방법 논문

광유전학적 동적 제어를 위한 32-웰 LED 내장 마이크로플레이트의 제작 및 사용

23 조회수

⸱

DOI:

10.3791/73445

⸱

2026년 9월 22일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 미생물 배양액에서 고처리량 광유전학적 자극과 정량적 유전자 발현 측정을 가능하게 하기 위해, 마이크로플레이트 리더 내부에서 사용할 수 있는 광유전학 연구용 32-웰 발광 다이오드(LED) 내장 마이크로플레이트(LEMOS 2.0)를 제작, 프로그래밍 및 운용하는 방법을 설명합니다.

초록

광유전학적 제어는 빛으로 작동하는 유전자 발현 조절을 가능하게 하며, 살아있는 세포와 전자 시스템 사이의 프로그래밍 가능한 인터페이스를 제공합니다. 그러나 광유전학적 구조체의 일상적인 프로토타이핑은 인프라의 한계로 인해 여전히 제한적입니다. 기존의 폐쇄 루프 플랫폼은 흔히 화학조절기(chemostats), 미세유체 기술, 로봇 핸들링 또는 맞춤형 광학 센서를 필요로 하며, 이는 비용을 증가시키고 접근성을 낮추거나 측정 성능을 제한할 수 있습니다.

본 논문에서는 광유전학 연구를 위해 업데이트된 발광 다이오드(LED) 내장 마이크로플레이트인 LEMOS 2.0을 소개합니다. 이는 표준 마이크로플레이트 리더기 내부에서 광유전학적 자극 및 유전자 회로 특성 분석을 수행할 수 있는 저비용 장치입니다. LEMOS 2.0은 기존의 LEMOS 플랫폼을 기반으로 하며, 마이크로웰의 수를 16개에서 32개로 늘려 처리량을 높였고, 인접한 마이크로웰 간의 빛 누설을 줄여 추가적인 조명 상태로서 암조건을 구현할 수 있게 했습니다. 이 장치는 3차원(3D) 프린팅된 프레임, 각 마이크로웰 옆에 배치되어 개별 제어가 가능한 LED, 충전식 배터리, 그리고 Bluetooth 기반 무선 통신을 위한 온보드 마이크로컨트롤러로 구성됩니다. 생체 적합성 폴리디메틸실록산(PDMS) 마이크로웰은 레플리카 몰딩을 통해 장치 내에 직접 성형되어, 투명한 몰드를 통해 박테리아 배양액에 자극을 줄 수 있습니다. 이 장치는 표준 플레이트 리더기에 장착 가능하며,  흡광도 및 형광 측정을 가능하게 합니다.

본 프로토콜은 장치 제작, 회로 조립, Arduino 프로그래밍, PDMS 마이크로웰 캐스팅, 플레이트 리더 설정, 균주 및 배양 준비, 자동 실험 실행, 장치 세척, 그리고 형광/OD60 데이터 분석을 포함한 전체 LEMOS 2.0 워크플로를 설명합니다. 시연을 위해, 본 프로토콜에서는 녹색광에 의해 sfGFP 발현이 활성화되고 적색광에 의해 억제되는 CcaSR 광유전학 시스템을 사용합니다. LEMOS 2.0은 습식 실험 사용자가 전문적인 바이오리액터나 미세유체 인프라 없이도 광유전학적 섭동 및 유전자 발현 특성 분석을 더 쉽게 수행할 수 있도록 하여, 더 빠른 설계-제작-테스트-학습(design-build-test-learn) 사이클을 가능하게 하는 것을 목적으로 합니다.

서론

광유전학은 살아있는 세포와 전자 제어 시스템 사이에 프로그래밍 가능한 인터페이스를 제공합니다. 빛을 사용하여 유전자 발현을 조절함으로써, 배양액에 대한 섭동을 최소화하면서 시간적 정밀도와 가역성을 갖춘 세포 행동 작동이 가능합니다1. 형광 또는 발광 리포터와 결합될 때, 광유전학 시스템은 생물학적 상태를 전자적으로 측정하고 피드백을 통해 조절할 수 있게 합니다1. 이러한 양방향 광학 인터페이스는 유전자 발현, 세포 성장 및 개체군 구성을 포함한 세포 프로세스의 사이버유전학적 제어를 가능하게 했습니다2,3,4. 하지만 성공적인 폐루프 광유전학 시스템의 상당수는 특수 케모스탯5, 미세유체 장치4,6,7 또는 로봇 샘플링2,3,8을 필요로 하며, 이는 접근성을 제한하고 일상적인 설계-구축-테스트-학습(design-build-test-learn) 주기를 저해할 수 있습니다.

마이크로플레이트 리더기는 미생물 성장 및 유전자 발현 역학을 측정하는 데 가장 널리 사용되는 장비 중 하나입니다. 이러한 장비는 많은 샘플에 대해 신뢰할 수 있는 광학 밀도 및 형광 측정을 제공하고, 환경 제어를 지원하며, 이미 표준 합성 생물학 워크플로우에 통합되어 있습니다9. 하지만 표준 상용 플레이트 리더기의 조명 경로는 광학 측정을 위해 설계되었으며, 배양 성장 중에 프로그래밍 가능하고 웰(well)에 특정한 광유전학적 활성화를 위해 설계된 것은 아닙니다. 결과적으로, 광유전학 실험에는 별도의 조명 장치10,1,12,13,14나 자극 플랫폼과 측정 플랫폼 사이의 로봇 전송8,15, 또는 맞춤형 판독 하드웨어5,16,17가 필요한 경우가 많습니다. 이러한 추가 단계는 시간 분해능을 낮추고, 핸들링 변동성을 유발하며, 폐쇄 루프 제어를 복잡하게 만듭니다.

광유전학 연구를 위한 LED 내장 마이크로플레이트(LED-embedded microplate for optogenetic studies), 즉 LEMOS는 이러한 공백을 메우기 위해 이전에 개발되었습니다18. LEMOS는 배양 마이크로웰 주변에 개별 제어가 가능한 LED가 배치된 마이크로플레이트 리더 호환 장치입니다. 이 장치는 실험 내내 상용 마이크로플레이트 리더 내부에 유지되어, 동일한 플랫폼에서 광자극과 60 nm에서의 형광/광학 밀도(OD60) 측정이 가능하게 합니다. 초기 구현 단계에서 LEMOS는 16개의 배양 마이크로웰을 지원하였으며, 배치 배양에서 유전자 발현의 오픈 루프 광유전학적 자극 및 클로즈 루프 피드백 제어를 입증하는 데 사용되었습니다18. 이 장치는 외부 컴퓨터와 동기화되어 측정 창 동안 LED 조명을 끌 수 있었으며, 이를 통해 형광 및 광학 밀도 판독에 대한 직접적인 간섭을 최소화했습니다.

본 프로토콜은 장치의 업데이트 버전인 LEMOS 2.0과 미생물 배양의 광유전학 실험에 이를 활용하는 방법을 설명합니다. LEMOS 2.0은 독립적으로 제어 가능한 배양 마이크로웰의 수를 16개에서 32개로 늘려 실험 처리량을 높였으며, 단일 실행으로 더 많은 조건, 반복 실험 또는 컨트롤러 설계를 테스트할 수 있도록 재설계되었습니다. 또한, 조명 마이크로웰과 인접한 암흑 마이크로웰 사이의 빛 누설을 줄이도록 장치 설계가 수정되어, 암흑 대조군의 신뢰성과 공간적 패턴 자극 실험의 정확도가 향상되었습니다. 이러한 수정 사항을 통해 본 플랫폼은 비교 광유전학 특성 분석, 다중 조건 컨트롤러 테스트, 그리고 이미 마이크로플레이트 리더를 사용하는 연구실의 일상적인 프로토콜 도입에 더욱 적합해졌습니다.

LEMOS 2.0는 프로그래밍 가능한 적색, 녹색, 청색 또는 암상태 조명을 사용하여 반복적인 OD60 및 형광 측정이 필요한 미생물 회분 배양 실험을 위해 설계되었습니다. 플레이트 리더기는 키네틱 OD60 및 형광 측정, 온도 제어, 진탕, 32개 LEMOS 마이크로웰에 대한 사용자 정의 플레이트 레이아웃 정의, 그리고 Python 제어 스크립트가 모니터링하는 폴더로의 측정 파일 자동 내보내기 기능을 지원해야 합니다. 현재 구현 방식은 BioTek Gen5 v3.14가 탑재된 BioTek Synergy H1 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 검증되었으며, 다른 플레이트 리더기 소프트웨어를 사용하여 구현하려면 내보내기 형식, 파일 파서 및 화면 자동화 단계에 적절한 수정이 필요합니다. 본 장치는 방출 피크가 620–630 nm, 515–525 nm 및 465–475 nm인 LED를 사용하므로, 사용자는 작동 및 판독 스펙트럼이 이러한 채널과 호환되는 광유전학적 액추에이터와 형광 리포터를 선택해야 합니다19,20. 새로운 숙주 균주, 리포터, 광유전학 시스템, 배지, 성장 온도, 샘플링 간격 또는 컨트롤러 설계를 사용할 경우 LED 강도, 듀티 사이클 범위, 블랭크 보정, 형광 정규화 및 컨트롤러 파라미터의 재교정이 필요할 가능성이 높습니다.

