방법 논문

유방암 뇌 전이의 단순화된 다세포 In Vitro 혈액-종양 장벽 모델 구축을 위한 세포 배양 인서트 기반 프로토콜

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DOI:

10.3791/73693

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2026년 10월 21일

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1Department of Breast Oncology and Surgery, The Second Hospital of Dalian Medical University, 2State Key Laboratory of Medical Proteomics, Dalian Institute of Chemical Physics, 3Department of Pathology, The Second Hospital of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 Transwell 공동 배양과 3D 종양 스페로이드를 결합하여 간소화된 다세포 in vitro 혈액-종양 장벽(BTB) 모델을 구축함으로써, 유방암의 뇌 전이를 연구하고 표적 치료제를 스크리닝하기 위한 생리학적으로 유의미한 플랫폼을 제공합니다.

초록

유방암 뇌전이(BCBM)의 효과적인 치료법은 여전히 제한적인데, 이는 주로 혈액-종양 장벽(BTB)이 중추신경계 내의 전이 병소로 들어가는 많은 화학요법 및 표적 치료제의 진입을 제한하기 때문입니다. 이러한 복잡한 미세환경의 선택적 특징을 인비트로(in vitro)에서 모델링하기 위해, 본 연구에서는 단순화된 다세포 3차원 BTB 모델을 구축하기 위한 표준 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 세 가지 핵심 단계로 구성됩니다. 첫째, 0.4 μm 공극 크기의 세포 배양 인서트를 사용하여 혈액-뇌 장벽(BBB) 구획을 구축합니다. 인간 뇌 미세혈관 내피세포(HBMECs)를 다공성 막의 기저면에 파종하고, 1일 후 인간 성상교세포(HA)와 인간 미세아교세포 HMC3 세포(HMC3)를 정단면에 파종합니다. SK-BR-3 세포를 예로 들어, 유방암 세포를 행잉 드롭(hanging drop)법으로 배양하여 3일 후 균일하고 규칙적인 모양의 3D 종양 스페로이드를 형성합니다. 이후 스페로이드를 기저막 매트릭스로 코팅된 다공성 막의 정단면으로 옮기며, 이는 공동 배양 동안 장벽 세포와 종양 스페로이드 간의 화학적 소통을 허용하면서 물리적 분리를 제공합니다. 이 플랫폼을 통해 실험 타임라인을 정밀하게 제어할 수 있으며, 내피 장벽의 무결성과 세포 간 투과성을 평가하는 동시에 종양 주변의 반응성 응답과 일치하는 성상교세포의 형태적 및 마커 변화를 유도할 수 있습니다.

서론

뇌전이는 유방암 및 폐암을 포함한 다양한 악성 고형암의 후기 단계에서 흔히 발생하는 합병증입니다1,2. 그 예후는 매우 좋지 않으며 치료 옵션 또한 제한적입니다1,2. 건강한 중추신경계에서 혈뇌장벽(blood–brain barrier, BBB)은 주로 밀착 연결된 뇌 미세혈관 내피세포에 의해 형성된 고도로 전문화되고 역동적인 인터페이스이며, 그 무결성과 기능은 혈관 기저막과 혈관주위세포, 성상교세포, 뉴런, 미세아교세포, 희소돌기아교세포 계열 세포 및 신경혈관 단위의 기타 구성 요소와의 협력적 상호작용을 통해 유지됩니다3. 내피세포 사이의 밀착연접과 주변 글리아 세포의 도움을 통해, BBB는 외부 물질의 중추신경계 진입을 엄격하게 제한합니다4. 유방암 세포가 뇌로 전이되어 정착하면 뇌 전이 병변이 확장되고, 국소 저산소증이 증가하며, 염증 신호가 강화되고, 신경혈관 단위(NVU)가 재구성되면서 점차 혈종양장벽(blood–tumor barrier, BTB)이 형성됩니다5. BTB의 국소 투과성은 BBB보다 높지만, 분자 크기에 따른 투과성 차이와 불균일한 혈류 관류로 인해 뇌종양 내 약물 축적이 저조하게 나타납니다6. 따라서 BTB의 생물학적 특성을 이해하고 이 장벽을 통과할 수 있는 전달 전략을 개발하는 것이 신경종양학의 중요한 우선순위가 되었습니다.

현재까지 혈뇌장벽(BTB)의 특성과 변형 기전은 부분적으로만 설명되었으며, 유방암 뇌전이(BCBM)에 대한 효과적인 약물 옵션은 임상 현장에서 여전히 제한적입니다. 한 가지 과제는 뇌전이 유래 임상 샘플의 확보가 어렵다는 점과, 기존 BTB 모델의 가용성이 낮고 기능적 특성 규명이 불충분하다는 점입니다. In vivo 동물 모델, 특히 마우스 모델7,8은 BTB 연구에서 여전히 널리 사용되고 있습니다. 하지만 이러한 모델들은 종 간의 차이, 낮은 처리량, 표준화 및 재현성의 어려움 등의 한계가 있으며, 이는 기전 연구와 약물 개발을 저해할 수 있습니다9,10. 또한, 현재의 in vitro BTB 모델은 일반적으로 세포 배양 인서트 시스템이나 미세유체 칩 내에서 종양 세포와 장벽 관련 세포의 공배양 방식을 사용합니다.

