀싱 및 샷건 메타게놈 시퀀싱을 포함한 후속 응용 분석에 적합한 DNA의 성공적인 회수를 보여줍니다. 표준화된 워크플로우는 재현 가능한 시료 처리를 지원하고, 마이크로바이옴 연구의 확장성을 용이하게 하며, 실험 간의 일관성을 증진합니다. 시각적 시연은 장내 마이크로바이옴 연구를 위한 표준화된 분변 시료 처리 및 자동 핵산 추출을 구현하는 데 실질적인 지침을 제공합니다.

서론

장내 마이크로바이옴은 호스트의 대사, 면역 및 신경 기능에 영향을 미치는 복잡한 미생물 생태계이며, 대사 질환, 파킨슨병, 암 및 신경 퇴행을 포함한 다양한 질병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다1,2. 이는 대사, 면역 기능, 영양소 흡수 및 병원성 미생물에 대한 저항성에 영향을 줌으로써 호스트의 생리적 상태를 유지하는 데 중요한 역할을 합니다3,4. 이러한 연관성을 기전적 통찰과 임상 응용으로 전환하기 위해서는 강력하고 재현 가능한 마이크로바이옴 측정법이 필수적입니다. 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술의 발전은 위장관에 서식하는 복잡한 미생물 군집에 대한 우리의 이해를 혁신적으로 변화시켰습니다. 그러나 분변 샘플 수집 절차, 보관 조건, 취급, 운송 및 deoxyribonucleic acid (DNA) 추출 방법과 같은 분석 전 변수는 미생물 군집 구조, DNA 수율 및 시퀀싱 결과에 선택적인 영향을 줄 수 있습니다5,6. 이러한 방법론적 불일치는 흔히 연구 간의 비교를 어렵게 만드는 요인이 됩니다.

중요한 전분석 단계 중에서 DNA 추출은 마이크로바이옴 데이터 품질을 결정하는 가장 영향력 있는 요인 중 하나입니다7,8. 이상적인 추출 프로토콜은 수많은 샘플 전체에서 오염을 최소화하면서 고품질의 고분자량 DNA를 일관되게 생성해야 합니다. 자동화된 핵산 추출 플랫폼은 재현성을 향상시키고, 수동 조작 오류를 줄이며, 오염 위험을 낮추고, 처리량을 높일 수 있습니다. 이러한 자동 추출 플랫폼의 성능은 샘플 균질화, 비드 비팅 조건, 용해 화학물질, 배양 조건 및 자성 비드 처리 방식을 포함한 프로토콜 파라미터에 크게 의존합니다9,10. 따라서 균일한 분변 샘플 수집과 자동 DNA 추출을 통합한 표준화된 워크플로우를 구축하는 것은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 마이크로바이옴 데이터 세트를 생성하는 데 필수적입니다.

본 영상에서는 앞서 설명한 핵산 추출 키트와 자동 자기 입자 처리기를 사용하여 인간 분변 시료의 수집, 취급 및 자동 DNA 추출을 위한 표준화된 워크플로를 제시합니다. 이 프로토콜은 16S 리보솜 리보핵산(rRNA) 유전자 앰플리콘 시퀀싱, 전장 유전체 시퀀싱, 정량적 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 샷건 메타게놈 시퀀싱을 포함한 후속 응용 분석에 적합한 통제된 시료 취급, 효과적인 기계적 및 화학적 용해, 억제제 제거 및 품질 관리 조치를 강조합니다. 시각적 시연을 통해 재현 가능하고 확장 가능한 장내 미생물군집 연구를 지원하기 위한 표준화된 분변 시료 처리 및 자동 핵산 추출에 대한 실질적인 지침을 제공합니다.

프로토콜

본 연구는 SKAN Research Trust 기관윤리위원회의 지침에 따라 수행되었으며, 해당 위원회의 승인을 받았습니다 (승인 번호 SKAN/IEC/2025/04). 시료 수집 전 모든 참여자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.

참고: 모든 시약, 소모품 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 분변 시료 수집 키트 조립

  1. 멸균된 분변 포집기, 스패출러가 부착된 멸균 스크류 캡 수집 튜브(용량 30–50 mL), 안정화 완충액이 미리 채워진 수집 튜브, 일회용 장갑, 흡수제, 생물학적 위험 표시가 된 밀봉 가능한 운송 백 및 지침서가 포함된 분변 시료 수집 키트를 구성합니다(그림 1).
  2. 유성 마커나 미리 인쇄된 라벨을 사용하여 각 수집 튜브에 고유 시료 식별자, 수집 날짜 및 시간을 표기합니다.
  3. 시료 수집 절차, 취급 주의 사항, 보관 조건 및 운송 요구 사항이 설명된 지침서를 동봉합니다.
    ​참고: 안정화 완충액은 분변 수집 키트의 일부로 분변 수집 튜브에 미리 채워져 제공됩니다. 제조사는 안정화 완충액의 조성이나 부피를 공개하지 않습니다. 제조사의 지침에 따라 약 2–5 g의 분변 물질을 완충액이 채워진 수집 튜브에 직접 수집합니다.