본 프로토콜은 장치 제작, 회로 조립, Arduino 프로그래밍, 폴리디메틸실록산(PDMS) 마이크로웰 캐스팅, 플레이트 리더 설정, 균주 및 배양 준비, 자동 실험 수행, 장치 세척, 그리고 형광/OD60 데이터 분석에 이르는 LEMOS 2.0의 전체 워크플로우를 다룹니다. 예시 워크플로우는 박테리아의 광유전학적 유전자 발현 제어에 중점을 두고 있으나, 동일한 프레임워크를 다른 미생물 균주, 형광 리포터, 광유전학적 액추에이터 시스템 및 제어 알고리즘에 적용할 수 있습니다. 프로그래밍 가능한 조명과 표준 플레이트 리더 측정 방식을 결합함으로써, 업데이트된 LEMOS 2.0 플랫폼은 배치 배양에서 고처리량 광유전학적 섭동 및 피드백 제어 실험을 수행할 수 있는 접근성 높은 경로를 제공합니다.

프로토콜

Escherichia coli 균주 MG1655  을 사용하는 모든 실험 절차는 텍사스 A&M 대학교의 지정된 생물안전등급 2단계(BSL-2) 실험실에서 수행하였다. 세균 배양 및 조작은 표준 차단 지침에 따라 인증된 Class II 생물안전 캐비닛 내에서 수행하였다. 모든 절차는 텍사스 A&M 기관 생물안전위원회(IBC)에서 검토 및 승인한 허가 번호 IBC2023-044에 따라 지정된 차단 조건 하에 수행되었다.

1. LEMOS 2.0 프레임 및 LED 어레이 제작

참고: LEMOS 2.0 프레임을 3D 프린팅하고 LED 스트립을 장치 본체에 장착하여 LEMOS 2.0 제작을 시작합니다. 각 LED가 해당하는 마이크로웰 옆에 정확히 위치하도록 기계적으로 안정적인 프레임을 제작하는 것이 목표입니다. 이 단계에서 LED의 정확한 배치가 중요하며, 배치 오류는 자극의 균일성을 저하시키고 마이크로웰 간 광학적 크로스토크를 증가시킬 수 있습니다.

  1. GitHub 저장소(github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0)에 제공된 STL 파일을 사용하여 LEMOS 2.0 내부 프레임과 PDMS 마이크로웰을 위한 주형을 3D 프린팅한다. 프린팅 후 모든 지지재를 제거한다.
    참고: 폴리락틱산(PLA) 필라멘트와 다음의 프린팅 파라미터를 갖춘 열융해 적층 방식(FDM) 프린터 사용을 권장한다: 0.2 mm 층 높이, LEMOS 2.0 프레임은 20% 채움, 주형은 40% 채움.
  2. 납땜 패드의 중앙을 따라 LED 스트립을 잘라 16개의 LED로 구성된 두 조각으로 나눈다. 각 스트립 끝부분에 납땜을 위한 세 개의 납땜 패드가 확보되도록 한다. 자세한 내용은 2절에서 설명한다.
  3. 각 LED 스트립을 반으로 접되, LED가 바깥쪽을 향하도록 한다(보조 그림 1A, 보조 동영상 1).
  4. LED 스트립을 장치의 형상에 맞게 수동으로 성형한 후 마이크로웰 사이에 삽입하되, +5 V 납땜 패드가 아래쪽을 향하고 LED 스트립의 화살표 방향을 확인한다(보조 그림 1A, 보조 동영상 1). 각 LED가 해당 슬롯에 정확히 위치할 때까지 스트립의 위치를 반복적으로 조정한 후 다음 단계로 진행한다.

2. 전기 회로의 조립 및 검증

참고: 무선 장치 작동에 필요한 전원, 충전, 마이크로컨트롤러, 스위치 및 LED 연결을 조립하십시오. 조립 후 LEMOS 2.0 장치는 내장 배터리로 작동되어야 하며, 충전 모듈을 통해 재충전이 가능하고 주변장치 아두이노 보드로부터 LED 명령을 수신해야 합니다. 잘못된 전압 경로로 인해 마이크로컨트롤러나 LED가 손상될 수 있으므로 LED 스트립을 연결하기 전에 각 전원 연결을 확인하십시오.

경고: 본 프로토콜은 납땜에 대한 사전 숙련도가 필요하며, 이에는 적절한 안전 수칙(예: 연기 흡수 장치, 보호 안경 착용 및 화상 예방 방법), 납땜 인두 관리, 그리고 기본적인 스루홀/와이어 납땜 기술이 포함됩니다. 이러한 경험을 갖추지 않은 사용자는 본 절의 절차를 시도하기 전에 교육을 받아야 합니다.

  1. 자재 목록에 나열된 모든 전자 부품을 준비하고, 눈에 보이는 물리적 손상 여부를 점검한다. 배선도(보조 파일 1)를 검토한다.
  2. 스텝업 전압 컨버터를 기본값인 12 V 대신 5 V 출력으로 설정한다. 기판 뒷면의 설정 키를 따르며, 납땜 인두로 열을 가해 패드 A와 B 사이의 연결을 제거한다.
  3. 아두이노 나노 BLE Rev2(BLE 나노로 약칭함)의 VIN 핀을 스텝업 컨버터의 OUT+ 핀에 납땜하고, BLE 나노의 GND 핀을 스텝업 컨버터의 OUT- 핀에 납땜한다(보조 그림 1B).
  4. 스텝업 컨버터의 IN– 핀을 배터리 충전 모듈의 음극(-) 핀에 납땜한다.
  5. 'JST PH 2핀 케이블 – 암 커넥터, 100 mm'의 두 가닥 선을 흰색 하우징에서 배터리 연결부를 당겨 분리한다. 장치 내 적절한 맞춤을 위해 비배터리 연결부 끝에서 각각을 약 70 mm로 잘라낸다(보조 그림 1C).
  6. 스위치를 수정한다. 첫째, 각 모서리의 장착 핀을 제거한다. 둘째, 모든 핀을 원래 길이의 30%로 잘라낸다. 그런 다음 T1, T3 및 B3을 완전히 제거한다(표기법: T = 상단, B = 하단, 핀을 바라보며 왼쪽에서 오른쪽으로 1~4까지 번호 부여, 스위치는 위쪽에 위치함)(보조 그림 1D).
  7. 적색 JST 케이블을 B2에 납땜하되, 나중에 배터리의 수 커넥터와 연결할 수 있도록 배터리 연결부 끝은 노출된 상태로 둔다(보조 그림 1D).
  8. B1과 B4 사이에 연결선을 납땜한다.
  9. 배터리 충전 모듈의 B+ 핀을 B1에 납땜하되, 이전 단계에서 납땜한 연결선이 여전히 B1에 연결된 상태가 되도록 주의한다(보조 그림 1E).
  10. 스텝업 컨버터의 IN+ 핀을 T4에 납땜한다.
  11. 배터리 충전 모듈의 양극(+) 핀을 T2에 납땜한다.
  12. 흑색 JST 케이블을 배터리 충전 모듈의 B– 핀에 납땜한다. 배터리의 수 커넥터에 나중에 연결할 수 있도록 배터리 연결부 끝은 풀어둔 채로 둔다.
  13. 정상적인 장치 작동 모드에서 연결 상태를 확인한다. 납땜 과정에서 풀어둔 배터리 연결선을 통해 리튬이온 배터리를 회로에 연결하고, 스위치는 중앙/꺼짐 위치에 둔다(보조 그림 1E).
  14. 스위치를 왼쪽/켜짐 위치(핀이 2개만 있는 쪽)로 전환한다.
  15. 온보드 전원 LED(USB 포트 옆에 ‘ON’으로 표시됨)를 통해 BLE 나노에 전원이 공급되는지 확인한다. LED는 녹색으로 켜져야 한다(보조 그림 1E, 보조 동영상 1).
  16. 스텝업 컨버터의 온보드 LED를 통해 전원 공급 여부를 확인한다. LED는 파란색으로 켜져야 한다.
    참고: LED 지시등이 켜지지 않으면, 다음 단계를 진행하기 전에 멀티미터로 모든 연결을 확인한다.
  17. 첫 번째 LED 스트립(1.4단계에서 삽입함)을 제거하고, VIN, DIN, GND 패드 두 세트 모두에 와이어를 납땜한다. LED 스트립을 다시 삽입하면서 와이어를 프레임 측면의 포트를 통해 통과시킨다(보조 그림 1F, 보조 동영상 1).
  18. 보조 동영상 1에 따라 두 번째 LED 스트립도 동일하게 반복한다.
  19. 첫 번째 LED 스트립을 BLE 나노의 GND 핀, BLE 나노의 D13 핀, BLE 나노의 VIN 핀에 각각 납땜한다.
    참고: VIN 핀에 납땜할 때는 동일한 아두이노 핀에 두 개의 와이어를 납땜해야 한다. 하나는 핀 구멍 안쪽에, 다른 하나는 나노 보드의 홈이 있는 핀 구멍 바깥쪽에 납땜한다 .
  20. 두 개의 LED 스트립을 서로 납땜하여 연결한다.
  21. 연속성 테스트 모드의 멀티미터를 사용하여 연결 상태를 확인한다. BLE 나노의 VIN 핀과 납땜되지 않은 마지막 LED 패드의 +5 V 패드를 터치하여 테스트한다. GND에 대해서도 동일하게 반복한다.
  22. 핫글루 건을 사용하여 LED 스트립을 고정한다(보조 그림 1F, 보조 동영상 1). 천천히 진행하며 한 번에 하나 또는 두 쌍의 LED만 붙이고, 다음 작업 전에 글루가 완전히 식도록 한다. 필요 시 핀셋을 사용하여 LED를 제자리에 고정한다.