기존의 모델들은 종양의 3차원 구조가 결여된 경우가 많아, 세포 밀도 구배, 저산소/괴사 영역, 제한된 분자 확산 및 불균일한 세포 분포를 포함하여 뇌 전이와 관련된 공간적 특징을 재현하는 데 한계가 있습니다11,12. 명확한 3차원 종양 성분을 도입하기 위해, 본 연구에서는 단순하고 재현 가능하며 스크리닝 응용에 적합한 스페로이드 모델을 채택하였습니다. 이를 바탕으로 단순화된 다세포 인간 in vitro BBB 구획을 개발하고 이를 종양 스페로이드와 통합하여, 뇌 전이 미세환경의 선택적 구조 및 세포 특징을 포착하는 단순화된 BTB 모델(그림 1A)을 구축하였습니다. 이 모델은 조작이 간편하고 정량적인 장벽 측정이 가능하며, 종양 관련 성상교세포 및 미세아교세포 집단의 공간적 변화를 시각화할 수 있습니다.

본 프로토콜은 세포 준비 및 파종부터 종양 스페로이드 생성, 기저막 매트릭스 오버레이, 매칭 대조군 준비, 스페로이드 전이에 이르는 핵심 단계를 상세히 설명하여, 이 단순화된 혈액-종양 장벽(BTB) 모델을 구축하기 위한 표준화된 워크플로우를 제공합니다.

프로토콜

본 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며, 대련 의과대학교 제2병원 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 JW2026-019-01). 모든 환자 관련 데이터는 분석 전 익명화 처리되었습니다. 본 프로토콜에 사용된 연구 도구들은 재료 표에 기재되어 있습니다.

1. 혈뇌장벽(BBB) 모델의 준비

  1. 일반 요구 사항
    1. 모든 작업은 멸균 층류 작업대(laminar-flow cabinet) 내에서 수행하고 무균법을 엄격히 준수한다.
    2. 공극 크기가 0.4 µm이고 유효 막 면적이 1.12 cm2인 PET 막이 장착된 12-웰 세포 배양 인서트를 사용한다.
  2. Collagen type I 코팅
    1. 각 배양 플라스크 또는 디쉬에 1–2 mL의 collagen type I 코팅 용액을 넣고 바닥 표면에 고르게 도포한다.
    2. 각 세포 배양 인서트의 apical 측과 basal 측에 코팅 용액을 각각 200 µL와 800 µL씩 넣는다. 막 아래에 기포가 생기지 않도록 주의하면서 플레이트를 가볍게 흔들어 막 전체에 용액이 접촉되도록 한다.
    3. 코팅된 용기와 인서트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 1시간 동안 배양한다. 코팅 용액을 제거하고 PBS로 2회 세척한다.
    4. 코팅된 플라스크, 디쉬 및 세포 배양 인서트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 유지하며 3일 이내에 사용한다. 사용 직전에 PBS로 1회 헹군다.
    5. 세포 배양 전 HBMEC 및 HA 배양 용기를 collagen type I으로 코팅한다. HMC3-RFP 세포는 collagen type I 코팅이 필요하지 않다.
  3. Collagen type I 코팅 용액의 조제
    1. 빙초산 60 µL를 초순수 50 mL에 녹이고 4 °C에서 냉각한다.
      주의: 빙초산은 부식성 물질이다. 장갑, 실험복, 보호안경 등 적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태로 화학 흄 후드 내에서 취급한다. 초산 폐기물은 기관의 화학 폐기물 처리 절차에 따라 폐기한다.
    2. 용액을 0.22 µm 시린지 필터로 여과하고, collagen type I (9.45 mg/mL) 500 µL를 첨가하여 충분히 혼합한 후, 사용 전까지 4 °C에서 보관한다.
  4. 세포 준비
    1. HBMEC, HA 및 HMC3-RFP 세포를 사용 전까지 80%–90%의 합류도(confluence)에 도달할 때까지 배양한다.
      주의: 인간 유래 세포주 및 인간 조직 관련 물질은 잠재적 생물학적 위험 물질로 취급해야 한다. 기관의 생물 안전 절차를 준수하고 적절한 개인 보호 장구를 착용한다. 오염된 배양 물질은 생물학적 위험 폐기물로 폐기한다.
  5. 0일차 HBMEC 파종
    1. recombinant trypsin-like protease (1×)를 사용하여 HBMEC를 떼어내고, 세포를 원심 분리한 후 펠렛을 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 얻는다.
    2. 세포 밀도를 측정하고, 각 세포 배양 인서트당 120 µL에 1.5 × 105 HBMEC가 포함되도록 현탁액을 조정한다.
    3. 플레이트를 뒤집어 다공성 막의 basal 측에 HBMEC 현탁액 120 µL를 분주한다. 파종 시 기포가 형성되지 않도록 주의한다 (그림 1B).
    4. 웰을 덮고 12-웰 플레이트를 뒤집힌 상태로 유지하며 6시간 동안 배양한다.
    5. 플레이트를 원래 방향(정립)으로 되돌리고, 상단 및 하단 챔버에 각각 200 µL와 800 µL의 ECM 완전 배양 배지를 추가한 후 배양을 계속한다.
  6. 1일차 HA 및 HMC3-RFP 세포 파종
    1. HA 세포는 recombinant trypsin-like protease (1×)로, HMC3-RFP 세포는 0.25% trypsin-EDTA로 떼어낸다. 두 세포 유형을 각각 원심 분리하고 재현탁한다.
    2. 세포 밀도를 측정하고, 각 세포 배양 인서트당 2.0 × 105 HA 세포와 4.0 × 103 HMC3-RFP 세포를 혼합한다.
    3. 혼합된 세포를 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 펠렛을 200 µL의 혼합 완전 배지(AM 완전 배지: MEM 완전 배지 = 5:1)에 재현탁한다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 200 µL의 현탁액을 상단 챔버에 고르게 넣는다 (그림 1B). 
    4. 하단 챔버에 ECM 완전 배양 배지 800 µL를 추가하고, 플레이트를 인큐베이터 내에서 정립 상태로 유지하며 매일 배지를 교체한다.