분석을 위한 장갑, 튜브, 생물학적 위험물 봉투, 포집기 및 안내 책자가 포함된 분변 샘플 수집 키트.
그림 1. 분변 샘플 수집 키트의 구성 요소. 
분변 샘플 수집 키트는 일회용 장갑, 멸균 분변 포집기, 스패출러가 부착된 멸균 스크류 캡 분변 수집 튜브, 생물학적 위험 표시가 된 밀봉 가능한 운송 봉투, 그리고 참여자에게 제공되는 분변 샘플의 수집, 처리, 보관 및 운송을 위한 안내 책자로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 시료 채취를 위한 피험자 준비

  1. 참가자에게 시료 수집 전 손을 씻도록 안내하십시오.
  2. 분변 시료가 소변으로 오염되는 것을 방지하기 위해, 배변 전 방광을 비우도록 참가자에게 안내하십시오.

3. 분변 포집기를 사용하여 분변 샘플 수집하기

  1. 분변 시료와 변기 물의 접촉을 방지하기 위해 변기 시트에 멸균 분변 수집기를 설치합니다.
  2. 접착식 분변 수집기의 경우, 찢어지지 않도록 표시된 가장자리를 따라 장치를 조심스럽게 펼칩니다. 분변 수집기와 함께 제공된 제조사의 지침에 따라 장치를 변기 시트 뒷부분에 단단히 부착하여 안정적인 수집 표면을 만듭니다.
  3. 비접착식 분변 수집기의 경우, 제조사의 지침에 따라 장치를 변기 볼 위에 배치하여 안정적으로 지지되도록 합니다.
  4. 시료 수집 중에 분변 수집기가 변기 물에 닿지 않도록 주의합니다.
  5. 참가자가 분변 수집기 위에 직접 배변하도록 안내합니다.
  6. 시료를 취급하기 전, 수집 키트에 제공된 일회용 장갑을 착용합니다.
  7. 멸균 수집 튜브를 열고 부착된 스패튤러를 사용하여 대변의 겉면과 내부 핵심부를 포함해 최소 4~5개의 서로 다른 영역에서 분변 물질을 수집합니다. 이 방법으로 일반적으로 약 2–5 g의 분변 물질을 얻을 수 있으며, 이는 DNA 추출에 충분한 양입니다.
  8. 분변 수집기의 가장자리나 외부 표면에 닿은 분변 물질은 수집하지 않도록 합니다.
  9. 시료 수집 직후 수집 튜브를 단단히 닫습니다.
  10. 닫힌 수집 튜브를 수동으로 세게 흔들어 시료가 균일하게 부유하고 큰 덩어리가 남지 않을 때까지 분변 시료와 안정화 완충액을 충분히 혼합합니다.
  11. 밀봉된 수집 튜브를 흡수제가 포함된 누출 방지 생물학적 위험 표시 운송 백에 넣습니다.
  12. 내용물이 쏟아지지 않도록 주의하며 분변 수집기를 대변과 함께 변기에 조심스럽게 넣습니다. 변기 물을 내려 분변 수집기와 대변을 함께 폐기합니다.

4. 분변 샘플 보관 및 운송

  1. 사용된 안정화 완충액의 사양에 따라 샘플을 보관하십시오.
  2. 안정화 완충액이 상온 보존을 지원하는 경우 샘플을 상온에서 보관하십시오. 또는 단기 보관(≤24–48 h) 시에는 4°C에서, 장기 보관 시에는 −20°C에서 −80°C에서 보관하십시오.
  3. 제조사의 권장 사항에 따라 샘플을 보관하십시오. 본 연구에서 사용된 안정화 완충액을 사용하여 수집한 샘플은 상온에서 최대 2년 동안 안정적입니다.
  4. 누출 및 오염을 방지하기 위해 흡수제가 포함된 누출 방지용 생물학적 위험물 봉투에 샘플을 넣어 운송하십시오.
  5. 운송 중 샘플을 권장 온도 조건으로 유지하십시오. 필요한 경우 단열 용기와 냉각제를 사용하십시오.
  6. 생물학적 시료 운송에 관한 기관의 생물안전 지침 및 해당 지역 규정을 준수하십시오.

5. 시료 수령 및 기록

  1. 실험실에 도착한 각 시료의 라벨 표시 적절성, 튜브의 무결성 및 누출 여부를 검사하십시오.
  2. 필요한 경우 실험실 고유 식별자를 부여하고, 수집 날짜와 시간, 보관 조건 및 운송 시간을 기록하십시오.
  3. 누출이 있거나 라벨 표시가 부적절한 경우, 또는 무결성이 훼손된 시료는 제외하십시오.

6. 플레이트 준비

참고: 추출 워크플로를 시작하기 전에 모든 플레이트를 준비하십시오. 시약 및 생물학적 시료를 사용하는 모든 단계는 실험복, 장갑, 보안경 등 적절한 개인 보호 장비를 착용한 상태로 청결한 환경에서 수행하십시오. 그림 2 자동 자기 입자 처리 장치를 보여줍니다.그림 2A), 플레이트 로딩 위치 (그림 2B), 딥웰 플레이트 어댑터 (그림 2C), 플레이트 호환 원심분리기 (그림 2D), 비드 비팅 기기 (그림 2E), 완충 지지대 (그림 2F), 플레이트 홀더 (그림 2G), 96-웰 비드 플레이트 (그림 2H), 딥웰 플레이트 (그림 2I), 및 용리 플레이트 (그림 2J).

