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방법 논문

신규 객체 인식 및 해마 바이오마커를 이용한 마우스의 수면 박탈 유도 인식 기억 결손 모델링을 위한 신속한 워크플로

132 조회수

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DOI:

10.3791/73557

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2026년 9월 8일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 2Department of Neurology, Hefei Eighth People's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine, Bengbu First People's Hospital, 4Department of Pathogen Biology, School of Basic Medicine, Tongji Medical College and State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Severe Zoonotic Infectious Diseases, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 논문은 부드러운 핸들링 방식의 수면 박탈, 신규 물체 인식 검사, 그리고 동일한 동물 내에서의 해마 바이오마커 분석을 10일간의 파이프라인으로 결합하여, 생쥐의 수면 박탈 유도 인식 기억 결손을 모델링하는 신속하고 재현 가능한 워크플로를 제시하며, 여기에는 구조화된 중재 기록 및 사전 정의된 품질 관리 기준이 포함됩니다.

초록

수면 부족은 인지 기능 저하의 원인이 되며 신경퇴행성 과정을 가속화할 수 있습니다. 본 논문은 생쥐 모델에서 수면 부족으로 유도된 인식 기억 결손을 모델링하는 신속하고 재현 가능한 워크플로우를 제시하며, 행동 결과와 해마의 분자적 변화를 연계합니다. 이 프로토콜은 표준화된 10분간의 신규 물체 인식(NOR) 친숙화 세션 직후에 실시되는 5시간의 부드러운 핸들링(gentle-handling) 수면 박탈 패러다임을 사용합니다. 인식 기억은 정확하게 정의된 5시간의 유지 간격 후 5분간의 NOR 테스트를 통해 평가되며, 이후 동일한 동물로부터 즉시 해마를 수집하여 interleukin-1 beta (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)를 포함한 염증성 사이토카인과 superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), malondialdehyde (MDA)를 포함한 산화 스트레스 마커를 정량화합니다. 주요한 방법론적 진보는 개별적인 행동학적 또는 생화학적 기술 그 자체(이미 잘 확립된 기술들임)가 아니라, 이를 하나의 연계된 워크플로우로 운영 표준화했다는 점에 있습니다. 본 프로토콜은 부드러운 핸들링 중재에 대한 구조화되고 정량화 가능한 로그를 요구하고, 훈련과 수면 박탈을 고정된 일주기 시간 지점에 고정하며, NOR 기록과 조직 샘플 간의 개체 수준 연계를 유지하고, 품질 관리 및 분석 기준을 사전에 지정합니다. 이 절차는 신체적 구속과 강제 운동을 최소화하도록 설계되었으며, 짧은 실험 창 내에서 완료될 수 있습니다. 또한 독립적인 재현을 전제로, 개별 연구실에서 자신들의 부드러운 핸들링 수면 박탈 구현 방식을 벤치마킹하는 데 사용할 수 있는 참조 워크플로우 후보로 제안됩니다.

서론

수면은 뇌 기능, 학습 및 기억 공고화에 필수적인 기본적인 생리학적 과정입니다1. 수면 부족은 인지 기능 장애, 기분 장애 및 신경퇴행성 질환의 진행과 관련이 있습니다2. 설치류를 이용한 실험적 수면 박탈(SD)은 급성 수면 손실의 신경생물학적 결과를 조사하기 위해 널리 사용됩니다. 선언적 및 공간 기억의 중심이 되는 뇌 영역인 해마는 수면 박탈에 특히 취약합니다3.

설치류에게 수면 부족을 유도하기 위해 여러 가지 절차가 사용됩니다. 수정된 다중 플랫폼법(modified multiple platform method)은 렘(REM) 수면을 효과적으로 감소시킬 수 있으나, 상당한 스트레스와 신체적 소진을 유발할 수 있습니다4. 이와 대조적으로, 부드러운 핸들링(gentle handling, GH)은 케이지 두드리기, 베딩 흐트러뜨리기, 또는 수면 징후가 나타날 때 새로운 둥지 재료를 제공하는 것과 같은 가벼운 감각 자극을 통해 각성 상태를 유지합니다. 학습 직후에 적용되는 짧은 GH 기간은 장기적인 수면 박탈 패러다임과 관련된 많은 혼란 변수들을 피하면서 해마 의존적 기억 공고화를 방해할 수 있습니다5. 본 프로토콜의 중재는 EEG로 확인된 REM 검출이 아니라 자세와 행동적 각성 신호에 의해 트리거되므로, 여기서 구현된 GH는 REM 특이적 기술이라기보다 확립된 전체 수면 박탈 방법으로 간주되며 수십 년 동안 이 형태로 사용되어 왔습니다6.