2. 3차원 종양 스페로이드의 준비

  1. SK-BR-3 세포 준비
    1. 스페로이드 형성을 진행하기 전, SK-BR-3 세포가 80%–90% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 배양합니다.
    2. 0.25% trypsin-EDTA로 SK-BR-3 세포를 떼어내고, 세포를 원심분리한 후 펠렛을 재부유시켜 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
    3. 세포 밀도를 측정하고, 각 30 µL 액적(droplet)에 2 × 104 개의 세포가 포함되도록 현탁액을 조정합니다.
  2. 행잉 드롭(hanging drops) 형성
    1. 10 cm 세포 배양 접시를 뒤집어 접시 뚜껑 위에 세포 현탁액 30 µL의 액적을 분주합니다. 각 뚜껑에 약 20개의 액적을 배치합니다.
    2. 접시 바닥을 다시 덮고 조립된 접시를 빠르게 뒤집습니다(그림 1B). 액적이 뚜껑에서 떨어지거나 모양이 변형된 경우 액적을 다시 준비합니다.
  3. 스페로이드 배양
    1. 접시에 5 mL의 PBS를 넣고 인큐베이터에 넣습니다. 배양 초기 2일 동안은 접시를 건드리지 마십시오.
    2. 장기 배양의 경우, 2일마다 각 액적에 10 µL의 완전 배양액을 추가합니다.
    3. 피펫 팁을 사용하여 각 액적의 가장자리부터 배양액을 추가하고, 종양 스페로이드를 직접 접촉하지 않도록 주의합니다.

3. 단순화된 혈액-종양 장벽(BTB) 모델의 준비

  1. 재료 준비
    1. 필요한 세포 배양 용기와 세포 배양 인서트(PET 막, 공극 크기 0.4 µm)를 collagen type I로 코팅하고 사용 전까지 인큐베이터에 보관한다.
    2. 200 µL 피펫 팁의 끝부분을 가위로 자르고, 수정된 팁을 오토클레이브로 멸균한다.
  2. 모델 구축
    1. 0~1일차: 위에서 설명한 대로 BBB 모델을 구축하고 종양 스페로이드를 준비한다.
    2. 2일차: 기저막 매트릭스를 얼음 위에서 해동한다. 양쪽 챔버에서 배양액을 제거하고 PBS로 세척한다.
    3. 하단 챔버에 800 µL의 ECM 완전 배지를 넣고 상단 챔버에 해동된 기저막 매트릭스 30 µL를 넣는다. 기저막 매트릭스를 다공성 막 위에 고르게 펴 바른다.
    4. 플레이트를 37 °C에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 혼합 완전 배지(AM:MEM = 5:1) 200 µL를 상단 챔버의 측벽을 따라 천천히 첨가한다. 플레이트를 인큐베이터로 옮긴다(그림 1B).
    5. 기저막 매트릭스를 얼음 위에 유지하며 신속하게 작업한다. 기저막 매트릭스를 흡입할 때는 미리 냉각된 피펫 팁을 사용한다.
  3. 매칭된 스페로이드-프리/기저막 매트릭스 대조군
    1. BTB 조건과 동일한 기저막 매트릭스 부피(30 µL), 배지 조성, 세척 단계, 인큐베이션 시간 및 매일 배지 교체 일정을 사용하여 대조군 인서트를 준비하되, 3일차의 종양 스페로이드 이식 단계는 생략한다. 따라서 매칭된 대조군은 기저막 매트릭스 노출이나 취급 여부가 아니라, 종양 스페로이드의 존재 여부에 따라 BTB 조건과 차이가 나게 된다.
  4. 3일차 종양 스페로이드 이식
    1. 정립 현미경으로 종양 스페로이드를 관찰하여 모양이 일정하고 조밀한 스페로이드가 형성되었는지 확인한다.
    2. 끝을 자른 피펫 팁을 사용하여 종양 스페로이드를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 흡입하고 PBS로 2회 세척한다. 스페로이드가 파손되지 않도록 조심스럽게 다룬다.
    3. 하단 챔버의 배지를 교체하고 상단 챔버의 배양액을 제거한다.
    4. 끝을 자른 피펫 팁을 사용하여 각 상단 챔버에 5개의 종양 스페로이드를 옮긴다.
    5. 상단 챔버에 혼합 완전 배양 배지(AM:MEM = 5:1) 200 µL를 넣고, 스페로이드끼리 접촉하거나 합쳐지지 않도록 플레이트를 살살 흔들어준다(그림 1B).
    6. 플레이트를 인큐베이터에 보관하고 매일 배지를 교체한다.
  5. 시료 수집
    1. 7일차에 후속 실험을 위한 시료를 수집하거나, 실험 요구 사항에 따라 수집 시간을 조정한다.