원심분리기 및 조직 파쇄기를 포함하여 샘플 준비 및 분석을 위한 실험 장비 설정.
그림 2자동화된 분변 데옥시리보핵산(DNA) 추출에 사용되는 장비 및 소모품. 
(A) 자동 자성 입자 처리 장치. (B) 자동 자성 입자 처리 장치 내의 플레이트 로딩 위치. (C) 원심분리용 딥웰 플레이트 어댑터. (D) 플레이트 호환 원심분리기. (E) 비드 밀 균질기. (F) 비드 비팅 중 사용되는 쿠셔닝 지지대. (G) 비드 비팅용 딥웰 플레이트 홀더(어댑터). (H) 핵산 추출 키트에 포함된 96웰 비드 플레이트. (I) 96웰 딥웰 플레이트. (J) 96웰 용출 플레이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 팁 콤 플레이트를 포장에서 꺼내 장치에 장착할 수 있도록 준비합니다.
  2. 핵산 추출 키트와 함께 제공된 용출 버퍼 200 µL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주하여 용출 플레이트(그림 2J)를 준비합니다. 오염을 방지하기 위해 투명 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 자동 자기 입자 처리기에 장착할 때까지 밀봉 상태를 유지합니다. 플레이트에 '용출 플레이트'라고 표시합니다.
  3. 딥웰 플레이트의 각 웰에 80% 에탄올 1 mL를 분주하여 세척 플레이트 4를 준비합니다. 증발과 오염을 방지하기 위해 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.
  4. 별도의 딥웰 플레이트 각 웰에 갓 준비한 80% 에탄올 1 mL를 분주하여 세척 플레이트 3를 준비합니다. 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.
  5. 딥웰 플레이트의 각 웰에 세척 버퍼 1 mL를 분주하여 세척 플레이트 2를 준비합니다. 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.
  6. 딥웰 플레이트의 각 웰에 세척 버퍼 1 mL를 분주하여 세척 플레이트 1을 준비합니다. 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.

7. 자동 자기 입자 처리 장치 설정

  1. 자동 자기 입자 처리기를 켭니다. 적절한 96-deep-well 자기 헤드와 96-well deep-well 가열 블록이 설치되어 있는지 확인합니다.
  2. 시료를 처리하기 전에 깨끗한 팁 콤과 호환되는 빈 웰 플레이트를 사용하여 적절한 기기 점검 프로토콜(예: Check_96dw_tip 프로토콜)을 실행합니다.
  3. 필요한 추출 프로그램이 자동 자기 입자 처리기에 설치되어 있는지 확인합니다.
    참고: 잘못된 자기 헤드나 가열 블록을 사용하면 핵산 수율이 감소하고 기기가 손상될 수 있습니다.

8. 시료 용해 수행

  1. 96-웰 플레이트 내 각 샘플의 위치를 기록할 플레이트 맵을 준비합니다.
  2. 플레이트 호환 원심분리기(그림 2D)와 어댑터(그림 2C)를 사용하여 96-웰 비드 플레이트(그림 2H)를 2,750 × g에서 10 s 동안 원심분리하여 각 웰 바닥에 비드를 모읍니다.
    참고: 이 단계는 플레이트 씰을 제거하는 동안 비드가 손실되는 것을 방지합니다.
  3. 비드가 흐트러지지 않도록 주의하며 플레이트 씰을 조심스럽게 제거합니다.
  4. 비드 플레이트의 각 웰에 lysis buffer 800 µL를 추가합니다.
  5. 피펫팅 시 비드가 흡입되지 않도록 주의합니다.
  6. 냉동된 분변 샘플을 실온에서 완전히 해동될 때까지 녹입니다. 샘플을 부드럽게 섞어 균질화한 후 즉시 DNA 추출을 진행합니다. DNA의 품질과 수율을 떨어뜨릴 수 있으므로 반복적인 동결-해동 사이클을 피하십시오.
    참고: 신선한 샘플의 경우, 샘플 균질화를 위해 안정화 용액이 포함된 각 분변 샘플 튜브를 5–10 s 동안 볼텍싱합니다.
  7. 균질화된 각 샘플 200 µL를 비드 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다.
  8. 샘플을 옮길 때는 멸균 필터가 장착된 wide-bore (cut) 피펫 팁을 끼운 싱글 채널 피펫을 사용합니다. 비드 손실 및 그로 인한 DNA 수율 감소를 최소화하기 위해 반복적인 피펫팅을 피하십시오.
  9. 모든 웰과 플레이트 가장자리가 완전히 밀봉되었는지 확인하며 접착 필름으로 플레이트를 단단히 밀봉합니다.

9. 기계적 용해(비드 비팅) 수행

  1. 적절한 플레이트 홀더(그림 2G)와 쿠션 지지대(그림 2F)를 사용하여 밀봉된 플레이트를 비드 비팅 장치(그림 2E)에 고정합니다.
  2. 시료 플레이트의 반대편에 동일한 무게의 플레이트를 배치하여 장치의 균형을 맞춥니다.
  3. 장치를 30 Hz에서 2분으로 설정하고 작동을 시작합니다.
  4. 중단 없이 작동이 진행되도록 합니다.
  5. 작동이 완료되면 밀봉 상태가 흐트러지지 않도록 주의하여 플레이트를 제거합니다.
    참고: 비드 비팅 중 플레이트의 손상을 방지하기 위해 쿠션 지지대를 사용하십시오.