신물체 인식(novel object recognition, NOR) 검사는 인식 기억을 측정하기 위해 널리 사용되는 분석법입니다. 이 검사는 보상, 처벌 또는 광범위한 훈련 없이도 익숙한 물체보다 새로운 물체를 더 많이 탐색하려는 설치류의 자연스러운 경향에 기반합니다7,8. 급성 수면 박탈(SD)은 신물체 식별 능력을 저하시키는 것으로 나타났으며, 이를 통해 기억 공고화의 장애를 효율적인 행동 지표로 확인할 수 있습니다9. 분자 수준에서 수면 부족은 염증성 사이토카인 및 지질 과산화 생성물의 수준 증가와 항산화 능력의 감소를 포함하여, 해마의 신경 염증과 산화 스트레스를 유발할 수 있습니다10,11.

이 모델을 적용하는 데 있어 어려움은 개별 요소의 가용성이 아니라 연구 간의 운영 일관성 부족에 있습니다. 중재 강도에 대한 구조화된 기록 없이 완만한 취급(gentle handling)이 보고되는 경우가 많고, 행동 및 분자적 엔드포인트가 서로 다른 코호트에서 수집되는 빈도가 높으며, 탐색 행동에 대한 품질 관리 기준과 표본 크기 계획이 항상 명시적인 것은 아닙니다. 본 논문의 전반적인 목적은 수면 박탈로 유도된 인식 기억 결손을 모델링하기 위한 표준화된 워크플로우를 제공하는 동시에, 동일한 동물에서 행동 결과와 해마의 분자적 측정치를 연결하는 것입니다. 이 방법은 훈련 후 5시간의 GH 윈도우, 중재 강도 로그, 동일 코호트의 행동 및 조직 수집, 그리고 사전 정의된 분석 기준을 단일 10일 파이프라인으로 결합함으로써 이러한 재현성 격차를 해결합니다(그림 1). GH 구현의 표준화 부족은 이전의 수면 연구 방법론 문헌에서도 언급된 바 있습니다6.

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그림 1. 실험 워크플로우의 도식적 표현. 프로토콜은 핸들링 및 순화를 포함하여 10일 동안 진행되며, 이후 10분간의 NOR 익숙해지기 단계, 5시간의 GH 수면 박탈, 5분간의 NOR 테스트, 그리고 바이오마커 분석을 위해 동일한 동물로부터 즉시 해마 조직을 수집하는 핵심 테스트일로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

모든 동물 실험 절차는 남경 드럼 타워 병원(책임 연구자: Yuan Liu)의 신청에 따라 AILIMO(Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.)의 실험동물 복지 및 윤리 위원회의 검토 및 승인을 받았으며, 해당 기관 및 국가 규정에 따라 2026년 5월 7일에 승인되었습니다(승인 번호 AP CODE: ALM202605070, 유효 기간 4년). 아래에 설명된 프로토콜에는 성체 수컷 C57BL/6J 마우스(8~12주령)를 사용하십시오.

1. 준비 및 동물 순화

  1. 일반적인 실험실 조건(온도 22°C ± 1°C, 습도 50%–60%, 12시간 명기/12시간 암기 주기, 07:00 점등을 ZT0로 정의)에서 하우스 마우스를 사육한다. 표준 설치류 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 제공한다.
  2. 테스트 전 최소 7일 연속으로 매일 3–5분 동안 각 마우스를 핸들링한다.
    참고: 이 과정은 탐색 행동에 영향을 줄 수 있는 핸들링 유발 스트레스를 최소화하기 위함이다.
  3. 반사되지 않는 벽면을 가진 40 cm × 40 cm × 40 cm 크기의 정사각형 불투명 NOR 아레나를 준비한다. 동물의 털 색상과 대비되는 색상의 아레나를 사용한다.
  4. 위치가 밀리지 않을 만큼 충분히 무겁고 비다공성 재질로 된 NOR 물체를 선택한다. 전체적인 크기는 비슷하되 모양과 질감이 서로 구별 가능한 물체를 사용한다.
    참고: 그림 2에 훈련 및 테스트 구성이 나와 있다.
  5. 8일 차와 9일 차에, 순화 1시간 전에 마우스를 테스트실로 이동시킨다. 각 마우스를 빈 아레나에 10분 동안 둔 후, 다시 홈 케이지로 돌려보낸다.
  6. 동물 간 테스트 사이에 아레나와 물체를 70% 에탄올로 닦아낸다. 다음 동물을 넣기 전, 일반적인 실험실 환기 상태에서 에탄올이 약 3–5분 동안 자연 건조되도록 한다.
    주의: 에탄올은 인화성이 매우 높다. 적절한 환기를 유지하고 점화원으로부터 멀리 떨어진 곳에 보관한다.