4. 경내피 전기 저항(TEER) 측정

  1. 전극 준비
    1. TEER 측정기를 완전히 충전하고 젓가락 모양 전극을 75% 에탄올에 15분 동안 담가 소독하십시오.
      주의: 에탄올은 가연성 물질입니다. 75% 에탄올을 개방된 화염, 스파크 및 기타 점화원으로부터 멀리 두고, 기관의 화학 안전 절차에 따라 취급하십시오.
    2. 멸균을 위해 생물안전작업대를 30분 동안 자외선에 노출시키십시오. 전극이 자외선 조사에 직접 노출되지 않도록 하십시오.
    3. 전극을 에탄올에서 꺼내 PBS에서 15분 동안 평형을 맞춘 후, 멸균 조건에서 건조하십시오.
  2. 세포 배양 인서트의 평형화
    1. 세포 배양 인서트가 들어 있는 12-웰 플레이트를 배양기에서 꺼내어 측정 전 15분 동안 실온에 둡니다.
  3. 저항 측정
    1. 다음과 같이 세포가 없는 공백 세포 배양 인서트를 준비하십시오. 200 µL 및 800 µL 상부 및 하부 챔버에 각각 동일한 조성의 완전 배지를 넣습니다.
    2. 다공성 막이나 웰 바닥에 닿지 않도록 세포 배양 인서트의 가장자리를 따라 젓가락 전극을 조심스럽게 삽입하십시오.
    3. 전극을 PBS로 헹구고 건조하십시오. 동일한 절차를 사용하여 세포가 포함된 각 인서트를 측정하고 저항을 R로 기록하십시오.₍측정됨₎.
  4. TEER 계산
    1. 다음 공식을 사용하여 경내피 전기 저항(TEER) 값을 계산하십시오.13:
      경상피전기저항 (TEER)Ω·cm²) = (R(측정됨) − R(내용이 없습니다.) × S    (1.1)
    2. R(측정됨) 세포층을 포함하는 다공성 막의 저항은Ω); R((제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.)) 세포가 없는 다공성 막의 저항은 (Ω); 그리고 S는 유효 막 면적(cm²)입니다.2). 본 연구에서 사용된 유효 막 면적은 1.12 cm²입니다.2.

5. FITC-dextran 세포 간 투과성 분석 (정단측-기저측 방향)

  1. FITC-dextran 준비
    1. 실험 전 2 mg/mL FITC-dextran (4 kDa) 작업 용액을 준비하고 빛으로부터 보호한다.
  2. 어세이 방향 해석
    1. HBMECs는 멤브레인의 기저면(basal face)에 부착되어 있고, 별아교세포(astrocytes), 미세아교세포(microglia) 및 종양 스페로이드는 정단부(apical compartment)에 위치하므로, 본 어세이는 정단부에서 기저부로 향하는 세포 간 장벽 무결성(paracellular barrier-integrity) 판독으로 해석한다.
      참고: 전신 노출을 모방하려는 연구의 경우, FITC-dextran 또는 테스트 화합물을 하단/기저부의 내피세포 접촉 구획에 투입하고, 별도로 검증된 샘플링 체계 및 Papp 계산법을 사용하여 상단/정단부 구획에서 샘플을 수집한다.
  3. 세척 및 평형화
    1. 양쪽 챔버에서 모든 배양액을 제거한다. 예열된 무당(glucose-free) DMEM 기본 배지를 상단 및 하단 챔버에 각각 400 µL와 1 mL씩 가하고, 부드럽게 한 번 세척한 후 배지를 버린다.
    2. 신선한 예열 무당 DMEM 기본 배지를 상단 및 하단 챔버에 각각 400 µL와 1 mL씩 가한다. 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 15분 동안 평형화한 후 모든 액체를 흡입하여 제거한다.
  4. 투과성 측정
    1. 정단측에 2 mg/mL FITC-dextran 작업 용액 200 µL를 가하고, 하단 챔버에 무당 DMEM 기본 배지 800 µL를 가한다. 37 °C, 5% CO₂ 조건의 암소에서 30분 동안 배양한다.
    2. 30분 후 각 실험 인서트의 하단 챔버에서 배지 100 µL를 수집한다. 각 인서트에서 세 개의 분주액을 검은색 96-웰 플레이트로 옮기고 빛으로부터 보호한다.
  5. FITC-dextran 표준 곡선 준비
    1. 0, 0.5, 1.0, 1.5 mg/mL 농도의 FITC-dextran 표준 용액을 준비한다. 각 표준 용액 100 µL를 검은색 96-웰 플레이트에 3반복으로 가하고 플레이트를 빛으로부터 보호한다.
  6. 형광 측정 및 Papp 계산
    1. 다기능 마이크로플레이트 리더를 사용하여 들뜸 파장 492 nm, 방출 파장 520 nm에서 형광 강도를 측정한다. 데이터를 기록하고 다음 식14을 사용하여 겉보기 투과 계수(Papp)를 계산한다.
    2. 먼저, FITC-dextran 표준 용액의 농도(C)를 해당 형광 강도(A)에 대해 선형 회귀 분석하여 표준 곡선을 생성한다:
       A = kC + b    (1.2)
    3. 여기서 k는 표준 곡선의 기울기를, b는 y절편을 나타낸다.
    4. 그 다음, 시간 t에서 측정된 샘플의 형광 강도(At)를 표준 곡선 식에 대입하여 시간 t에서의 기저측 FITC-dextran 농도(Ca)를 구한다. 그런 다음 다음 공식에 Ca를 대입하여 Papp (cm/s)를 계산한다.
    5. Papp = (Ca × Va)/(t × S × C0)  (1.3)
    6. 여기서 Va는 총 기저측 부피(mL), t는 투과 시간(s), S는 다공성 멤브레인의 유효 면적(cm2), C₀는 정단측의 초기 농도이다.