3. 중앙 및 외주 아두이노 보드 프로그래밍

참고: 무선 통신 및 LED 제어에 사용되는 두 개의 Arduino 보드를 프로그래밍합니다. 중앙 Arduino(Arduino Nano IOT 33)는 실험 중 컴퓨터에 연결되어 있으며, Python 스크립트의 명령을 전달합니다. 외부 Arduino(Arduino Nano 33 BLE Rev 2)는 LEMOS 2.0 장치 내에 위치하며 LED 어레이를 제어합니다. 두 보드 모두 실험 시작 전에 적절한 스케치를 업로드받아야 합니다. 다른 장치에 성공적으로 연결되었음을 시각적으로 확인하려면 Arduino 스크립트에 나열된 줄의 주석을 해제하면 됩니다. 중앙 장치 – 34~37행, 노란색 LED 점멸; 외부 장치 – 99~106행, 녹색 LED 점멸. 장치 간 성공적인 연결을 확인한 후에는 해당 줄의 주석을 다시 복구하십시오. 그렇지 않으면 장치가 플레이트 리더 내부에 위치할 때 점멸하는 LED가 켜져 측정 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

  1. GitHub 저장소에서 Arduino 파일(Lemos_Central.ino, Lemos_Peripheral.ino)을 다운로드한다. http://www.arduino.cc/en/software에서 Arduino 통합 개발 환경(IDE)의 최신 버전을 다운로드하여 설치한다.
  2. 보드 관리자(도구 > 보드 > 보드 관리자)에서 최신 보드 패키지 버전을 설치한다 (보조 그림 2A).
    중앙 장치: Arduino SAMD 보드
    주변장치: Arduino Mbed OS Nano 보드
  3. 라이브러리 관리자(도구 > 라이브러리 관리)에서 다음 Arduino 라이브러리를 설치한다 (보조 그림 2B): 주변장치와 중앙 장치 간 블루투스 저전력(BLE) 통신을 위한 'ArduinoBLE' 및 LED 프로그래밍을 위한 'Adafruit_NeoPixel'.
  4. Arduino IDE에서 LEMOS_Central.ino Arduino 파일을 연다.
  5. 유니버설 직렬 버스(USB) 데이터 케이블을 사용하여 해당 장치를 컴퓨터에 연결한다.
  6. 연결된 장치에 맞는 올바른 COM 포트를 선택한다(도구 > 포트). COM 포트가 명확하지 않은 경우 장치를 연결하고 분리할 때 나타났다 사라지는 포트를 확인한다.
  7. 보드 메뉴(도구 > 보드)에서 Arduino Nano 33 IoT 보드를 선택한다.
  8. 스크립트를 장치에 업로드한다.
  9. LEMOs_Peripheral.ino 파일과 주변장치(Arduino Nano 33 BLE Rev 2)에 대해서도 동일한 절차를 반복한다.

4. 레플리카 몰딩을 이용한 PDMS 마이크로웰 제작

참고: 레플리카 몰딩을 사용하여 LEMOS 2.0 프레임 내부에 광학적으로 투명한 PDMS 마이크로웰을 직접 제작하십시오.21 PDMS 마이크로웰은 플레이트 리더 실험 중 박테리아 배양물을 담는 용도로 사용되며, 신뢰성 있는 OD600 및 형광 측정을 위해 기부가 투명하고 기포가 없어야 합니다. 먼지, 기포 또는 불완전한 경화는 웰 간 변동을 유발할 수 있으므로 주조 과정에서 피해야 합니다. PDMS 내부의 먼지나 이물질이 광학적 투명성을 저해하고 마이크로웰 간 OD600 측정 결과의 불일치를 초래할 수 있으므로 주조 전 후드 표면이 깨끗한지 확인해야 합니다.

경고: 경화되지 않은 PDMS를 취급할 때는 후드 안에서 작업하십시오. 경화제와 피부가 접촉하지 않도록 하십시오.

  1. LEMOS 2.0 프레임 내부 중 마이크로웰이 제작되는 부분을 70% 에탄올로 분무하여 소독하되, LED를 제외한 전기 부품에는 직접 닿지 않도록 주의한다. PDMS 마이크로웰 제작 전에 LEMOS 2.0 프레임이 완전히 건조되도록 한다.
    참고: LED에 에탄올을 노출시키는 것은 안전하지만, 다른 모든 전기 부품에는 손상을 줄 수 있습니다.
  2. PDMS 마이크로웰 금형에 이형제를 뿌린 후, 플라스틱 표면에 이형제가 완전히 침착되도록 10분간 기다린다. 추가로 10분 후에 두 번째 도포를 실시하면 금형 이형이 개선될 수 있으나, 이 과정은 선택 사항이다.
    참고: 이형제(예: Ease Release 200)를 사용하면 주형이 소수성을 띠게 되어 경화된 PDMS 마이크로웰에서 주형을 쉽게 분리할 수 있다.
  3. 184 실리콘 엘라스토머의 경화제와 베이스를 일회용 플라스틱 컵 안에서 베이스 대 경화제의 질량 비가 10:1이 되도록 정량하여 혼합한다.
    참고: 하나의 LEMOS 2.0 장치당 2.5 g의 경화제와 25 g의 베이스를 혼합하여 총 27.5 g의 혼합물을 사용하는 것이 권장됩니다. 여러 장치를 동시에 제작할 경우, 비례적으로 양을 증가시킵니다.
  4. 일회용 주걱 또는 나무 막대기를 사용하여 최소 5분 동안 강하게 혼합하면서 컵의 내벽과 바닥을 긁어내어 완전히 섞이도록 한다.
    참고: 철저한 혼합이 중요합니다. 혼합이 부족한 PDMS는 균일하게 경화되지 않으며, 일관성 없는 기준선 OD 값을 산출합니다.600 마이크로웰 전반에 걸친 측정값.
  5. PDMS 혼합물이 들어 있는 컵을 진공 탈기기 안에 놓는다. 혼합물에서 눈에 보이는 모든 공기 방울이 제거될 때까지 진공을 가하여(최소 65 cmHg/25 inHg, 45–60분간) 처리한다. 공기 방울이 표면으로 올라오면서 PDMS가 팽창하여 컵을 넘칠 수 있으므로, 적어도 3배 이상의 용량을 가진 용기를 사용한다.× 혼합물의 부피.
    참고: 경화된 PDMS 내 잔류하는 공기 방울은 마이크로웰 바닥의 광학 투과도를 변화시켜 일관성 없는 기준선 OD 값을 초래할 수 있습니다.600 측정.
  6. 적절한 크기의 클립을 사용하여 LEMOS 2.0 프레임을 외부 케이스의 네 면에 모두 고정하십시오.
    참고: 클립은 외부 셸과 LEMOS 2.0 프레임 사이의 틈새로 스며드는 PDMS의 양을 최소화한다. 이 틈새에 과잉 PDMS가 존재하면 전체 장치의 높이가 증가하고 LEMOS 2.0 프레임이 외부 셸 내에서 수평을 이루지 못할 수 있다. 마이크로웰 근처의 LEMOS 2.0 프레임 하단 주변에 카프톤 테이프를 부착하면 스며듦을 더욱 줄일 수 있다.
  7. 탈기된 PDMS를 LEMOS 2.0 프레임에 조심스럽게 붓는다. 각 마이크로웰에 PDMS를 주사기로 첨가하여 기포를 최소화하면서 충분히 채운다.
    참고: 작은 기포의 형성은 불가피하며, 이 기포들은 결국 표면으로 올라가 사라진다. 탈기한 PDMS는 탈기 직후 바로 붓는 것이 좋으며, 취급 과정에서 기포가 다시 유입되는 것을 최소화하기 위함이다.
  8. 3D 프린팅된 주형을 PDMS로 채워진 프레임에 삽입한다. 주형을 부드럽고 균일하게 눌러 주형의 원형 돌기부가 LEMOS 2.0 프레임의 구멍 안에 정확히 들어가도록 한다. 이 주형은 LED 옆에 정렬된 정사각형 마이크로웰을 형성한다. 가장자리에서 넘친 과잉 PDMS는 깨끗한 린트 프리 와이프로 닦아낸다.
  9. PDMS가 상온에서 경화되도록 한다(25 °C수평면에서 최소 30시간 동안 경화시킨다. 필요 시 장치를 다음 조건에 놓아 경화를 가속화할 수 있다. 37 °C 4시간 동안 유지하되, PDMS에서 눈에 보이는 모든 공기 방울이 제거된 후에만 진행한다.
    주의: LEMOS 장치를 온도가 위를 초과하는 환경에 노출하지 마십시오. 37 °C, 이로 인해 내장형 리튬이온 배터리가 과열되어 파열될 수 있기 때문이다.
  10. PDMS 마이크로웰이 경화된 후 가장자리를 잡고 일정한 힘으로 위로 당겨 캐스팅 몰드를 제거한다. PDMS 마이크로웰이 프레임 내에 남아 있도록 한다.
  11. 각 마이크로웰을 점검하여 벽면이 광학적으로 투명하고 바닥에 기포가 없는지 확인한다. 신규 PDMS 마이크로웰이 장착된 LEMOS 2.0 장치는 이제 사용 준비가 완료되었다.

5. 마이크로플레이트 리더 및 데이터 내보내기 워크플로우 설정

참고: 마이크로플레이트 리더를 설정하여 LEMOS 2.0과 호환되는 동역학적 측정을 수행하고 데이터 내보내기를 자동화하십시오. 리더는 사용자 정의 LEMOS 2.0 마이크로웰 배치를 인식하고, 정해진 간격으로 OD600 및 형광 측정값을 획득하며, 데이터 파일을 파이썬 제어 스크립트가 모니터링하는 폴더로 내보내야 합니다. 생물학적 실험에 앞서 멸균 배지를 사용하여 기준선 측정을 수행하여 PDMS 마이크로웰과 플레이트 리더 설정이 일관된 측정값을 제공하는지 확인하십시오. 본 프로토콜에서는 BioTek Gen5 소프트웨어 v3.14를 통해 작동하는 BioTek Synergy H1 마이크로플레이트 리더를 사용합니다.