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그림 2새로운 물체 인식 장치 및 실험 설계의 도식. 친숙화 과정 동안, 동일한 두 객체(A와 A)를 배치하십시오.′)를 경기장의 서로 반대편 구석에 배치한다. 5시간의 유지 간격 이후 테스트 단계에서, 익숙한 물체 하나를 새로운 물체(B)로 교체한다. 공간적 편향을 최소화하기 위해 새로운 물체의 위치를 좌우로 교차 배치하며, 각 그룹의 동물 중 약 절반씩이 각 위치에서 새로운 물체를 접하도록 한다. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. NOR 훈련 (친숙화)

  1. 10일 차 ZT1(명시된 광주기 일정에 따라 08:00)에 NOR 훈련을 시작합니다. 일주기 변동을 최소화하기 위해 모든 코호트에 대해 이 시작 시간을 유지하십시오.
  2. 훈련 세션 시작 1시간 전에 마우스를 테스트실로 이동시킵니다. 동일한 물체 두 개(A 및 A′)를 아레나의 반대쪽 모서리, 벽에서 약 10 cm 떨어진 곳에 배치합니다.
  3. 필요한 경우 물체를 바닥에 고정하십시오.
  4. 마우스를 물체 반대 방향을 향하게 하여 아레나 중앙에 놓습니다. 마우스가 10분 동안 자유롭게 탐색하도록 합니다.
  5. 오버헤드 비디오 추적 시스템을 사용하여 행동을 기록합니다. 능동적 탐색은 코를 물체 방향으로 ≤2 cm 거리까지 향하게 하거나, 물체 냄새를 맡거나, 코로 물체를 터치하는 것으로 정의합니다.
    참고: 능동적인 냄새 맡기 없이 물체 위에 앉아 있거나 기어오르는 것은 물체 탐색으로 간주하지 마십시오.
  6. Basler acA1300-60gm 오버헤드 카메라와 EthoVision XT 버전 17.5를 사용하여 NOR 행동을 기록하고 점수를 매깁니다. 단계 2.5에서 정의한 기준과 일치하도록, 능동적 탐색 점수를 매기기 위해 각 물체로부터 ≤2 cm의 코 지점 검출 구역으로 추적 소프트웨어를 설정하십시오.
  7. 10분의 친숙화 세션이 끝나면 즉시 마우스를 아레나에서 제거합니다.
  8. 다음 동물을 도입하기 전에 70% 에탄올로 아레나와 물체를 철저히 세척하십시오.