6. 면역형광 염색

  1. 고정, 세척 및 투과화
    1. 세포 배양 인서트에서 모든 배양액을 제거하고, PBS로 2회 세척한 후 잔류 액체를 모두 흡입하여 제거하십시오.
    2. 추가하십시오 200 µL 및 800 µL 상부 및 하부 챔버에 각각 4% 파라포름알데히드를 첨가하고, 하룻밤 동안 세포를 고정합니다. 4 °C.
      주의: 파라포름알데히드는 유해하므로 장갑, 실험복 및 보호안경을 착용한 상태에서 인증된 화학 흄후드 내에서 취급해야 합니다. 파라포름알데히드 폐기물은 별도로 수거하여 기관의 유해 폐기물 처리 절차에 따라 폐기하십시오.
    3. 파라포름알데히드를 제거하고 추가하십시오. 200 µL 및 800 µL 상단 및 하단 챔버에 각각 PBS를 넣습니다. 쉐이커에서 5분씩 3회 세척합니다.
    4. 추가하십시오 200 µL 그리고 800 µL 0.5% 비이온성 계면활성제를 각각 상단 및 하단 챔버에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 투과화한다.
    5. 비이온성 계면활성제 용액을 제거하고 PBS로 5분씩 3회 세척하십시오.
  2. 막 절단 및 블로킹
    1. 세포 배양 인서트를 세포 배양 접시의 뚜껑 위에 뒤집어 놓은 다음, 메스로 가장자리를 따라 다공성 막을 조심스럽게 잘라내어 24-웰 플레이트로 옮깁니다.
    2. 추가하십시오 200 µL 각 막을 덮을 수 있도록 PBS에 3% BSA를 포함한 용액을 넣고 실온에서 90분 동안 블로킹합니다. 필요한 경우, 별도의 염색을 위해 막을 더 작은 조각으로 자릅니다.
  3. 1차 항체 배양
    1. 표준 항체 희석액으로 1차 항체를 희석하고, 각 멤브레인을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 양의 용액을 첨가하십시오.
    2. 증발을 줄이기 위해 주변의 빈 웰에 초순수를 채우고, 시료를 다음 온도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 4 °C특이적 1차 항체가 없는 시료를 음성 대조군으로 사용하십시오.
    3. 다음 날 1차 항체 용액을 제거하고, 셰이커에서 1mL의 PBS로 막을 10분씩 3회 세척하십시오.
  4. 2차 항체 및 DAPI 염색
    1. 차광 조건에서 형광 항체 희석액으로 2차 항체를 희석하여 멤브레인을 완전히 덮고, 실온에서 90분 동안 배양하십시오. 빛을 차단한 상태에서 PBS로 10분씩 3회 세척하십시오.
    2. 즉시 사용 가능한 DAPI 염색 용액을 막 전체에 덮이도록 첨가하고 상온에서 15분 동안 배양한다. 빛을 차단한 상태에서 PBS로 10분씩 3회 세척한다.
  5. 투명화, 마운팅 및 이미징
    1. 멤브레인을 충분히 덮을 수 있는 적절한 부피의 3D 세포 배양 투명화 시약을 첨가하고, 차광 상태의 실온에서 15분 동안 배양하십시오.
    2. 안과용 포셉을 사용하여 막을 유리 슬라이드 위로 옮긴 후, 항퇴색 마운팅 용액을 추가하고 빛이 차단된 조건에서 시료를 마운팅합니다. 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 시료를 관찰하고 이미지를 촬영합니다.

7. 통계 보고

  1. 기능적 비교를 위해 n = 3은 조건당 3개의 독립적인 생물학적 반복 실험을 나타내며, 각 생물학적 반복 실험을 실험 단위로 처리하였습니다. 모든 3개 생물학적 반복 실험의 개별 데이터 포인트입니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었습니다. 정확한 t값과 p값을 이용하여 양측 꼬리 비쌍 독립 표본 Student's t-검정으로 비교를 수행하였습니다.

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그림 1: BTB 모델의 모식도 및 구축 워크플로우. (A) HBMEC는 다공성 세포 배양 인서트 막의 기저측(basal side)에 파종하였고, HA 세포와 HMC3-RFP 세포는 정단측(apical side)에 배치하였다. 기저막 매트릭스 층을 사용하여 종양 스페로이드를 장벽 세포 구획과 분리하였다. 일치하는 스페로이드-free 대조군의 경우, 동일한 기저막 매트릭스 오버레이 및 처리 과정을 거쳤으나 종양 스페로이드는 제외하였다. (B) 상단의 원형 숫자는 해당 배양일을 나타낸다. BBB 구축과 종양 스페로이드 준비는 동시에 수행되었다. 세포 배양 인서트의 상단 표면에 기저막 매트릭스 층을 추가한 후, 컷-오프 피펫 팁을 사용하여 종양 스페로이드를 상단 챔버로 옮겼다. 그 후 BTB 모델은 샘플 수집 전까지 최대 1주일 동안 배양 상태로 유지되었다. 샘플은 통상적으로 7일 차에 수집하여 후속 실험에 사용할 수 있다. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