  1. Gen5를 실행합니다.
  2. Plate Types로 이동하여 GitHub에서 LEMOS 2.0.xml을 가져오거나, Supplementary File 2 (섹션 1)  및 Supplementary File 3을 참조하여 Gen5에서 LEMOS 2.0용 맞춤형 플레이트 레이아웃을 설정합니다.
  3. LEMOS 2.0 장치를 사용하여 기준선 측정을 수행합니다(200 µL의 무균 M9CA 배지를 넣은 마이크로웰에 의료용 밀봉 필름[예: Breathe-Easy 필름]을 덮음). 32개 마이크로웰의 OD600 및 형광 기준값을 기록하고 이 값을 표준 96웰 마이크로플레이트에서 얻은 값과 비교합니다. 큰 차이가 관찰되는 경우, 경화된 PDMS 내의 기포나 잔여물이 가장 가능성 높은 원인이므로 PDMS 마이크로웰을 다시 주조합니다.
    참고: Breathe-Easy 필름은 기체 투과성이 있어 세포 성장에 필요한 호기 조건을 유지하면서도 광학적으로 투명하여 형광 및 OD600 측정에 방해를 주지 않습니다.
  4. GitHub 저장소에 있는 실험 프로토콜 closed_loop_protocol.prt을 Gen5에서 엽니다.
    참고: 편의를 위해 GitHub 저장소에 사전 설정된 실험 파일 템플릿.xpt도 제공됩니다. 그러나 Gen5의 서로 다른 버전을 사용하는 사용자를 위한 문제 해결 참고를 위해 설정 내용이 Supplementary File 2 (섹션 2) 및 Supplementary File 3 에 자세히 설명되어 있습니다.

6. LEMOS 2.0 실험을 위한 박테리아 배양 준비

참고: LEMOS 2.0 옵토제네틱스 시간 경과 실험을 위해 박테리아 배양물을 준비한다. 시작 밀도와 실험 전 조명 노출이 측정된 유전자 발현 역학에 영향을 줄 수 있으므로, 배양 준비 시 주의가 필요하다. 시연용 균주는 pSR58.6 및 pNO286-322을 보유한 Escherichia coli (E. coli) MG1655이다. pSR58.6은 PcpcG2 하에서 발현되는 초접힘 녹색형 형광단백질(sfgfp)과 구성형 CcaR, 클로람페니콜 내성, pColE1 기원을 포함한다. pNO286-3은 구성형 CcaS, 스펙티노마이신 내성 및 p15A 기원을 포함한다. 이 두 플라스미드는 함께 녹색 빛으로 유도되고 적색 빛으로 억제되는 유전자 발현 시스템을 재구성한다. pSR58.6과 pNO286-3은 표준 열충격 형질전환법을 사용하여 화학적으로 형질전환 능력을 부여받은 E. coli MG1655에 도입되었다23. 플레이트는 주변 빛으로부터 세포를 보호하여 옵토제네틱스 회로의 조기 활성화를 방지하기 위해 상자 안에 보관하였다.

  1. CcaSR 옵토제네틱 균주와 형광 음성 대조 균주 각각의 단일 집락을 50 µg/mL 스펙티노마이신 및 25 µg/mL 클로람페니콜이 보충된 2 mL의 M9CA 영양육체가 들어 있는 개별 14 mL 원형 바닥 배양관에 접종한다. 실험 전 과정에서 모든 후속 배양 단계에 동일한 배지 조성을 사용한다.
  2. 각 배양관을 알루미늄 호일로 덮고 37 °C에서 220회전/분의 속도로 진탕하며 밤새(14–16시간) 배양한다.
    참고: 호일로 감싸는 것은 어두운 조건을 유지하여 CcaSR 시스템의 의도하지 않은 활성화를 방지한다. 또는, 실험 시작 전 시스템의 억제 상태를 보다 정확히 모사하기 위해 2절에서 설명한 동일한 전기 배선이 연결된 LED 케이스 내에 배양관을 넣고 지속적인 적색광 하에서 배양할 수도 있다.
  3. 전날 밤 배양한 배양액 각각 100 µL을 새로운 호일로 감싼 배양관 내의 신선한 배지 2 mL로 옮긴 후, 37 °C에서 220회전/분의 속도로 진탕하며 4시간 동안 배양한다.
  4. 4시간 후 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 소배양의 OD600을 측정한다.
    참고: 배양액은 OD600이 0.4–0.6에 도달해야 한다.
  5. 각 배양액을 신선한 배지로 OD600 = 0.1이 되도록 희석한 후, 기포 형성을 피하면서 주의하여 LEMOS 2.0 장치의 각 마이크로웰에 200 µL씩 피펫팅하고, 의료용 밀봉 필름으로 장치를 밀봉한다.

7. LEMOS 2.0 옵토제네틱 시간 경과 실험의 시작

참고: 마이크로플레이트 리더, 중앙 아두이노, 파이썬 제어 스크립트를 조정하여 자동화된 LEMOS 2.0 실험을 시작하십시오. 실행 중에는 컴퓨터가 플레이트 리더 측정, 데이터 내보내기, 블루투스 통신 및 LED 구동을 조정합니다. 파이썬 스크립트가 화면 기반 자동화를 사용하여 플레이트 리더 소프트웨어와 상호작용하므로 Gen5 창이 계속 표시되는 것이 중요합니다. 성공적인 시작은 예상 폴더에 데이터 파일이 생성되고, 터미널 출력에서 블루투스 통신이 확인되며, 각 제어 간격마다 LED 명령이 업데이트되는 것으로 확인할 수 있습니다.

  1. LEMO 2.0 장치의 전원을 켜려면 스위치를 왼쪽으로 밀어주세요. LEMOS 2.0의 LED 스트립에서 첫 번째 LED가 녹색으로 점등됩니다.
  2. 중앙 아두이노를 USB를 통해 컴퓨터에 연결하고, 아두이노 IDE의 드롭다운 메뉴(도구 > 보드)에서 해당 보드를 선택하세요.
  3. 시리얼 모니터를 열고, LEMOS 2.0에 장착된 외부 아두이노를 중앙 아두이노에 연결하세요.
  4. 시리얼 모니터에 문자 'o'를 입력하여 LED 스트립의 지시등을 끄세요.
  5. Gen5에서 실험 파일 LEMOS-start-data.xpt을 열고 장치 내 배양물의 기준값을 측정하여 OD600 및 형광 값이 기대되는 수준과 일치하는지 확인하세요. 이후 실험 파일을 닫으세요.
  6. 5.4단계에서 저장한 프로토콜 파일을 Gen5에서 열고, 보조 파일 2(섹션 3) 및 보조 파일 3을 참조하여 실험 파일로 저장하세요.
  7. 시스템에 Python 3.10 이상이 설치되어 있는지 확인하고, 제공된 requirements.txt 파일을 사용하여 필요한 패키지를 설치하세요.
  8. Visual Studio Code 또는 Spyder와 같은 적절한 IDE에서 control_duty_cyle.py(듀티 사이클 실험용) 또는 control_pid.py(PID 실험용) 파일을 열세요.
    참고: 작업 디렉터리를 모든 파이썬 스크립트가 포함된 폴더로 설정하여 스크립트 실행 중에 다른 스크립트를 임포트할 수 있도록 하세요. IDE 선택은 중요하지 않습니다.
  9. 파이썬 스크립트의 메인 섹션에서, file 변수를 7.6단계에서 선택한 Gen5 실험 파일의 이름과 일치하도록 수정하세요.
  10. 실험 파일과 파이썬 스크립트를 나란히 배치하세요(그림 1).
  11. Gen5 실험에서 실행을 클릭한 후, 운동학적 단계가 시작되면 즉시 중단하세요.
    참고: 파이썬 스크립트는 실행을 클릭한 후 계속 버튼을 찾습니다. 그러나 새 실험 파일의 경우 두 번째 측정이 이루어지거나 운동학적 실행이 중단될 때까지 이 버튼이 표시되지 않습니다.
  12. 파이썬 스크립트를 실행하세요. 실행 중에는 Gen5 창을 최소화하거나 다른 창으로 가리지 마세요.
    참고: 파이썬 스크립트는 화면 기반 자동화를 사용하며, 각 운동학적 사이클 후 데이터 내보내기를 처리하기 위해 약 20분 간격으로 Gen5 창을 인식할 수 있어야 합니다. 이 시간 동안 창을 가리거나 최소화하면 실험이 방해받을 수 있습니다.

8. 장치 청소, PDMS 제거 및 배터리 재충전

참고: 실험 후 LEMOS 2.0 장치를 청소하고 재설정하십시오. 박테리아 배양물과 사용한 PDMS 마이크로웰을 제거하고, 재사용 가능한 프레임과 쉘을 소독한 후 다음 번 사용을 위해 배터리를 충전하십시오. 청소 시 LED가 아닌 전자 부품을 에탄올이나 과도한 기계적 힘에 노출하지 않도록 주의하십시오.