3. 부드러운 핸들링을 통한 수면 박탈

  1. 10일 차 훈련 세션 전, 각 동물에 고유 식별 코드를 부여하십시오. 행동 기록 및 조직 수집 전 과정 동안 해당 식별 코드를 유지하십시오.
  2. Excel의 RAND 함수로 생성한 컴퓨터 난수를 사용하여 동물을 SD 그룹과 NSD 그룹에 1:1 비율로 배정하십시오.
  3. NOR 훈련 직후, NSD 마우스를 홈 케이지로 되돌리고 5시간 동안 방해하지 않은 상태로 둡니다. SD 및 NSD 동물은 동일한 환경 조건 및 동일한 일주기 시간 범위 내에서 유지합니다.
  4. NOR 훈련 직후, SD 마우스에 대해 GH 수면 박탈을 시작한다. 홈 케이지 내에서 5시간 연속으로 각성 상태를 유지시킨다.
  5. 동물을 지속적으로 모니터링하십시오. 마우스가 몸을 웅크리거나, 눈을 감거나, 또는 지속적으로 움직임이 없는 상태 등 수면 관련 자세를 취할 때 개입하십시오.
  6. 케이지를 가볍게 두드리는 것부터 시작하여 점진적으로 자극을 가하십시오. 필요한 경우, 바닥재를 가볍게 흐트러뜨리거나 종이 튜브와 같은 깨끗하고 새로운 물체를 도입하거나, 부드러운 브러시로 동물을 가볍게 접촉시키십시오.
  7. 신체적 구속, 강제 이동, 혐오 자극 또는 통증 유발 자극을 피하십시오.
  8. 중재 로그를 작성하십시오. 표 1 5시간의 GH 기간 동안 각 케이지에 대해 기록하십시오. 시간당 대략적인 중재 횟수, 주된 중재 유형, 그리고 모든 프로토콜 이탈 사항이나 복지 우려 사항을 기록하십시오.
  9. 모든 코호트에 걸쳐 동일한 중재 기록 템플릿을 사용하십시오.
    주의: 물리적 구속, 강제 운동 또는 통증 자극을 사용하지 마십시오. 이러한 요인들은 기억, 스트레스 및 염증 결과에 독립적으로 영향을 미칠 수 있습니다.
케이지/코호트 IDH1H2H3H4H5주요 중재 유형편차 또는 복지 관찰
레코드 IDH1 수를 기록하십시오.H2 수를 기록하십시오.H3 수치를 기록하십시오H4 수를 기록하십시오.H5 수치를 기록하십시오태핑 / 베딩 / 새로운 물체 / 부드러운 브러시존재 여부를 기록하십시오

표 1: 부드러운 핸들링 중재 기록 템플릿. 케이지 또는 코호트 ID, 5시간의 수면 박탈 기간(H1-H5) 중 매 시간 수행된 부드러운 핸들링 중재 횟수, 주요 중재 유형 및 프로토콜 편차 또는 복지 관찰 사항을 기록하십시오.

4. NOR 테스트 단계

  1. NOR 훈련 완료 후 정확히 5 h 뒤에 NOR 테스트 단계를 시작하여 5 h의 고정된 유지 간격을 유지합니다.
  2. 아레나에 익숙한 물체(A) 하나와 새로운 물체(B) 하나를 배치합니다.
  3. 새로운 물체의 위치를 왼쪽과 오른쪽으로 번갈아 배치하여 동물 간의 균형을 맞춤으로써, 각 그룹 동물의 약 절반은 왼쪽에, 나머지 절반은 오른쪽에 새로운 물체가 놓이도록 합니다.
  4. 마우스를 아레나 중앙에 놓습니다. 마우스가 5 min 동안 자유롭게 탐색하도록 합니다.
  5. 익숙해지기 단계에서 사용한 것과 동일한 오버헤드 비디오 추적 시스템을 사용하여 세션을 기록합니다. 2.5단계에서 명시한 탐색 정의를 적용합니다.
  6. 동물 간 이동 시 70% 에탄올로 아레나와 물체를 세척합니다.

5. 동일 코호트 조직 수집 및 해마 박리

  1. NOR 테스트 직후, 조직 수집을 위해 행동 테스트를 거친 동일한 동물을 식별합니다.
  2. 마취제가 염증 및 인산화 의존적 바이오마커에 미칠 수 있는 잠재적인 교란 효과를 방지하기 위해, 승인된 동물 실험 프로토콜에 따라 마취 없이 안락사(참수)를 실시합니다. 안락사 직후 뇌 조직을 수집합니다.
  3. 각 분자 샘플이 해당 동물의 NOR 결과와 직접 연결되도록 모든 샘플 튜브와 기록에 동물의 고유 행동 기록 ID를 유지합니다.
  4. 뇌를 신속하게 적출하여 멸균된 얼음 냉각 해부 표면에 놓습니다.
  5. 정중시상절개(mid-sagittal cut)를 통해 양쪽 반구를 분리합니다. 냉각된 마이크로 스패튤라를 사용하여 각 반구에서 해마를 분리합니다.
  6. 분리한 해마를 액체 질소로 급속 냉동합니다. 분석 전까지 샘플을 −80°C에서 보관합니다.
    주의: 액체 질소는 심각한 동상을 유발할 수 있습니다. 적절한 저온 작업용 개인 보호구를 착용하십시오.