동일한 양의 기저막 기질을 층화한, 대조군용 스페로이드가 없는 BBB 매트릭스에서 HMC3-RFP 신호는 절상피 세포층 전반에 걸쳐 비교적 넓게 분포되었다(그림 2). BTB 조건에서, 최종 시점의 이미지에서는 종양 스페로이드가 덮고 있지 않은 영역에서 주로 HMC3-RFP 신호가 관찰되었으며, 스페로이드 하부와 인접한 부위에서는 신호가 감소하였다(그림 2). 이러한 데이터는 종양 스페로이드의 존재 위치와 HMC3-RFP 세포의 최종 분포 사이에 공간적 연관성이 있음을 보여준다. 스페로이드 도입 이전의 HMC3-RFP 세포 기저 분포 및 장기적 세포 추적이 평가되지 않았기 때문에, 현재의 데이터는 미세아교세포의 능동적 이동, 반발 또는 종양에 의한 배제를 입증하지는 못한다.

성상세포는 BTB 조건에서 마커 신호 및 형태학적 특성의 차이를 나타냈다(그림 2). 매트릭스 내 스퍼로이드가 없는 대조군과 비교했을 때, 대표적인 이미지에서 주위 스퍼로이드 영역과 원위 영역 모두에서 더 강한 GFAP 형광 신호가 관찰되었다. 스퍼로이드 경계에 위치한 아교세포는 커진 세포체, 더 두껍고 길어진 돌기들을 나타냈으며, 돌기들이 스퍼로이드 가장자리 방향으로 배열되어 있었다(그림 2). 이러한 최종 특성은 반응성 별아교세포 유사 표현형과 일치하지만, 특정한 반응성 아교세포증 프로그램이나 그 기저에 있는 기전을 단독으로 입증하지는 못한다. 인간 유방암 뇌 전이 조직 절편에서도 형태학적으로 유사한 종양주변 별아교세포 구조가 관찰되었으며, 이곳에서 면역형광 염색을 통해 종양주변 반응성 아교세포증과 일치하는 특징들이 확인되었다.그림 3A). AQP4 관련 아교세포 특성을 추가로 분석하기 위해, AQP4 면역형광 염색을 동일한 스피로이드가 없는 BBB 모델과 BTB 모델의 원위부 및 스피로이드 주변 영역에서 수행하였다(그림 3B). BBB 모델, BTB 모델의 원위 부위, 그리고 종양 스페로이드 인근의 주위 스페로이드 부위의 대표적인 이미지를 각각 첫 번째, 두 번째, 세 번째 행에 나타내었다(그림 3B). BTB 모델 내에서 종양 스페로이드 주변의 아교세포는 원위부 아교세포에 비해 형태학적 차이를 나타냈다. 종합하면, GFAP/AQP4 발현 및 형태학적 관찰 결과는 이 모델 내에서 종양 스페로이드와 관련된 아교세포의 재형성(re-remodeling)을 뒷받침한다. 환자 조직과의 유사성은 인간 종양 주변부 아교세포 증식을 모델이 완전히 재현한다는 증거라기보다는, 표현형의 유사성으로 해석되어야 한다.

내피 세포 접합 구조의 종양 스페로이드 관련 변화를 평가하기 위해, 기저막 기질을 동일한 양으로 적층한 스페로이드 비첨가군과 스페로이드 첨가군 조건에서, 단순화된 BBB 및 BTB 모델의 기저 HBMEC층에 대해 밀착접합 단백질인 ZO-1의 면역형광 염색을 수행하였다. 공초점 현미경 촬영은 종양 스페로이드에 대응하는 영역에 집중하여 수행되었다.그림 4A). 종양 스페로이드가 없는 대조군에서는 HBMEC 사이의 ZO-1 신호가 비교적 연속적이고 선형적으로 분포하며 명확히 정의된 세포 간 경계를 나타내었다. BTB 조건에서는 종양 스페로이드에 해당하는 영역에서 ZO-1 형광 신호가 더 희박하게 나타났으며, 국소적인 파열과 불연속성이 관찰되었다(그림 4A). 이러한 종점 이미지는 조절된 밀착 접합(tight-junction) 구조의 국소적 소실과 일치한다. 그러나 추가적인 혈관-고환장벽(BTB) 특이적 분자 마커나 기전적 교란 실험이 없으면, 현재의 데이터로는 비특이적인 종양 연관 내피세포 손상이나 장벽 파괴와 구별되는 특정 BTB 재형성 여부를 명확히 판단할 수 없다.

기능적 수준에서, TEER 측정 및 FITC-덱스트란 투과성 분석을 7일차에 매칭된 스피로이드가 없는/기저막 매트릭스 대조군과 스피로이드를 포함한 BTB 조건에서 동시에 수행하였다(그림 4B). 세 번의 독립적인 생물학적 반복 실험에서 얻어진 개별 값을 산점도 형태로 표시하였다. 그림 4B, 요약 데이터는 평균으로 제시함 ± SD. BTB 조건의 TEER 값(106.0 ± 9.5255 Ω·cm2, n = 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험)은 대조군(168.0)보다 낮았다 ± 5.1325 Ω·cm2, n = 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험). 일관되게, 장상피 장벽(BTB) 조건에서 측정한 아피칼-베이설 방향의 FITC-덱스트란 검정법에 의한 겉보기 투과계수(Papp)가 더 높았다(5.851 ± 1.2080 × 10⁻3 cm/s, n = 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험)보다 높았다. ± 1.0937 × 10⁻3 cm/s, n = 3회의 독립된 생물학적 반복 실험). 양측 검정 비연결된 스투던트’s t-검정 결과 통계적으로 유의미한 차이가 나타났다 [TEER: t(4) = 9.920, p = 0.0006; Papp: t(4) = 3.395, p = 0.0274] (그림 4B). 이 실험 조건에서 전기 저항의 일치된 감소와 FITC-덱스트란 투과성의 증가는 종양 스페로이드 존재 하에서 장벽 무결성의 감소를 보여준다. 이러한 측정값만으로는 BBB에서 BTB로의 특정한 재형성 기전을 입증할 수 없으며, 상피측에서 기저측으로의 FITC-덱스트란 검정은 생리학적인 혈액에서 종양으로의 약물 전달 실험으로 해석되어서는 안 된다.