  1. 의료용 밀봉 필름을 LEMOS 2.0 장치 상단에서 조심스럽게 벗겨내고 폐기한다.
  2. 각 마이크로웰에서 피펫을 사용하여 모든 세포 현탁액을 흡인하고 생물학적 폐기물 처리 절차에 따라 폐기한다.
  3. 균일하고 일정한 힘을 가해 외부 쉘을 LEMOS 2.0 프레임에서 분리한다. PLA 프레임이 과도하게 굽거나 비틀리지 않도록 주의하며, 이는 균열이나 영구적인 변형을 유발할 수 있다.
  4. 프레임 외부의 벌크 PDMS 층을 벗겨내고, 트위저를 사용하여 LEMOS 2.0 프레임에서 PDMS 마이크로웰을 조심스럽게 제거한다.
  5. LED를 제외한 전기 부품과의 직접 접촉을 피하면서 70% 에탄올로 LEMOS 2.0 프레임과 외부 쉘을 소독한다. 이는 4.1단계에서 설명한 대로 수행한다.
  6. 다음 실험을 위해 리튬 이온 배터리를 재충전한다:
    1. 스위치를 오른쪽(충전 위치)으로 밀어 넣는다.
    2. USB를 충전 모듈에 연결한다.
    3. 온보드 LED를 통해 충전 상태를 확인한다. 충전 중에는 LED가 깜박인다(보조 그림 1E).

9. 형광 및 성장 역학 분석

참고: LEMOS 2.0 실험 중에 생성된 형광 및 OD600 데이터를 처리하세요. 분석 노트북은 내보낸 마이크로플레이트 리더 데이터를 불러와 블랭크 및 음성 대조군 보정을 적용하고 정규화된 형광 값을 계산한 후 시간 경과에 따른 그래프를 생성합니다. 노트북을 실행하기 전에 마이크로웰 배정 및 조건 레이블이 실험 설계와 일치하는지 확인하세요.

  1. FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb 또는 FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb 파일 중 하나를 엽니다.
    참고: 이 과정에서는 실행 중에 생성되어 다음 파일에 저장된 형광(FL) 및 광학밀도(OD) 데이터를 사용합니다: Datafile/fl.csv 및 Datafile/od.csv. PID 분석 시트는 또한 설정값(set point)에 대한 발현 오차를 Datafile/errors.csv에서 가져와 사용합니다.
  2. 조건 이름과 웰(well)을 포함하는 조건 변수를 설정합니다.
  3. neg_wells를 음성 대조군 마이크로웰 이름의 대괄호로 묶인 목록으로 설정합니다.
  4. 공백 웰(blank well)이 실행되지 않았을 경우 알려진 값으로 설정하거나, 공백 웰의 평균값으로 od_blank와 fl_blank를 설정합니다.
  5. colors_4_figures를 원하는 색상으로 설정합니다(이름이 지정된 색상의 전체 목록은 https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html 에서 확인 가능).
  6. 결과 도식의 원하는 너비와 높이(인치 단위)로 figsize를 설정합니다.
  7. 상수(Constants) 항목 아래에 나열된 파일 이름을 확인합니다.
  8. 노트북을 실행하면 도식이 .png 파일로 생성됩니다.

10. 문제 해결

  1. LED 배선 중에 LED 납땜 패드가 떨어져 나간 경우, 다음 사항을 고려하십시오:
    1. LED 스트립의 모서리를 구부려 전선을 배선 포트에 더 쉽게 통과시킵니다.
    2. 더 딱딱한(단선) 와이어를 사용한 경우, 더 유연한(다심선) 와이어로 교체하십시오.
  2. 스위치를 켰음에도 BLE Nano의 전원 LED가 켜지지 않는 경우 다음 사항을 고려하십시오:
    1. 먼저 배터리가 충전되었는지 확인하십시오. 스위치를 충전 모드로 설정하고 충전 모듈을 전원에 연결하십시오. 배터리가 충전된 경우, 몇 분 후 지시용 LED가 깜빡이지 않고 녹색으로 지속적으로 켜져야 합니다. 배터리가 완전히 방전된 경우에는 다시 시도하기 전에 충전이 완료될 때까지 충분히 충전하십시오.
    2. 배터리를 충전했음에도 LED가 켜지지 않는 경우, 멀티미터를 사용하여 BLE Nano의 VIN 및 GND 핀 사이의 전압을 측정하십시오.
      1. 0 V: 배선 연결이 끊어졌습니다. 배터리에 연결된 각 납땜 접합부를 점검하십시오. > 스위치 > 스텝업 컨버터 > 나노 팁을 사용하여 차가워 보이거나 불완전한 모든 납땜 접합부를 재가열하고 리플로우하십시오.
      2. 5 V: 나노에 전원이 정상적으로 공급되고 있으므로 보드 자체에 손상이 있을 수 있습니다. 케이블을 통해 나노에 전원을 공급하여 이를 확인하십시오. 전원 LED가 여전히 켜지지 않으면, 불량인 나노를 제거하고 새로운 나노를 납땜하여 교체하십시오.
      3. 5V 초과: 스텝업 컨버터가 5V 출력으로 설정되지 않았습니다. 장치 조립 섹션에 설명된 대로 스텝업 컨버터의 패드 A와 B가 분리되었는지 확인하십시오.
  3. Python 스크립트가 실행되지 않을 경우 다음 사항을 고려하십시오:
    1. Python 스크립트가 독립된 파일이 아니라 전체 프로젝트 폴더 내에서 열렸는지 확인하십시오. control_duty_cycle.py와 control_pid.py는 다른 로컬 모듈에 의존하므로 개별적으로 열면 실행에 실패합니다.
    2. Arduino IDE가 닫혀 있는지 확인하십시오. 아두이노는 동시에 하나의 활성 연결만 허용하기 때문입니다. 운영체제는 포트를 먼저 여는 프로그램에 접근 권한을 부여합니다.
    3. Gen5 프로토콜이 올바르게 설정되었는지 확인하십시오. 특히 다른 소프트웨어를 사용하는 경우 다음을 참조하십시오. 보충 파일 2 (2절)
    4. 필요한 패키지가 설치되어 있는지 확인하십시오. 가상 환경을 생성하고 requirements.txt 파일에 나열된 대로 패키지를 설치하십시오.
  4. 예기치 않게 실험이 중단된 경우, 다음 사항들을 고려하십시오:
    1. 첫 번째 사이클 후 중단됨: Gen5 데이터 내보내기 경로가 잘못 설정되었을 가능성이 있습니다. 내보내기 대상 경로가 Python 스크립트가 읽어들이기를 기대하는 폴더와 일치하는지 확인하세요. 파일 변수
    2. 몇 사이클 후에 중단됨: PyAutoGUI는 화면 해상도, 디스플레이 배율 또는 창 크기가 변경된 후에 화면 요소를 인식하지 못하는 경우가 종종 있습니다. 스크립트에서 사용하는 기준 스크린샷을 다시 캡처하고 Gen5 창이 실행 중에는 항상 활성 상태로 화면 전경에 있도록 유지하십시오. Python IDE 창은 최소화할 수 있습니다.
    3. Gen5에서 챔버 온도가 목표 범위를 벗어났다고 보고하는 경우, 계속 진행하기 전에 리더기가 평형을 이루도록 기다리십시오. 온도 경고를 무시하지 마십시오. 무시할 경우 수동으로 닫아야 하는 감사 보고서 창이 생성되어 자동화가 방해받을 수 있습니다.
  5. 비정상적으로 높거나 일관성이 없는 OD 값이 나타나는 경우600마이크로웰 전체의 형광 기준값을 관찰할 때는 다음 사항을 고려하십시오.
    1. PDMS 마이크로웰 내에 포획된 먼지나 잔해물이 있는지 점검하라. 이러한 오염물질은 빛을 산란시켜 측정값을 과대평가하게 만든다.
    2. PDMS를 주조 또는 사용 전에 장시간 동안 덮개 없이 공기 중에 노출시키지 않도록 주의하십시오.
  6. 실험을 수행함에도 불구하고 세포가 빛에 대해 검출 가능한 반응을 보이지 않는 경우, 다음 사항들을 고려해 보십시오:
    1. LED 확인 "켜짐" 명령이 IDE 터미널 출력과 BLE 통신 로그를 모두 확인함으로써 실행되고 있다.
    2. 명령이 전송되고 있지만 불이 보이지 않는 경우, 멀티미터를 사용하여 LED 납땜 연결부를 점검하십시오.

결과

LEMOS 2.0는 프로그래밍 가능한 광유전학적 자극과 정량적 유전자 발현 측정이 가능한 32-웰 마이크로플레이트 리더 호환 플랫폼24입니다 (그림 2A,B). 각 마이크로웰은 개별 주소가 지정된 WS2812B 발광 다이오드(LED)와 쌍을 이루며, 이는 Adafruit_NeoPixel 라이브러리를 통해 Arduino Nano 3 BLE Sense Rev2로 제어됩니다. 이 장치는 블루투스를 통해 외부 컴퓨터와 통신하여 실험 중에 조명 명령을 업데이트할 수 있습니다. 사용 전, 복제 몰딩법을 통해 새로운 PDMS 마이크로웰을 장치 내에 성형합니다 (그림 2C,D). 30 °C의 지속적인 LED 조명 하에 LEMOS 2.0에서 배양된 E. coli 배양액은 마이크로웰 전반에서 재현 가능한 성장을 보였으며, 이는 이 장치가 실험 과정 동안 박테리아 배양 및 플레이트 리더 측정을 지원함을 나타냅니다18 (그림 2E). 또한, 성장 곡선이 조명 조건 전반에서 유사하게 나타나, 이러한 설정 하에서 LED 노출이 세포 성장에 측정 가능한 영향을 미치지 않았음을 보여주었습니다.