6. 해마 바이오마커의 정량 분석

  1. 얼음처럼 차가운 RIPA lysis buffer에 protease 및 phosphatase inhibitor cocktail을 1× 최종 농도가 되도록 첨가한다 (100× 스톡 용액 기준 lysis buffer 1 mL당 10 µL 첨가).
  2. 첨가제가 포함된 차가운 RIPA lysis buffer를 사용하여 조직 대비 버퍼 비율 1:10 (w/v)로 해마 조직을 균질화한다 (조직 1 mg당 lysis buffer 10 µL 사용). 일반적으로 반구당 해마 조직 질량이 약 25–30 mg인 경우, 반구당 약 250–300 µL의 lysis buffer를 사용하며, 양측 해마 조직 약 50–60 mg인 경우에는 약 500–600 µL를 사용한다.
  3. RIPA 균질액을 4°C에서 14,000 × g로 15분간 원심분리하고 상층액을 수집한다. 이 상층액을 총 단백질 정량 및 3종의 사이토카인 ELISA에 사용한다.
    참고: SOD, GPx 및 MDA 분석의 경우, 효소 활성 보존을 위해 제조사 권장 사항에 따라 키트 전용 균질화 버퍼를 사용한다.
  4. RIPA lysis buffer 대신 해당 키트 전용 균질화 버퍼를 사용하여 조직 대비 버퍼 비율 1:9로 SOD, GPx 및 MDA 측정을 위한 별도의 10% (w/v) 해마 균질액을 준비한다.
  5. BCA 단백질 분석법을 사용하여 총 단백질 농도를 결정한다.
  6. Table of Materials에 나열된 표적 특이적 ELISA 또는 생화학적 분석 키트를 사용하여 IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD, GPx 및 MDA를 정량한다. 각 분석 시 제조사의 지침을 따른다.
  7. 해당 분석 버퍼로 표준물질을 준비한다. 흡광도 값이 표준 곡선의 선형 구간 내에 들어오도록 샘플을 희석한다.
  8. 사이토카인 ELISA용 해마 샘플은 해당 분석 희석액으로 약 1:5 비율로 희석한다. 흡광도 값이 표준 곡선의 선형 구간 내에 위치하도록 필요에 따라 1:2–1:10 범위 내에서 희석 배율을 조정한다.
  9. 6.4단계에서 설명한 10% (w/v) 해마 균질액의 상층액을 SOD, GPx 및 MDA 분석에 직접 사용한다. 이 세 가지 분석에는 6.8단계에서 설명한 사이토카인 ELISA 희석법을 적용하지 않는다.
  10. IL-1β, IL-6 및 TNF-α ELISA의 경우, 표준물질 또는 적절히 희석된 해마 샘플 100 µL를 웰당 2회 반복(duplicate)으로 분주하고 37°C에서 90분간 배양한다. 비오틴화된 검출 항체(biotinylated detection antibody) 100 µL를 첨가하고 37°C에서 60분간 배양한다.
  11. 각 사이토카인 ELISA 웰에 HRP conjugate 100 µL를 첨가하고 37°C에서 30분간 배양한다. TMB 기질을 사용하여 37°C 암실에서 약 15분간 발색시킨다.
  12. SOD 분석의 경우, 해마 균질액 상층액 20 µL를 효소 작업 용액(enzyme working solution) 20 µL 및 기질 용액(substrate solution) 200 µL와 혼합한다. 37°C에서 20분간 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정한다.
  13. GPx 분석의 경우, 해마 균질액 상층액 200 µL와 GSH 함유 반응 혼합물을 결합하여 37°C에서 5분간 배양한다. 반응을 중단시키고 혼합물을 4°C에서 3500 × g로 10분간 원심분리한다. 상층액을 약 15분간 발색시키고, 반응 상층액 200 µL를 사용하여 412 nm에서 흡광도를 측정한다.
  14. MDA 분석의 경우, 해마 균질액 상층액 100 µL를 MDA 작업 시약 1.0 mL와 혼합하고 95°C 항온수조에서 40분간 배양한다. 혼합물을 냉각한 후 원심분리한다. 상층액 약 250 µL를 마이크로플레이트에 옮기고 532 nm에서 흡광도를 측정한다.
  15. 사이토카인 ELISA의 경우, 키트에서 지정한 파장(통상 450 nm)에서 흡광도를 측정하며, 가능한 경우 기준 파장 보정(reference-wavelength correction)을 사용한다.
  16. 4-파라미터 로지스틱 회귀 분석(four-parameter logistic regression)과 같은 적절한 모델을 사용하여 표준 곡선을 생성한다. 각 바이오마커 측정값을 총 단백질 함량으로 표준화한다.
  17. 선택한 키트와 호환되는 경우, 사이토카인 농도는 pg/mg protein, 항산화 효소 활성은 U/mg protein, MDA는 nmol/mg protein으로 표기한다.