10. 용해 후 처리 수행

  1. 균형 잡힌 구성으로 상온에서 2,750 × g로 5분 동안 플레이트를 원심 분리합니다.
  2. 각 웰의 상층액 400 µL를 샘플 플레이트(Sample Plate)로 지정된 새 딥웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.
  3. 이 단계에서 비드가 함께 옮겨지지 않도록 주의하십시오.
    참고: 샘플 플레이트에는 비드가 포함되어 있지 않으며 사전 원심 분리가 필요하지 않습니다.
  4. 즉시 진행하지 않을 경우 샘플 플레이트를 밀봉합니다.
    참고: 필요한 경우 밀봉된 용해물 플레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 또는 밀봉된 샘플 플레이트를 −20°C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오. 추가 처리 전에 샘플을 상온에서 해동하십시오.

11. 결합 비드 혼합물 준비

  1. 샘플당 500 µL의 핵산 결합 버퍼와 20 µL의 자기 비드를 혼합하여 사용 직전에 결합 비드 혼합물을 준비합니다. 균질한 현탁액이 될 때까지 충분히 섞어줍니다.
  2. 샘플 수를 기준으로 필요한 결합 비드 혼합물의 총 부피를 계산합니다.
  3. 96-웰 플레이트 전체를 사용하는 경우, 멸균 원추형 튜브에 48.00 mL의 핵산 결합 버퍼와 1.92 mL의 자기 비드를 넣어 결합 비드 혼합물을 준비합니다. 충분히 섞어 최종 부피 49.92 mL(웰당 520 µL)가 되도록 합니다.
    참고: 피펫팅 오차를 보완하기 위해 한두 개의 웰 분량만큼 추가 부피를 준비하십시오.
  4. 결합 비드 현탁액이 균질해질 때까지 부드럽게 도립 혼합합니다.
  5. 결합 비드 혼합물을 깨끗한 시약 리저버로 옮깁니다.
  6. 분주 직전에 현탁액을 피펫으로 3~4회 상하로 섞어 자기 비드가 가라앉는 것을 방지하고 재현탁합니다.
  7. 멀티채널 피펫을 사용하여 준비된 샘플 플레이트의 각 웰에 결합 비드 혼합물 520 µL를 분주합니다.
  8. 용액의 점도가 높으므로 천천히 피펫팅하고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 모든 웰에 비드가 균일하게 분포되도록 각 분주 단계 전에 시약 리저버의 결합 비드 혼합물을 가볍게 재현탁합니다.

12. MagMAX_Microbiome_Stool_Flex 기기 프로그램을 수정합니다 (수정된 추출 프로그램)

  1. 제조사의 지침에 따라 BindIt 소프트웨어(프로토콜 편집 소프트웨어)를 다운로드하고 설치하십시오.
  2. 제조사 웹사이트에서 기기 프로그램을 다운로드하십시오.
  3. 프로토콜 편집 소프트웨어를 실행하고 초기화될 때까지 기다리십시오.
  4. [열기]를 클릭하고 다운로드한 기기 프로그램을 선택하십시오.
  5. 다음과 같이 기술된 프로토콜 매개변수를 수정하십시오. 표 1.
  6. 수정된 프로토콜을 저장하고 소프트웨어를 종료하십시오.
  7. USB 또는 RS-232C 시리얼 케이블을 사용하여 컴퓨터를 자동 자기 입자 처리기에 연결하십시오.
    주의: 컴퓨터를 연결하기 전에 자동 자기 입자 처리기가 꺼져 있는지 확인하십시오.
  8. 자동 자기 입자 처리기(automated magnetic particle processor)의 전원을 켜고 초기화 과정이 완료될 때까지 기다리십시오.
  9. 프로토콜 편집 소프트웨어를 실행하고 자동 자기 입자 프로세서가 인식되는지 확인하십시오.
  10. 수정된 추출 프로그램을 자동 자기 입자 처리기로 전송하십시오.
  11. 수정된 추출 프로그램이 성공적으로 전송되었는지 확인한 다음, 자동 자성 입자 처리기를 끕니다.
단계작용매개변수
1결합혼합; 5회 수집 사이클; 37°C
2비드 수집5회의 자성 수집 주기
3세척 120초 동안 3회 반복하여 혼합하십시오. 37°C
4세척 220초 동안 3회 반복 혼합하십시오. 37°C
5세척 320초 동안 2회 반복하여 혼합하십시오. 37°C
6세척 4혼합; 1회; 37°C
7건조2분 동안 공기 건조합니다.
8용출75°C; 6회 혼합 사이클; 예열 활성화
9비드 수집3회의 자기 수집 사이클
10용출액 이전정제된 핵산을 용출 플레이트로 옮깁니다.