광유전학적 유전자 발현 제어를 입증하기 위해, 녹색광에 의해 활성화되고 적색광에 의해 억제되어 sfGFP 발현을 조절하는 2성분계인 CcaSR v3.0 시스템을 도입하였다2 (그림 3A). 녹색광 조건에서 CcaS는 자가인산화되어 인산기를 응답 조절자인 CcaR로 전달하며, 이 CcaR는 이량체를 형성하여 PcpcG2 프로모터 의존적인 sfGFP 발현을 활성화한다. 적색광 조건에서 CcaS는 탈인산화되며, 이에 따라 PcpcG2 활성이 감소하여 sfGFP 발현이 억제된다. CcaSR 플라스미드를 E. coli MG1655에 형질전환하여 본 프로토콜에 기술된 실험에 사용하였다 (그림 3B). 실험 과정 동안 마이크로플레이트 리더를 사용하여 10분마다 OD60 및 형광을 측정하였다. LED 조명이 광학적 측정에 간섭하는 것을 방지하기 위해, 각 10분 간격의 시작과 끝에 있는 측정 시간 동안에는 LED가 꺼지도록 프로그래밍하였다 (그림 3C).

먼저 암조건의 마이크로웰을 지속적인 녹색광 조명 하의 마이크로웰과 수직 또는 수평으로 인접하게 배치하여 웰 간 크로스토크를 평가하였다(그림 3D). 지속적인 녹색광 마이크로웰에 인접한 암조건 마이크로웰은 조명된 인접 마이크로웰이 없는 암조건 마이크로웰과 비교했을 때 발현의 유의미한 증가를 보이지 않았으며, 이는 마이크로웰 간의 빛 누출이 최소화되었음을 나타낸다. 이러한 결과를 바탕으로, 웰 간 크로스토크를 최소화하면서 충분한 광자극을 제공하기 위해 이후 실험에서는 25분의 1의 펄스 폭 변조(PWM) 값을 사용하였다.

그 후 LEMOS 기반 광유전학적 제어를 위한 작동 파라미터를 정의하기 위해 개방 루프 자극(Open-loop stimulation)을 사용하였다. 작동 파라미터는 녹색광 듀티 사이클(duty cycle)로 정의되었으며, 이는 각 활성 조명 창에서 녹색광에 할당된 비율을 의미하고 나머지 조명 시간은 적색광에 할당되었다. 각 제어 간격은 10 min 동안 지속되었으며, 플레이트 리더 측정과의 간섭을 피하기 위해 LED는 8 min 동안 활성화되고 나머지 2 min 동안은 꺼진 상태를 유지하였다. 5%에서 80% 사이의 녹색광 듀티 사이클은 단계적인 sfGFP 발현을 유도하였으며, 이는 듀티 사이클이 광유전학적 조절을 위한 조정 가능한 입력값으로 사용될 수 있음을 보여준다(그림 3E). 발현율은 듀티 사이클이 5%에서 40%로 증가함에 따라 증가하였으나, 그 이상의 듀티 사이클에서는 유의미한 추가 증가가 나타나지 않았으며(그림 3F), 이는 더 긴 녹색광 자극 하에서 시스템이 포화 상태에 도달함을 시사한다.

마지막으로, LEMOS 2.0이 설정된 목표값(set point)을 향해 유전자 발현을 동적으로 조절할 수 있는지 테스트하기 위해 폐루프 피드백 제어(closed-loop feedback control)를 구현하였습니다.25 (그림 4A). 제어 시스템 구성 요소는 다음과 같이 지정되었습니다: 액추에이터 — LED, 컨트롤러 — PID 스크립트가 실행되는 외부 컴퓨터, 측정 출력 — OD로 정규화된 sfGFP 형광600컨트롤러는 측정된 FL/OD 값을 비교하였습니다.600 할당된 설정값과 값을 비교하여 다음 10분 간격의 녹색광 듀티 사이클(duty cycle)을 업데이트했다. 비례-적분-미분(PID) 제어를 구현하였으며, 각 사이클에서의 녹색광 노출 시간은 t초록색은 다음과 같이 계산되었습니다:
figure-results-1

여기서 e(t)는 시간 t에서 측정된 FL/OD60 신호와 설정값 사이의 오차입니다. K는 비례 이득, τI 는 적분 시간 상수, τD는 미분 시간 상수입니다. 폐루프 제어 파라미터는 이전에 보고된26 성장 단계별 유전자 발현(GEAGS) 모델을 사용하여 선택되었습니다. 이러한 파라미터를 사용하여 측정된 신호가 목표 FL/OD60 설정값에 도달하고 이를 추적하였습니다(그림 4B).

해당 듀티 사이클 명령은 그림 4C에 나타나 있다. 막대의 높이는 각 8분 조명 윈도우 동안 조사된 녹색광의 분율을 나타낸다. 컨트롤러가 10분마다 한 번씩 입력을 업데이트했기 때문에 듀티 사이클 명령은 불연속적인 단계로 변경되었다. sfGFP 발현이 설정값(set point)에 도달함에 따라 녹색광 노출은 감소하고 적색광 노출은 증가했다. 측정된 신호가 설정값에 도달한 후에도 낮은 수준의 녹색광 입력이 여전히 관찰되었다. 이러한 잔류 제어 입력은 설정값 근처에서 발현 속도의 급격한 변화에 반응하는 미분 항(derivative term)을 반영하는 것으로 보인다. 이러한 결과는 LEMOS 2.0이 배치 배양에서 광유전학적 유전자 발현의 모델 기반 PID 피드백 제어를 구현할 수 있음을 보여준다.

figure-results-2
그림 1실험 중 LEMOS 2.0 소프트웨어 설정VS Code에서 실행 중인 Python 제어 스크립트(왼쪽)와 Arduino 마이크로컨트롤러로 전송됨에 따라 터미널에 표시되는 LED 명령어를 보여주는 샘플 스크린샷. 파일 탐색기 패널에는 메인 스크립트와 관련 함수 모듈이 포함된 프로젝트 디렉토리가 표시되어 있다. 오른쪽의 플레이트 리더 소프트웨어는 진행 중인 키네틱 측정 사이클을 보여준다. 각 사이클이 끝나면 Python 스크립트가 Gen5 인터페이스를 통해 다음 실행을 자동으로 트리거하고 이에 따라 LED 듀티 사이클 명령어를 업데이트한다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 2LEMOS 장치 제작 및 세포 성장 특성 분석. (A) PDMS 마이크로웰, 자극 LED, 배터리, 스위치, 마이크로컨트롤러, 충전 모듈, 장치 프레임 및 외부 외장 케이스를 보여주는 LEMOS 장치의 분해 조립도. (B탈이온수로 채워진 PDMS 마이크로웰이 포함된 조립된 장치.C) LEMOS 장치 내에 성형된 PDMS 마이크로웰. Namboothiri 등(2026)에서 재인용.18, CC BY 4.0 라이선스에 따라 제공됨. (D마이크로웰 캐스팅용 3D 프린팅 몰드 (E) 의 성장 곡선 E. coli LEMOS의 30 °C (녹색광 또는 적색광을 지속적으로 조사한 웰과 암소 상태로 유지한 웰 각각에 대해 N = 3의 기술적 반복 실험 수행). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 3LEMOS 내 광유전학 시스템 특성 분석 및 개방 루프 제어 역학. (A) CcaSR 이성분 광유전학 시스템의 플라스미드 맵: 녹색광(52 nm)은 CcaS/CcaR을 활성화하여 sfGFP 발현을 상향 조절하고, 적색광(620 nm)은 발현을 하향 조절한다. (BCcaSR 광유전학 시스템을 이용한 광유전학 실험 수행 프로토콜.C) LEMOS 작동 도식. 12시간의 시간 경과 동안 장치는 마이크로플레이트 리더기 내에 유지된다. 리더기는 sfGFP 형광과 OD를 측정한다.600, 그런 다음 데이터를 컴퓨터로 스트리밍하며, 컴퓨터는 시간 측정 및 Arduino 스케치 실행을 처리합니다. Arduino 스케치는 온보드 마이크로컨트롤러를 제어하여 매 측정 시 LED 조명을 일시적으로 차단합니다. Namboothiri 등(2026)에서 수정됨.18, CC BY 4.0 라이선스 하에 제공됨. (D) 암조건 하의 비자극 세포에 미치는 녹색광 간섭의 영향. 플레이트 배치도에서 녹색 상자는 녹색광 마이크로웰(N = 9)을, 회색 상자는 주변 마이크로웰에 빛 간섭이 없는 암조건 마이크로웰(N = 6)을, 보라색 상자는 녹색광 마이크로웰과 수직으로 인접한 암조건 마이크로웰(N = 3)을, 노란색 상자는 녹색광 마이크로웰과 수평으로 인접한 암조건 마이크로웰(N = 3)을, 그리고 파란색 상자는 자가형광 측정을 위해 대조군 균주를 넣은 녹색광 마이크로웰(N = 2)을 나타낸다. (E) 구동 매개변수로서 다양한 녹색광 듀티 사이클(5-80%, N = 3)에 따른 LEMOS의 개루프 응답. 실선은 평균을, 음영 처리된 띠는 표준 편차를 나타냄. (F) 듀티 사이클(duty cycle) 변화에 따른 성장 지수기 동안의 평균 발현율. N은 기술적 반복 횟수를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 4LEMOS 2.0의 폐루프 피드백 제어. (A폐루프 작동 도식: 마이크로플레이트 리더가 FL/OD를 측정하는 센서 역할을 함600컴퓨터가 제어기 역할을 수행하며, LEMOS 2.0 장치가 LED를 작동시켜 유전자 발현을 조절합니다. 이 과정은 살아있는 박테리아 세포 내의 유전자 발현입니다. Namboothiri 등(2026)의 연구에서 수정됨.18, CC BY 4.0 라이선스에 따라 이용 가능합니다. (B) FL/OD의 비례 적분 미분(PID) 제어 추적600 설정값 (SP = 18.5 × 105 (a.u.). 정광(Constant-light) 대조군은 녹색과 적색으로 표시되었다(N = 3). 설정값 추적(set point tracking) 실험군은 주황색 선으로 표시되었다(N = 3). 실선은 FL/OD의 평균값을 나타낸다.600; 음영 처리된 띠는 표준편차를 나타냅니다. 점선은 설정값을 표시합니다. (C) 폐루프 설정점 추적(closed-loop setpoint tracking) 동안 PID 제어기에 의해 생성된 대표 듀티 사이클(duty-cycle) 명령. 막대의 높이는 각 조명 간격 동안 전달된 녹색광의 비율을 나타냄. N은 기술적 반복 횟수를 나타냄. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