7. 데이터 분석 및 품질 관리

  1. NOR 테스트 단계 동안 익숙한 물체에 소요된 탐색 시간(Tfamiliar)과 새로운 물체에 소요된 탐색 시간(Tnovel)을 추출합니다.
  2. 판별 지수(discrimination index, DI)를 다음과 같이 계산합니다:
    figure-protocol-2.
    참고: DI가 0.5보다 높으면 새로운 물체에 대한 선호도를 나타냅니다.
  3. 총 물체 탐색 시간(Tnovel + Tfamiliar)이 10 s 미만인 동물은 NOR 분석에서 제외합니다. 그룹 수준 분석 전에 이 기준을 적용하고 모든 제외 사례를 보고합니다.
  4. Shapiro–Wilk 검정을 사용하여 각 그룹의 정규성을 평가하고, Levene 검정을 사용하여 분산의 균질성을 평가합니다. 각 그룹에 대해 양측 단일 표본 t-검정을 사용하여 DI를 0.5 확률 수준과 비교하여 평가하며, 정규성 가정이 충족되지 않는 경우 대신 0.5에 대해 단일 표본 Wilcoxon 부호 순위 검정을 사용합니다.
  5. 별도로 지정하지 않는 한 모든 통계 검정의 alpha 값을 0.05로 설정합니다.
  6. 정규성과 분산 균질성 가정이 충족되는 경우, 양측 독립 표본 t-검정을 사용하여 독립적인 NSD 그룹과 SD 그룹 간의 DI를 비교합니다. 그렇지 않은 경우에는 Mann–Whitney U 검정을 사용합니다.
  7. 그룹과 물체 유형을 요인으로 하여 이원 반복 측정 분산 분석(two-way repeated-measures ANOVA)을 통해 익숙한 물체와 새로운 물체의 탐색 시간을 분석합니다. Sidak 보정 쌍별 사후 비교를 수행하고, 모든 그룹 비교 추정치와 함께 95% 신뢰 구간을 보고합니다.
  8. 정규성과 분산 균질성 가정이 충족되는 경우, 양측 독립 표본 t-검정을 사용하여 독립적인 NSD 그룹과 SD 그룹 간의 각 해마 바이오마커를 비교합니다. 그렇지 않은 경우에는 Mann–Whitney U 검정을 사용합니다.
  9. 동일한 코호트에서 여러 바이오마커를 평가할 때는 Benjamini–Hochberg 절차를 사용하여 바이오마커 패널 전체의 허위 발견율(false discovery rate, FDR)을 제어합니다. 공칭 p-값과 FDR 보정 p-값을 모두 보고합니다.
  10. NOR 판별 지수를 기본 결과값으로 하여, G*Power 버전 3.1을 사용하여 양측 독립 표본 비교에 대한 사전 검정력 분석(a priori power analysis)을 수행합니다. 예상 효과 크기는 학습 후 수면 박탈에 따른 새로운 물체 선호도의 뚜렷한 손상을 입증한 기존 발표 연구를 기반으로 합니다.
  11. 표준화된 효과 크기 Cohen’s d = 1.35, 양측 alpha 0.05, 검정력 80%, 1:1 할당 비율을 사용하여 사전 검정력 분석을 수행합니다. 이 매개변수들을 통해 계산된 그룹당 최소 표본 크기는 10마리입니다.
    참고: 효과 크기는 이전에 발표된 물체 인식 데이터9에서 추정되었습니다. Palchykova 등은 훈련 직후 수면 박탈을 시킨 생쥐와 시간 매칭 대조군(n = 그룹당 9마리)을 비교했을 때, 테스트 단계의 새로운 물체 탐색 지속 시간에 대해 유의미한 그룹 효과(F(1,16) = 8.26, p < 0.007)를 보고했으며, 이는 Cohen’s d ≈ 1.36에 해당합니다. 따라서 사전 검정력 분석을 위해 표준화된 효과 크기 d = 1.35를 채택했습니다.
  12. 사전에 지정된 행동적 또는 기술적 제외 사례를 고려하여, 계획된 표본 크기를 20% 늘려 그룹당 12마리(총 24마리)로 설정합니다. NOR 테스트 중 총 물체 탐색 시간 <10 s, 복지 관련 제외, 사용할 수 없는 비디오 녹화, 조직/시료 분석의 기술적 실패를 제외 기준으로 사전 지정합니다.
  13. 관찰된 처치 효과의 방향이나 크기를 근거로 동물을 제외하지 마십시오.
  14. 가설 검정 및 효과 크기 계산에는 Python 버전 3.12와 SciPy 버전 1.17을 사용하고, Benjamini–Hochberg 허위 발견율 보정에는 statsmodels 버전 0.14를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
  15. 본 프로토콜을 사용하여 공식 데이터 세트를 생성할 때는 단계 7.4~7.9에 지정된 모든 통계 검정에 대해 p-값과 함께 효과 크기(예: 그룹 비교를 위한 Cohen's d)를 보고합니다.