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그림 2: BTB 모델에서의 면역형광 염색. 일치하는 스피로이드가 없는 BBB 대조군 및 BTB 모델의 기저막 기질을 동일하게 도포한 후, 각각의 첨단 세포층에서 Pan-CK 및 GFAP 염색을 시행한 대표적인 면역형광 이미지. HMC3-RFP 신호도 함께 표시되어 있다. 첫 번째 열은 개략도를 나타내며, 검은색 사각형은 공초점 현미경 촬영 영역을 나타낸다. 첫 번째 행은 스피로이드가 없는 일치하는 대조군(No Spheroid)을 보여주고, 두 번째 행은 BTB 모델에서 종양 스피로이드로부터 멀리 떨어진 부위(Distal Region)를, 세 번째 행은 BTB 모델에서 종양 스피로이드에 인접한 부위(Peri-spheroid Region)를 나타낸다. 화살표는 반응성 표현형과 일치하는 아교세포 형태학적 특징을 보이는 부위를 지시한다. 세포핵은 DAPI(파란색)로 대조 염색하였고, 종양 세포는 전세포각질단백질(pan-cytokeratin, Pan-CK; 녹색)로 표지하였으며, RFP를 발현하는 미아교세포는 빨간색으로, GFAP 염색은 청록색으로 나타낸다. 스케일 바 = 100 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3면역형광 염색은 BTB 모델에서 종양 주위 반응성 성상아교세포증과 일치하는 형태학적 특징을 나타낸다. (A) 유방암 뇌 전이 환자의 뇌 조직 절편을 H&E 염색. 종양 조직과 뇌 실질 또는 혈관 사이의 경계면에 위치한 아교세포 구조는 주종양 주위 반응성 성상아교세포증과 일치하는 형태학적 특징을 나타내었다. 검은색 화살표는 대표적인 부위를 지시한다. 면역형광 염색을 통해 반응성 표현형과 일치하는 아교세포의 형태학적 특징이 추가로 확인되었으며, 빨간색 화살표는 대표적인 부위를 강조하고 있다. 스케일 바: 50 µm은 H에 대해&첫 번째 줄의 E 염색 이미지, 10 µm은 H에 대해&두 번째 줄의 E 염색 이미지 및 50 µ세 번째 행의 면역형광 이미지를 위한 m (B) AQP4 면역형광 염색을 동일한 스피로이드가 없는 BBB 모델과 BTB 모델의 원위 및 주위-스피로이드 영역에서 수행하였다. 첫 번째 줄은 BBB 모델의 대표적인 이미지를 보여주고, 두 번째 줄은 BTB 모델의 원위 영역의 대표적인 이미지를 보여주며, 세 번째 줄은 종양 스피로이드 인접 부위의 주위-스피로이드 영역의 대표적인 이미지를 보여준다. 화살표는 주위-스피로이드 영역에서 아교세포의 형태학적 변화를 나타낸다. 핵은 DAPI로 염색하여 파란색으로 표시하였고, AQP4는 노란색으로 표시하였다. 눈금 막대 = 100 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: BTB 모델의 기능적 특성 분석. (A) 혈관 장벽(BBB) 및 종양혈관 장벽(BTB) 모델의 기저 내피 세포층에서 ZO-1의 면역형광 염색. 기저막 매트릭스를 동일한 양으로 덮은 상태에서 촬영하였다. 첫 번째 열은 공초점 현미경 촬영에 선택된 영역을 검은색 상자로 표시한 개략도이다. 첫 번째 행은 종양 스페로이드가 없는 BBB 모델의 기저 세포층을 대표하는 이미지이며, 두 번째 행은 종양 스페로이드가 있는 BTB 모델의 기저 세포층을 대표하는 이미지이다. 붉은색 화살표는 ZO-1 형광이 희박하고 국소적으로 불연속적인 영역을 강조한다. 핵은 DAPI로 염색되어 파란색으로 표시되며, ZO-1은 녹색으로 나타낸다. 스케일 바 = 50 µm. (B) spheroid가 없는 BBB 대조군(No Spheroid)과 BTB 조건(With Spheroid)에서, 동일한 양의 기저막 기질을 코팅한 후 측정한 TEER 값 및 FITC-덱스트란(4 kDa)의 겉보기 투과계수(Papp). 각 조건당 n = 3회의 독립된 생물학적 반복 실험 수행. 세 생물학적 반복 실험에 대한 개별 데이터 점을 나타내며, 요약 데이터는 평균으로 제시함 ± SD. FITC-덱스트란 Papp 값은 절정-기저 방향에서 측정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