표 1: 자기 입자 처리기를 위한 자동 추출 프로그램.
deoxyribonucleic acid (DNA) 추출 동안 자동 자기 입자 처리기에 의해 실행되는 자동 추출 프로그램의 요약이다. 이 프로그램은 핵산 결합, 자기 비드 수집, 순차적 세척 단계, 공기 건조, 용출 및 정제된 DNA의 Elution Plate로의 이동을 포함한다. 각 자동 단계에 대한 작동 매개변수가 나열되어 있다.

13. 자동 핵산 추출 수행

  1. 메인 전원 공급 장치를 켠 후 기기 전원 버튼을 눌러 자동 자기 입자 처리기(그림 2A)를 켭니다. 시스템 초기화가 완료될 때까지 기다립니다.
  2. 기기 제어 패널을 사용하여 수정된 추출 프로그램을 선택하고 실행을 시작합니다.
  3. 안내 메시지가 나타나면 팁 콤 플레이트를 7번 위치에 로드하고 Start를 눌러 진행합니다. 플레이트 로드 위치는 표 2(그림 2B)를 참조하십시오.
  4. 용출 플레이트(Elution Plate)에서 밀봉 필름을 제거하고, 올바른 방향(웰 A1이 지정된 위치와 일치하도록)으로 6번 위치에 로드합니다. Start를 눌러 진행합니다.
  5. 80% 에탄올이 포함된 세척 플레이트 4(Wash Plate 4)에서 밀봉 필름을 제거하고, 올바른 방향으로 플레이트를 5번 위치에 로드한 후 Start를 누릅니다.
  6. 80% 에탄올이 포함된 세척 플레이트 3(Wash Plate 3)에서 밀봉 필름을 제거하고, 플레이트를 4번 위치에 로드한 후 Start를 누릅니다.
  7. 세척 플레이트 2(Wash Plate 2)에서 밀봉 필름을 제거하고, 플레이트를 3번 위치에 로드한 후 Start를 누릅니다.
  8. 세척 플레이트 1(Wash Plate 1)에서 밀봉 필름을 제거하고, 플레이트를 2번 위치에 로드한 후 Start를 누릅니다.
  9. 안내 메시지가 나타나면 샘플 플레이트를 올바른 방향으로 1번 위치에 로드합니다.
  10. 기기 덮개를 닫고 Start를 눌러 자동 추출 실행을 시작합니다.
  11. 프로그램이 완료될 때까지(약 35–40분) 중단 없이 실행되도록 둡니다.
    참고: 표 1은 기기에서 실행되는 자동 추출 프로그램의 요약본입니다.
플레이트위치플레이트 유형시약웰당 부피
시료 플레이트196-딥웰 플레이트시료 용해물 + 결합 비드 혼합물920 µL
세척 플레이트 1296-딥웰 플레이트세척 완충액1,000 µL
세척 플레이트 2396-딥웰 플레이트세척 완충액1,000 µL
세척 플레이트 3496-딥웰 플레이트80% 에탄올1,000 µL
세척 플레이트 4596-딥웰 플레이트80% 에탄올1,000 µL
용출 플레이트696-웰 플레이트용출 버퍼200 µL
팁 콤 플레이트7표준 딥웰 플레이트96-딥웰 팁 콤(tip comb)해당 사항 없음

표 2: 자동 핵산 추출을 위한 플레이트 로딩 구성.
자기 입자 프로세서를 이용한 자동 DNA 추출에 사용되는 플레이트 로딩 위치, 플레이트 유형, 시약 및 시약 부피. 샘플 플레이트에는 샘플 용해물과 결합 비드 혼합물이 포함되어 있음. N/A는 팁 콤 플레이트에 액체 시약이 추가되지 않았음을 나타냄.

​14. 핵산 용출 및 보관

  1. 런이 완료되면 기기를 열고, 용출액이 쏟아지지 않도록 주의하며 Elution Plate를 조심스럽게 꺼냅니다.
    참고: Elution Plate에 자기 비드(magnetic bead)가 눈에 보이게 남아 있는 경우, 용출액을 표준 96-well plate로 옮긴 후 자석 스탠드 위에 5–10분 동안 둡니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 정제된 상층액을 새 96-well plate 또는 적절하게 라벨이 부착된 튜브로 옮깁니다.
  2. 용출된 DNA를 적절하게 라벨이 부착된 튜브나 보관용 플레이트로 옮깁니다.
  3. 용출된 DNA는 단기 사용 시 4°C에, 최대 6개월 보관 시 −20°C에, 장기 보관 시 −80°C에 저장합니다.

15. 실행 후 정리 수행

  1. 자동 자기 입자 처리기에서 사용한 모든 플레이트와 팁 콤을 제거하십시오.
  2. 모든 소모품은 기관의 생물 안전 및 화학 폐기물 처리 지침에 따라 폐기하십시오.
  3. 유출물이 있는 경우 적절한 실험실 소독제를 사용하여 세척하십시오.
  4. 자동 자기 입자 처리기를 끈 다음, 메인 전원을 끄십시오.