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결과

본 프로토콜을 성공적으로 수행하면, 단일 판독값을 개별적으로 해석할 필요 없이 일관된 행동-분자 결과 패턴을 얻을 수 있어야 합니다. 전체 실험 순서는 그림 1에 예시되어 있으며, NOR 장치 및 실험 설계는 그림 2에 나타나 있습니다. NSD 군의 마우스는 0.5의 우연 수준을 상회하는 DI를 통해 새로운 물체에 대한 뚜렷한 선호도를 보여야 합니다. 훈련 후 5시간 동안 GH 프로토콜에 노출된 마우스는 새로운 물체에 대한 선호도가 감소하고 NSD 대조군보다 낮은 DI를 보여야 합니다. 전체 물체 탐색 시간은 군 간에 유사하게 유지되어야 하며, 전반적인 탐색 감소가 나타난다면 이는 선택적인 인식 기억 결함보다는 운동 능력, 불안 또는 절차적 혼란 변수로 인해 발생했을 가능성이 큽니다. 본 코호트(NSD, n = 12; SD, n = 12 중 1마리는 단계 7.3의 사전 지정된 전체 탐색 임계값에 따라 제외되어 NOR 분석에...

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토론

본 논문은 급성 수면 부족으로 유도된 인식 기억 결손 및 해마의 분자적 변화를 연구하기 위한 신속하고 재현 가능한 프레임워크를 제공합니다. 표준화된 10분 학습 단계 직후에 5시간 동안 완만한 핸들링을 적용함으로써, 본 절차는 정의된 학습 후 공고화 창(consolidation window)을 대상으로 하며, 장기간의 수면 부족 모델이나 강제 이동 기반 절차와 관련된 신체적 부담을 줄이도록 설계되었습니다4,5. 다만, 아래의 방법론적 한계에서 논의된 바와 같이, 본 제출물에는 더 낮은 생리학적 스트레스 반응을 확인하기 위한 직접적인 스트레스 호르몬 측정 결과가 포함되지 않았습니다.

가장 중요한 기술적 요인은 습관화, 일관된 대상물 선택, 5 h 유지 간격의 고정된 타이밍, 그리고 GH 기간 동안의 지속적이지만 비혐오적인 모니터링입니다. NOR은 자발적인 탐색에 의존하기 때문에...