플랫폼배양 형식판독피드백 제어 시연배양 형태LEMOS 2.0에서 해결한 제약 사항
LEMOS 2.0플레이트 리더 내 32개 PDMS 마이크로웰상용 플레이트 리더모델 기반 PID 설정값 추적진탕 배양본 연구본 연구
LEMOS 1.0플레이트 리더용 16개 PDMS 마이크로웰상용 플레이트 리더모델 기반 PI 및 PID 설정값 추적진탕 배치 배양낮은 처리량; 제한적인 암조건 호환성18
자동 터비도스탯 + 로봇 샘플링터비도스탯유세포 분석법 + OD 센서PI, PID, MPC 설정값 추적연속 배양로봇 샘플링 필요; 측정-구동 지연2, 3
마더 머신 현미경법단일 세포 미세유체 기술생세포 현미경 관찰단일 세포 피드백 / MPC지속적 관류특수 미세유체 기술 및 현미경 분석 필요4, 6, 7
Chi.Bio소형 터비도스탯(Miniaturized turbidostat)내장형 OD/FL 센서PI 설정값 추적연속 배양내장형 센서의 동적 범위가 형광 피드백 성능을 제한함5
광튜브 어레이배양 시험관외부 OD/유세포 분석법개방 루프 전용진탕 배양수동 샘플링; 제한적인 온라인 성장 판독10
LAVA / LITOS / RainbowCap / Diya다중 웰 조명 장치상용 플레이트 리더개방 루프 전용회분식 배양분리된 자극/판독; 제한적인 자동화12, 13, 14, 15
루스트로96-웰 플레이트 조명상용 플레이트 리더개루프 전용회분식 배양자극과 판독 사이의 로봇 전송이 필요함8
RT-OGENE멀티웰/미세유체 호환 스테이지카메라 기반 OD/FL폐루프 시도됨; 판독값으로 인해 제한됨정적 회분식 배양카메라 기반 판독 및 정적 배양은 제어 성능을 제한한다16
광학 플레이트 리더맞춤형 96-웰 판독기/자극기내장형 포토다이오드뱅뱅 설정점 추적(Bang-bang set-point tracking)진탕 배치 배양리포터/필터 의존성 및 낮은 형광 감도가 판독 유연성을 제한함11,17

표 1: LEMOS 2.0와 기존 광유전학 플랫폼의 비교2,3,4,5,6,7,8,10,1,12,13,14,15,16,17,18.

부록 그림 1: 조립 이미지. (A) 장치 내부의 구부러진 LED 스트립과 성형된 스트립. (B) 배터리 충전 모듈에 납땜된 승압 컨버터와 여기에 납땜된 Nano BLE Sense Rev 2. (C) ‘JST PH 2-Pin Cable – Female Connector 10mm’의 원본 및 수정 버전. (D) 원본 스위치, 수정된 스위치, 납땜된 빨간색 JST PH 케이블, 그리고 하단 행 양쪽의 핀 두 개 사이에 납땜된 짧은 점퍼. (E) 회로 조립체에 스위치를 통합하고 회로에 전원을 공급하는 모습. (F) 글루건으로 고정된 LED 및 LED 스트립의 측면도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: Arduino IDE 설정 스크린샷. (A) 필수 보드 중 하나를 검색하는 화면을 보여주는 보드 관리자 스크린샷. (B) 필수 라이브러리 중 두 개가 표시된 라이브러리 관리자(Library Manager) 스크린샷. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 자료 1. LEMOS 배선도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: Gen5에서 LEMOS 2.0을 위한 사용자 정의 플레이트 레이아웃 설정 프로토콜 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: 보충 파일 2에 설명된 소프트웨어 단계의 스크린샷. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 영상 1: 다음 단계들을 포함하는 조립 영상. LED 스트립을 프레임에 배치하는 과정, 글루건으로 LED 스트립을 고정하는 과정, LED 스트립 내부 및 스트립 간의 배선 정리, 그리고 전자 회로를 이용한 최종 조립 과정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 프로토콜은 표준 마이크로플레이트 리더 내부에서 광유전학적 자극 및 피드백 제어 실험을 수행하기 위한 32-웰 LED 내장 마이크로플레이트인 LEMOS 2.0의 제작 및 작동 방법을 설명합니다. 대표적인 실험을 통해 LEMOS 2.0이 미생물 성장을 지원하며(그림 2E), 조명 하에서 유의미한 광독성이 관찰되지 않음을 입증하였습니다. 또한, LEMOS 2.0은 인접한 암조건 마이크로웰로의 빛 누설을 줄여(그림 3D), 암조건 대조군 및 공간적 패턴 자극 실험의 신뢰성을 향상시킵니다. 나아가, LEMOS 2.0은 듀티 사이클 기반의 광유전학적 작동을 가능하게 하며(그림 3E), 배치 배양에서 유전자 발현의 폐루프 PID 제어를 구현합니다(그림 4B).

광유전학 실험에서는 작동(actuation)과 형광 판독에 동일한 광학 워크플로우가 사용되기 때문에 광퇴색(photobleaching)이 중요한 고려 사항입니다27. LEMOS 2.0은 방출 피크가 620–630 nm(적색), 515–525 nm(녹색), 465–475 nm(청색)인 3개의 다이오드가 포함된 상용 RGB LED를 사용합니다19. 따라서 광유전학적 조절을 위한 충분한 빛 입력을 유지하면서, 작동 파장과 형광 리포터의 들뜸 스펙트럼 사이의 스펙트럼 중첩을 최소화하도록 리포터 선택과 LED 작동 강도를 결정해야 합니다. 본 프로토콜에서는 CcaSR 시스템이 사용되었으며, 이 시스템의 녹색 및 적색광 반응은 보고된 광범위한 활성 및 비활성 밴드 내에 있으며2, 485 nm 들뜸 파장을 사용하여 sfGFP 형광을 측정했습니다. CcaSR 제어에 사용되는 녹색 및 적색 작동 파장이 sfGFP 들뜸 파장과 분리되어 있고, LED 출력을 PWM 강도 25단계 중 1로 최소화하면서도 강력한 광유전학적 조절을 유도했으므로, LED 작동으로 인한 광퇴색은 제한적일 것으로 예상됩니다. 장기간의 시계열 실험 동안 일부 광퇴색이 발생할 수 있으나, 본 실험 조건 하에서는 측정된 광유전학적 유도, 듀티 사이클 반응 또는 폐루프 추적 역학을 가릴 만큼 크지 않았습니다20.

신뢰할 수 있는 성능을 위해서는 몇 가지 단계가 매우 중요합니다. 제작 과정에서 자극의 균일성을 유지하고 광학적 크로스토크(crosstalk)를 줄이기 위해 각 LED를 해당 마이크로웰에 정렬시켜야 합니다. 회로 조립 시에는 마이크로컨트롤러와 LED 스트립을 연결하기 전에 승압 컨버터를 5 V로 설정해야 합니다. PDMS 캐스팅 또한 특별한 주의가 필요한데, 기포, 먼지, 이물질 또는 불완전한 경화가 마이크로웰 바닥을 통한 광 투과율을 변화시켜 일관되지 않은 OD60 또는 형광 베이스라인을 생성할 수 있기 때문입니다28. 따라서 생물학적 실험 전에 멸균 배지를 사용하여 베이스라인 측정을 수행해야 합니다. 플레이트의 나머지 부분과 비교하여 웰 간에 OD60 판독값의 큰 차이가 관찰되면, 해당 웰에 앞서 언급한 제작상의 문제가 있는지 확인해야 합니다. 심각도에 따라 해당 마이크로웰을 분석에서 제외하거나 마이크로웰 전체를 다시 캐스팅해야 합니다.

소프트웨어 설정은 실험 실패의 또 다른 흔한 원인입니다. 현재의 워크플로우는 플레이트 리더 방식, Gen5 데이터 내보내기, Python 제어 스크립트, 그리고 중앙 및 주변 Arduino 보드 간의 Bluetooth 통신이 조화롭게 작동하는 것에 의존합니다. 내보내기 경로와 파일 형식은 Python 스크립트가 예상하는 구조와 일치해야 하며, 자동화 과정에서 화면 기반 상호작용을 사용하므로 실행 중에는 Gen5 창이 계속 보여야 합니다. 실험을 시작하기 전에 LEMOS 장치를 중앙 Arduino에 연결하고, 모든 LED가 올바르게 점등되는지 확인하기 위해 테스트 루틴을 실행해야 합니다. 감지되지 않은 오류는 실험 중 제어되지 않는 조명 조건으로 이어지므로, 박테리아 배양물을 로딩하기 전에 반응하지 않는 LED를 식별하고 해결해야 합니다. 이 워크플로우를 다른 플레이트 리더 모델이나 소프트웨어 패키지에 적용하려는 사용자는 자동화 계층을 필요에 따라 수정하되, 동일한 타이밍, 측정, 내보내기 및 파싱 로직을 유지해야 합니다.