결과

설명된 수집 워크플로우를 사용하여 7명의 참여자로부터 분변 샘플을 성공적으로 수집하였으며, 후속 처리에 충분한 질량과 적절한 점성을 가진 검체를 확보하였습니다. 샘플은 수집 후 실온에서 보관되었습니다. 대부분의 샘플은 적절한 수집 및 보관 조건과 일치하는 균일한 질감과 색상을 보였으나, 소수의 샘플에서는 참여자 간의 생물학적 차이를 반영하는 것으로 보이는 약간의 점성 변동이 나타났습니다. 운송 과정 중 가시적인 오염이나 누출은 관찰되지 않았으며, 모든 샘플은 수집 키트의 검증된 안정성 기간(실온에서 최대 2년) 내에 처리되어 수집 워크플로우의 견고함과 신뢰성을 입증하였습니다(그림 1).

자동 DNA 추출 워크플로우는 그림 2A의 자동 자기 입자 프로세서, 그림 2B의 플레이트 로딩 구성, 그림 2C의 딥웰 플레이트 어댑터, 그림 2D의 플레이트 호환 원심분리기, 그림 2E의 비드 비팅 장치, 그림 2F의 쿠션 지지대, 그림 2G의 플레이트 홀더, 그림 2H의 비드 플레이트, 그림 2I의 딥웰 플레이트, 그리고 그림 2J의 용출 플레이트를 사용하여 수행되었으며, 표 1에 요약된 자동 추출 프로그램과 표 2에 제시된 플레이트 로딩 구성을 따랐습니다. 대표적인 분변 샘플에 대해 DNA 농도와 순도를 평가하였으며, 그 결과는 표 3에 요약되어 있습니다. DNA 농도는 제조사의 지침에 따라 Qubit 형광 측정기(형광 DNA 정량 분석 장치)로 Qubit double-stranded DNA High Sensitivity assay(형광 DNA 정량 분석법)를 사용하여 측정하였습니다. 샘플을 작동 용액과 혼합하여 실온에서 2 min 동안 배양한 후, 두 가지 분석 표준물과 함께 측정하였습니다. A260/A280 및 A260/A230 흡광도 비율은 NanoDrop 분광광도계(미세 볼륨 분광광도계)를 사용하여 결정하였습니다. DNA 농도는 36에서 87 ng/µL 범위였으며, 모든 샘플이 200 µL의 일정한 부피로 용출되어 준비물 간의 총 DNA 회수량을 직접 비교할 수 있었습니다(표 3).

시료DNA 농도
(ng/µL)		A260/A280A260/A230용리 부피
(µL)		총 DNA 수득량
(ng)
시료 A621.831.7120012,400
시료 B361.891.512007,200
시료 C871.921.8520017,400
시료 D502.031.8720010,000
시료 E551.971.8120011,000
시료 F851.991.8820017,000
시료 G442.011.512008,800
추출 공시료0——2000

표 3: 인간 분변 시료의 자동 추출 후 대표적인 DNA 회수율 및 순도.
인간 분변 시료의 자동 DNA 추출 후 측정된 대표적인 DNA 농도, 순도(A260/A280 및 A260/A230 흡광도 비), 용출 부피 및 총 DNA 수율. DNA 농도는 형광 분석법을 사용하여 결정하였다. 추출 공백 시료는 음성 대조군으로 사용되었으며, 검출 가능한 DNA가 생성되지 않았다.

대표적인 결과는 샘플 간 DNA 회수율의 변동성을 보여주었습니다. Sample A (62 ng/µL), Sample F (85 ng/µL), Sample C (87 ng/µL)에서 높은 DNA 농도가 얻어졌으며, Sample D (50 ng/µL)와 Sample E (55 ng/µL)에서는 중간 정도의 농도가 관찰되었습니다. Sample B와 Sample G는 가장 낮은 DNA 농도(각각 36 ng/µL 및 44 ng/µL)를 나타냈습니다. A260/A280 흡광도 비는 1.83에서 2.03 범위였으며, A260/A230 흡광도 비는 1.51에서 1.88 범위였습니다 (Table 3). 이러한 변동은 분변 검체에서 예상되는 결과이며, 검체 처리와 관련된 기술적 편차 외에도 샘플 조성의 차이 및 생물학적 변동성을 반영하는 것일 수 있습니다. 추출 공백 시료(extraction blank)에서는 검출 가능한 DNA가 나타나지 않아, 추출 과정 중 검출 가능한 오염이 없었음을 나타냈습니다. 박테리아 16S rRNA 유전자의 거의 전체 길이에 대한 대표적인 증폭 결과, 분변 DNA 샘플에서 예상된 약 1.5 kb의 PCR 증폭 산물이 생성되었으며, 템플릿 제외 대조군(no-template control)에서는 증폭이 일어나지 않았습니다 (Figure 3).

겔 전기영동; 16S rRNA PCR 결과; DNA 래더; 레인 분리 과정 분석.
그림 3박테리아 16S 리보솜 리보핵산(rRNA) 유전자 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 산물의 아가로스 겔 전기영동. 
인간 분변 샘플의 DNA 추출 후 범용 프라이머 27F 및 1525R을 사용하여 거의 전체 길이(~1.5 kb)의 박테리아 16S rRNA 유전자를 증폭시킨 결과를 보여주는 대표적인 아가로스 겔 사진. 레인 M: 100 염기쌍(bp) DNA 래더; 레인 1: 템플릿 미포함 대조군(공시료); 레인 2-8: 예상되는 ~1.5 kb PCR 증폭 산물을 보여주는 대표적인 분변 DNA 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

본 프로토콜의 성공적인 수행은 PCR 기반 분석, 16S rRNA 유전자 시퀀싱, 샷건 메타게놈 시퀀싱 및 라이브러리 제작을 포함한 후속 분자 생물학적 응용 분야에 적합한 측정 가능한 DNA의 회수로 입증됩니다. 종합적으로, 이러한 대표적인 결과들은 본 프로토콜이 인간 분변 샘플로부터 DNA를 일관되게 회수함을 보여주는 동시에, 생물학적 시료 간에 나타날 수 있는 변이 범위를 설명합니다.