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공개 사항

저자들은 이해상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 Nanjing Drum Tower Hospital Youth Cultivation Fund, 중국 국가자연과학재단(Grant No. 82502706) 및 Jiangsu 기초연구 프로그램(Grant No. BK20250258)의 지원을 받아 수행되었습니다. 원고의 작성 및 수정 과정에서 텍스트의 초안 작성 및 다듬기, 도식 그림의 생성 및 개선을 포함하여 AI 보조 도구가 사용되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
70% ethanolAny supplierN/ACleaning of NOR arena and objects
Adult male C57BL/6J mice (8–12 weeks)Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.N/AExperimental animals
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific (Pierce)23225Total protein determination and normalization
Behavior-analysis softwareNoldus Information Technology B.V.EthoVision XT version 17.5NOR exploration scoring and analysis
Centrifuge capable of 14,000 × g at 4 °CEppendorfCentrifuge 5424 R; Cat. 5404000610Clarification of hippocampal homogenates
Clean paper tubesAny supplierN/AGentle-handling intervention
Cryogenic personal protective equipmentAny supplierN/ASafe handling of liquid nitrogen
Glutathione Peroxidase Assay KitAbcamab102530GPx quantification
Hippocampal tissue homogenizerIKA-Werke GmbH & Co. KGT 10 basic ULTRA-TURRAX; Cat. 0003737000Homogenization of hippocampal tissue in lysis buffer
Liquid nitrogenAny supplierN/ASnap-freezing of dissected hippocampi
MDA Assay KitSigma-AldrichMAK085MDA quantification
Microplate readerAgilent Technologies / BioTekBioTek Epoch 2 Microplate SpectrophotometerAbsorbance measurement at kit-specified wavelengths
Micro-spatulasAny supplierN/AHippocampal dissection; used chilled
Mouse IL-1β ELISA KitR&D SystemsMLB00CIL-1β quantification
Mouse IL-6 ELISA KitR&D SystemsM6000BIL-6 quantification
Mouse TNF-α ELISA KitR&D SystemsMTA00BTNF-α quantification
Object sets A/A′ and BAny supplierN/ANOR familiarization and test phases
Opaque NOR arena (40 cm × 40 cm × 40 cm)Any supplierN/ABehavioral testing
Overhead video-recording systemBasler AGacA1300-60gmVideo recording of NOR familiarization and test sessions
Protease/Phosphatase Inhibitor CocktailThermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)78440Added to lysis buffer at 1× working concentration (10 µL/mL from a 100× stock)
RIPA Lysis BufferThermo Fisher Scientific89900Hippocampal tissue homogenization
Sample tubes suitable for cryogenic storageThermo Fisher Scientific (Nunc)Nunc CryoTube, 1.8 mL; Cat. 375418Maintenance of animal-specific sample IDs and storage of dissected hippocampal tissue
Soft brushAny supplierN/AGentle-handling intervention
SOD Assay KitSigma-Aldrich19160SOD quantification
Statistical and power-analysis softwareG*Power; Python Software FoundationG*Power version 3.1; Python version 3.12 (SciPy 1.17; statsmodels 0.14)A priori power analysis and statistical analyses described in Protocol Section 7
Standard rodent chowJiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.Irradiated Rat/Mouse Maintenance Diet; XTI01WC-010Ad libitum animal feeding
−80 °C freezerHaier BiomedicalDW-86L626Long-term storage of snap-frozen hippocampal tissue

참고문헌

  1. Walker MP, Stickgold R. Sleep, memory, and plasticity. Annual Review of Psychology. 2006;57:139-166.
  2. Musiek ES, Holtzman DM. Mechanisms linking circadian clocks, sleep, and neurodegeneration. Science. 2016;354(6315):1004-1008.
  3. Havekes R, Abel T. The tired hippocampus: the molecular impact of sleep deprivation on learning and memory. Current Opinion in Neurobiology. 2017;44:33-39.
  4. Machado RB, Hipólide DC, Benedito-Silva AA, Tufik S. Sleep deprivation induced by the modified multiple platform technique: quantification of sleep loss and recovery. Brain Research. 2004;1004(1-2):45-51.
  5. Hagewoud R, et al. Sleep deprivation impairs spatial working memory and reduces clearance of hippocampal β-amyloid in rats. Neurobiology of Aging. 2013;34(1):22-30.
  6. Fenzl T, et al. Fully automated sleep deprivation in mice as a tool in sleep research. J Neurosci Methods. 2007;166(2):229-35.
  7. Ennaceur A, Delacour J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behavioural Brain Research. 1988;31(1):47-59.
  8. Leger M, et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 2013;8(12):2531-2537.
  9. Palchykova S, et al. Sleep deprivation impairs object recognition in mice. Neurobiology of Learning and Memory. 2006;85(3):263-271.
  10. Wadhwa M, et al. Sleep deprivation induces spatial memory impairment by altered hippocampus neuroinflammation and microglia activation in rats. Journal of Neuroimmunology. 2011;238(1-2):14-23.
  11. Silva RH, et al. Role of hippocampal oxidative stress in memory deficits induced by sleep deprivation in mice. Neuropharmacology. 2016;104:1-8.
  12. Wang Y, et al. Ellagic acid ameliorates sleep deprivation-induced cognitive impairment and neuroinflammation in mice. Aging. 2020;12(10):10327-10340.

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