LEMOS는 측정 간격과 동기화된 자동 구동을 가능하게 함으로써 루프를 완성합니다18. 본 연구에서는 처리량을 높이기 위해 웰의 수를 두 배로 늘려 초기 LEMOS 장치를 업데이트했습니다. 또한, 수정된 마이크로웰 기하학적 구조를 통해 웰 간의 빛 누설을 최소화함으로써, 동일한 실험 내에서 조명 조건과 암조건 하에 광유전학 회로를 테스트할 수 있게 되었습니다. LEMOS 2.0은 현재 배치 배양 실험을 지원합니다. 배치 배양 중에는 성장 속도, 자원 가용성 및 유전자 발현 역학이 변화하므로, 다른 균주, 리포터, 광유전학 시스템 또는 성장 조건에 따라 LED 강도, 듀티 사이클 범위, 샘플링 간격 및 컨트롤러 파라미터와 같은 변수들을 재교정해야 할 수 있습니다20. 광유전학 연구 수행을 위해 이전에 개발된 플랫폼들과 LEMOS 2.0의 상세 비교 결과가 Table 1에 제시되어 있습니다. 향후 버전에서는 배지의 제어된 교체 및 희석을 위한 플레이트 내 채널이나 저장소를 통합하여, 보다 일관된 성장 조건을 유지하면서 더 오랜 기간 동안 실험을 수행할 수 있을 것입니다. 또한 추가적인 설계를 통해 대체 LED 파장을 지원하거나 화면 기반 소프트웨어 자동화에 대한 의존도를 낮출 수 있을 것입니다.

공개 사항

저자들은 공개해야 할 이해상충 관계가 없습니다.

감사의 글

저자 B.J., T.S.B., 및 H.R.N.은 텍사스 A&M 공학 실험소

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
22 AWG stranded hookup wire AmazonASIN: B089CQ2N69Inexpensive wire to connect the electrical circuit. Solid or stranded wire is acceptable.
8 Pin 3 Position 2P3T DP3T Slide Switch Side KnobAmazonASIN: B007Q9Y8YCSwitch and pins should be on adjacent sides, not opposite, as is more commmon.
Arduino Nano 33 BLE Rev 2ArduinoABX00071Microcontroller – Flat profile and BLE capability suits the peripheral device needs.
Arduino Nano 33 IoTArduinoABX00027Microcontroller – Used as the central device.
BioTek Synergy H1 microplate readerAgilent (BioTek)—Or compatible plate reader with kinetic mode
Breathe-Easy sealing filmUSA Scientific9123-6100Medical-grade sealing film; Gas-permeable microplate seal
Chloramphenicol (25 mg/mL stock in ethanol)Various—Working conc. 25 µg/mL
E. coli MG1655
Ease Release 200Mann Release TechnologiesRelease agent
Kapton TapeAmazonASIN: B07F8TZZ4N
LB agar plates and appropriate antibioticsIn-house—It is assumed that these are already present.
Li-ion 3.7 V battery, 3000 mAh (11.1 Wh), size 104060UfineUFX0391-03 Should come with JST PH 2-Pin Cable Male. Manufactured by Liter Energy, sold by various retailers.
Li-ion battery charge and discharge module with Type-C USB (5V 1A)AmazonASIN: B0CTMJMRKZSearch "Replaces TP4056" on Amazon. Scroll past the standard TP4056 modules. Stop at any listing showing the smaller, black modules that read "Replaces TP4056" in the title.
Li-ion JST PH 2-Pin Cable – Female Connector 100 mmVariousASIN: B07NWNPB77Must be compatible with the battery’s JST connector.
Mini Boost Module 3.7 V to 5 V/8 V/9 V/12 V Step Up Board with LED indicatorAmazon (Teyleten Robot)ASIN: B0B4TB9QNY[https://a.co/d/03ASKZPq](https://a.co/d/03ASKZPq)
Nunc OmniTray Single-Well PlateThermo Scientific242811Outer Shell
pNO286-3AddgenePlasmid #107746Encodes constitutive CcaS expression
pSR58.6AddgenePlasmid #63176Encodes constitutive CcaR expression and sfGFP under the PcpcG2 promoter
Soldering iron and solderVarious—Recommendations: Fine tip, flux or rosin core solder.
Spectinomycin (50 mg/mL stock)Various—Working conc. 50 µg/mL
Sterile culture tubes (14 mL round-bottom)Various—
SYLGARD 184 silicone elastomer (base + curing agent)SYLGARD 1841:10 curing\:base by mass
USB-A to Micro USB cableVarious—For connecting Arduino Boards to the PC. Must be a data-transfer wire, not simply a charging wire.
USB-A to USB-C Charging CableVarious—Connects to the battery charging module
Vacuum desiccator and pumpVarious—For degassing PDMS
WS2812B IC SPI RGB Pixel LED Strip, 100LED/m, DC5V, IP30, BlackAmazon (BTF-LIGHTING)ASIN: B088B8G8LD ; BTF-LIGHTING Part No.: WS2812B1M100LB30Individually Accessible LED Strip. 100 LED/m. Voltage: 5 V. IP30 refers to water resistance. Black is preferred over white to reflect less light.

참고문헌

  1. Kumar S, Khammash M. Platforms for optogenetic stimulation and feedback control. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:918917.
  2. Milias-Argeitis A, et al. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nat Commun. 2016;7:12546.
  3. Gutierrez Mena J, Kumar S, Khammash M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nat Commun. 2022;13(1):4808.
  4. Lugagne JB, Blassick CM, Dunlop MJ. Deep model predictive control of gene expression in thousands of single cells. Nat Commun. 2024;15(1):2148.
  5. Steel H, Habgood R, Kelly CL, Papachristodoulou A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000794.
  6. Lugagne JB, et al. Balancing a genetic toggle switch by real-time feedback control and periodic forcing. Nat Commun. 2017;8(1):1671.
  7. Chait R, et al. Shaping bacterial population behavior through computer-interfaced control of individual cells. Nat Commun. 2017;8(1):1535.
  8. Harmer ZP, McClean MN. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit (vol 12, pg 1943, 2023). ACS Synth Biol. 2023;12(11):3505.
  9. Abkar L, et al. Enhanced reproducibility and precision of high-throughput quantification of bacterial growth data using a microplate reader. J Vis Exp. 2022;185:63849.
  10. Olson EJ, et al. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nat Methods. 2014;11(4):449-456.
  11. Bugaj LJ, Lim WA. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 2019;14(7):2205-2228.
  12. Repina NA, et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 2020;31(10):107737.
  13. Höhener TC, et al. LITOS: A versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Sci Rep. 2022;12(1):13139.
  14. Vogt A, et al. Simultaneous spectral illumination of microplates for high-throughput optogenetics and photobiology. Biol Chem. 2024;405(11-12):751-763.
  15. Kumar S, et al. Diya: A universal light illumination platform for multiwell plate cultures. iScience. 2023;26(10):107862.
  16. Soffer G, Perry JM, Shih SCC. Real-time optogenetics system for controlling gene expression using a model-based design. Anal Chem. 2021;93(6):3181-3188.
  17. Benman W, et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. Commun Biol. 2023;6(1):1192.
  18. Namboothiri HR, et al. Closed-loop optogenetic control in a microplate reader. ACS Synth Biol. 2026;15(6):2356-2365.
  19. Worldsemi. WS2812B intelligent control LED integrated light source. 2026: https://cdn-shop.adafruit.com/datasheets/WS2812B.pdf
  20. Lambert TJ. FPbase: A community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 2019;16(4):277-278.
  21. Xia YN, et al. Replica molding using polymeric materials: A practical step toward nanomanufacturing. Adv Mater. 1997;9(2):147-149.
  22. Ong NT, Tabor JJ. A miniaturized Escherichia coli green light sensor with high dynamic range. ChemBioChem. 2018;19(12):1255-1258.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol. 1991;204:63-113.
  24. ANSI SLAS 1-2004 (R2012). Footprint dimensions. At https://www.slas.org/SLAS/assets/File/public/standards/ANSI_SLAS_1-2004_FootprintDimensions.pdf.
  25. Åström KJ, Murray RM. Feedback systems: An introduction for scientists and engineers. Princeton University Press; Princeton, NJ; 2008.
  26. Namboothiri HR, Pandey A, Hu CY. Resolving emergent transient oscillations in gene circuits with a growth-coupled model. Sci Adv. 2026;12(6):eadz2310.
  27. Song LL, Hennink EJ, Young IT, Tanke HJ. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophys J. 1995;68(6):2588-2600.
  28. Campbell DJ, et al. Replication and compression of bulk and surface structures with polydimethylsiloxane elastomer. J Chem Educ. 1999;76(4):537-541.

재인쇄 및 허가

태그

광유전학적 제어LED 마이크로플레이트유전자 발현동적 빛 자극마이크로플레이트 리더PDMS 마이크로웰회로 조립Arduino 프로그래밍형광 측정박테리아 배양물

이 논문이 게재되었습니다

동영상 곧 제공

문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.