토론

본 프로토콜은 마이크로바이옴 연구를 위한 인간 분변 시료 수집 및 자동화된 DNA 추출의 표준화된 워크플로를 제공합니다. 주요 단계에는 대변의 여러 영역에서 대표성 있는 분변 샘플링, 안정화 버퍼를 이용한 철저한 균질화, 권장 조건 하에서의 적절한 보관 및 운송, 효율적인 기계적 용해, 그리고 자동 추출 과정 중의 세심한 취급이 포함됩니다. 이러한 단계들을 일관되게 준수함으로써 기술적 변동성을 최소화하고 재현 가능한 DNA 회수를 지원할 수 있습니다. 이전 연구들 또한 시료 수집, 보관 조건, 균질화 및 DNA 추출을 마이크로바이옴 분석의 주요 변동 요인으로 식별하였으며, 재현성 있는 결과를 위한 표준화된 워크플로의 중요성을 강조한 바 있습니다5,6,7,8. 대표 결과는 가시적인 오염이나 누출 없는 성공적인 시료 수집과 테스트된 모든 시료에서 측정 가능한 DNA 회수가 이루어졌음을 보여줍니다.

DNA 회수율에 영향을 미칠 수 있는 여러 절차적 요인이 있으며, 이를 실행 과정에서 고려해야 합니다. 불충분한 기계적 또는 화학적 용해, 불완전한 균질화, 비효율적인 핵산 결합, 또는 전이 및 세척 단계에서의 시료 손실은 DNA 수율을 감소시킬 수 있습니다. 분변 성분의 차이, 미생물 바이오매스 및 시료 일관성의 변동 또한 검체 간 DNA 회수율 차이에 기여할 수 있습니다. 따라서 일관된 결과를 얻기 위해서는 프로토콜의 정밀한 수행, 특히 시료 균질화, 비드 비팅(bead beating) 및 자동 추출 과정에서의 세심한 수행이 중요합니다. 문제 해결 시에는 시료를 처리하기 전 시약 준비, 기기 설정, 플레이트 로딩 및 자동 추출 프로그램의 실행 여부를 확인하는 데 집중해야 합니다. 이와 유사한 권장 사항들이 마이크로바이옴 분석 워크플로우 및 DNA 추출 방법론을 평가한 연구들에서 보고된 바 있습니다5,6,7,8,11.

이 방법의 주요 한계점은 생물학적 시료 간에 관찰되는 DNA 수율의 가변성입니다. 대표적인 결과에서 알 수 있듯이, DNA 농도의 차이는 시료 처리 과정에서 도입된 기술적 변동뿐만 아니라 분변 시료 자체의 내재적인 생물학적 변이를 반영할 수 있습니다. 따라서 DNA 농도만으로 추출 성능을 판단하는 유일한 지표로 삼아서는 안 됩니다. 의도한 후속 응용 분야에 따라 DNA 품질 및 적합성에 대한 추가적인 측정이 필요할 수 있습니다. 후속 분자 분석을 위한 DNA 품질과 적합성을 추가로 평가하기 위해, 공용 프라이머 27F 및 1525R을 사용하여 PCR로 박테리아 16S rRNA 유전자를 증폭하였습니다. 예상되는 약 1.5 kb 크기의 16S rRNA 유전자 단편이 성공적으로 증폭되었음을 아가로스 겔 전기영동(그림 3)을 통해 확인하였으며, 이는 추출된 DNA가 시퀀싱 및 기타 분자 분석을 포함한 후속 응용 분야에 충분한 품질임을 입증합니다. 이전의 벤치마킹 연구들 또한 DNA 수율이 후속 시퀀싱 성능이나 마이크로바이옴 프로파일링 정확도와 반드시 상관관계가 있는 것은 아님을 보여주었습니다8,11.

수동 추출 워크플로우와 비교하여, 자동화된 자기 입자 프로세서는 수작업 처리 과정을 줄이고 추출 조건을 표준화하며, 작업자 간의 변동성을 최소화하면서 고처리량 샘플 처리를 지원합니다9,10. 하지만 대변의 농도 및 미생물 바이오매스의 차이는 용해 효율과 DNA 수율에 영향을 줄 수 있습니다. 또한, 세포벽이 견고한 미생물은 완전히 용해되지 않을 수 있으며, 이는 특정 분류군의 대표성에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이러한 제한 사항에도 불구하고, 자동화된 추출은 대규모 장내 미생물군집 연구를 위한 견고하고 효율적인 접근 방식을 제공합니다5,6,7,8,9,10. 본 프로토콜은 표준화된 분변 샘플 수집과 자동화된 DNA 추출 워크플로우를 결합하여, 다량의 샘플을 일관되게 처리해야 하는 미생물군집 연구에 실용적이고 재현 가능한 접근 방식을 제공합니다. 이와 같은 표준화된 방법론은 연구 간의 재현성을 높여주며, 미생물군집 프로파일링, 메타게놈 시퀀싱 및 기타 시퀀싱 기반 분석을 포함한 하위 분자 응용 분야에 매우 적합합니다5,6,7,8,9,10.

공개 사항

저자들은 상충하는 재정적 또는 비재정적 이해관계가 없음을 밝힙니다.

감사의 글

본 연구가 가능하도록 자원과 협력 환경을 제공해 주신 SKAN Research Trust (India)에 깊은 감사를 표합니다. 또한 팩트 체크와 편집 지원을 도와주신 Anushree Kogje 박사님께도 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
80% 에탄올(절대 에탄올로 조제)MerckET00161000프로토콜에 기술된 대로 절대 에탄올을 사용하여 신선하게 준비하십시오.
흡수성 재료Kimtech34256운송 가방에 포함되어 있습니다.
점착식 플레이트 밀봉 필름Applied Biosystems4306311MicroAmp 투명 점착 필름.
자동 자기 입자 처리기 (96-딥웰 헤드가 장착된 KingFisher Flex Purification System)Thermo Fisher Scientific5400630자동 핵산 추출 시스템
생물학적 위험 표시가 된 밀폐형 운송 백Zymo ResearchR1180검체 운송용 누수 방지 운송백.
BindIt 소프트웨어Thermo Fisher Scientific5189009자동 추출 프로토콜을 수정하고 전송하는 데 사용된 소프트웨어.
스패출러가 부착된 수집 튜브 (30–50 mL)Zymo ResearchR1180멸균 스크류 캡 수집 튜브.
쿠셔닝 지지대QIAGEN69984TissueLyser 어댑터 세트(비드 비팅 중 완충 지지대로 사용됨).
딥웰 플레이트 (96-웰)Thermo Fisher Scientific95040460KingFisher 딥웰 96 플레이트.
일회용 장갑Zymo ResearchR1180파우더 프리 제품 권장.
용출 버퍼Applied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit에 제공됨.
분변 포집기Zymo ResearchR1180멸균 수집 장치
가열 블록 (96-웰 딥웰)Thermo Fisher Scientific기기와 함께 제공됨KingFisher Flex 정제 시스템의 구성 요소.
실험복현지 공급업체제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.개인 보호 장구
용해 버퍼Applied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit에 포함되어 제공됨.
자기 비드Applied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit에 포함되어 제공됩니다.
자성 헤드 (96-딥웰)Thermo Fisher Scientific5400630에 포함됨KingFisher Flex 시스템과 함께 제공되는 96-딥웰 마그네틱 헤드.
마그네틱 스탠드 (96-웰)Thermo Fisher Scientific12332D자기 비드 전이(carryover)가 관찰되는 경우에만 필요함.
멀티채널 피펫Eppendorf312500005296-웰 플레이트에 적용 가능합니다.
NanoDrop 분광광도계Thermo Fisher ScientificND-ONE-WA260/280 및 A260/230 비율을 측정하는 데 사용됨.
핵산 결합 완충액Applied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit에 제공됩니다.
유성 매직Sharpie3002또는 미리 인쇄된 라벨을 사용하십시오.
피펫 팁, 멸균 필터형 (10 µL)Tarsons528100멸균된 눈금 표시 필터 팁.
멸균 여과 피펫 팁 (200 µL)Tarsons528104멸균 눈금 필터 팁.
멸균 여과 피펫 팁 (1,000 µL)Tarsons529106멸균 필터 팁; 프로토콜에 명시된 경우, 넓은 구경 팁(wide-bore tips)을 준비하기 위해 끝부분을 절단하십시오.
원심분리용 플레이트 어댑터Eppendorf5820710004Rotor A-2-DWP-AT 딥웰 플레이트 어댑터.
플레이트 호환 원심분리기Eppendorf5810Rotor A-2-DWP-AT 어댑터와 호환 가능합니다.
비드 비팅용 플레이트 홀더QIAGEN69984TissueLyser 어댑터 세트 2 × 96.
사전 인쇄된 라벨 (선택 사항)브래디BBP12유성 마커의 대안.
Qubit dsDNA HS 분석법Thermo Fisher ScientificQ33231DNA 정량 분석에 사용되는 형광 분석법.
Qubit 형광 광도계Thermo Fisher ScientificQ33327형광 DNA 정량 분석에 사용되는 기기.
시약 저장조Thermo Fisher Scientific8093매트릭스 시약 저장조
시료 안정화 완충액Zymo ResearchR1180DNA/RNA Shield 분변 수집 키트
멸균 원추형 튜브HiMediaTCP106H결합 비드 혼합물 제조에 사용됩니다.
TissueLyser III 비드 밀 균질기QIAGEN9003240기계적 용해 장치
팁 콤 플레이트Thermo Fisher Scientific97002534딥웰 마그넷용 KingFisher 96 팁 콤.
세척 완충액Applied BiosystemsA42357MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit에 제공됨.

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