기존의 2차원 종양 세포 배양으로는 구현할 수 없는 공간적 조직화와 확산 제한을 제공하는 3차원 종양 성분을 도입하기 위해 스페로이드 모델을 사용하였습니다. 또한, 이 모델의 단순성과 재현성은 스크리닝 중심의 워크플로우와도 호환됩니다. 단순화된 다세포 인간 in vitro BTB 모델을 구축하기 위해, 스페로이드를 뇌 미세혈관 내피세포, 성상교세포 및 미세아교세포를 포함하는 3-세포 인간 장벽 구획과 결합하였습니다. 이 시스템은 조작이 간편하고 다중 웰 배양 및 정량적 장벽 측정(그림 1)과 호환되며, 면역형광 염색을 통해 세포 형태와 공간적 분포를 시각화할 수 있습니다. 관찰된 GFAP/AQP4 관련 성상교세포의 변화와 유방암 뇌전이 조직 내 종양 주변 성상교세포와의 형태학적 유사성은 이 모델이 특정 종양-글리아-내피 상호작용을 연구하는 데 유효함을 뒷받침하지만5, 이러한 결과가 완전한 인간 BTB와 동일함을 입증하는 것은 아닙니다.

현수적법(hanging-drop method)을 사용하여 종양 구형체를 생성하였으며, 이를 인간 뇌 미세혈관 내피세포, 인간 성상교세포 및 인간 미세아교세포와 공동 배양하여 단순화된 다세포 인간 모델을 구축하였다. in vitro BTB 플랫폼. 테스트된 조건 하에서, 종양 구상체는 TEER 감소, 정단-기저측 FITC-덱스트란 투과성 증가, ZO-1 구조의 변화, 그리고 성상세포 마커 및 형태학적 변화와 연관되었다. TEER 및 투과성 측정은 다음의 장벽 무결성을 평가하기 위한 확립된 접근 방식이다. 체외(in vitro) 차단 시스템13,14이러한 결과는 정의된 시스템 내에서 종양 구상체와 연관된 장벽 손상 및 글리아 재구성(glial remodeling)이 일어남을 입증합니다. 그러나 이 BTB 플랫폼은 완전한 BBB-BTB 전환, 활성 미세아교세포 이동 또는 BTB 재구성의 구체적인 분자적 기전을 확립하지는 않습니다. 따라서 이 플랫폼은 가설 생성 및 종양-글리아-내피 세포 상호작용의 제어 연구를 위한 다루기 쉬운 실험 모델로 보는 것이 가장 적절하며, 전신 약물 전달을 모델링할 때는 방향성 있게 적절한 수송 분석이 필요합니다.

이 단순화된 모델에는 몇 가지 중요한 한계가 있습니다. 첫째, 완전한 신경혈관 단위나 뇌-종양 미세환경을 포함하고 있지 않습니다. 주세포, 뉴런, 생리학적으로 완전한 기저막/세포외 기질 및 순환 면역 세포가 부재합니다. 주세포는 신경혈관 및 장벽 기능의 중요한 조절자이지만15,16,17, 일차 배양 인간 주세포의 제한적인 가용성과 배치 간 가변성으로 인해 표준화된 인간 in vitro 모델에 이를 통합하는 것은 여전히 어렵습니다. 따라서 이 모델은 완전한 인간 BTB로 설명되기보다는 단순화된 실험 플랫폼으로 정의되어야 합니다. 둘째, 본 연구에서는 단일 유방암 세포주인 SK-BR-3를 사용했습니다. 따라서 관찰된 표현형을 BCBM 생물학 전체로 일반화할 수 없습니다. 일반 가능성과 환자 관련성을 확립하기 위해서는 추가적인 유방암 하위 유형, 뇌 친화적 모델 및 환자 유래 BCBM 구상체 또는 오가노이드를 통한 검증이 중요할 것입니다. 셋째, 현재의 HMC3-RFP 데이터는 최종 시점의 관찰 결과이며, 공간적 패턴이 능동적 이동, 차등적 생존 또는 기존 분포의 결과인지 여부를 규명하지 못합니다. 이러한 가능성을 구분하기 위해서는 종단적 살아있는 세포 이미징이 필요합니다. 넷째, ZO-1, TEER 및 FITC-dextran 데이터는 장벽 손상을 입증하지만, BTB 특이적 리모델링과 비특이적 내피 세포 손상을 구분하지 않습니다. 추가적인 분자적 특성 분석과 기전적 대조군이 필요합니다. 다섯째, 이 구성에서는 HBMEC가 막의 기저면에 파종되었으므로, 보고된 정단-기저 FITC-dextran 분석은 생리학적 혈액-종양 수송 분석이라기보다 장벽 무결성 판독 값입니다. 전신 투여 연구에서는 추적자나 약물을 하단/기저 내피 세포 면 구획에 도입하여 상단/정단 종양 구획으로의 수송을 검증해야 합니다. 마지막으로, 현재의 기능적 측정은 조건당 3개의 독립적인 생물학적 반복 실험을 기반으로 했습니다. 이러한 설계는 생물학적 반복과 기술적 반복을 구분하지만, 독립적인 생물학적 반복 횟수를 늘리면 재현성 평가를 더욱 강화할 수 있을 것입니다. 주세포와 환자 유래 물질을 포함한 이러한 개선 사항들을 통합함으로써 플랫폼의 생리학적 및 중개적 관련성을 점진적으로 높일 수 있을 것입니다.

공개 사항

저자들은 공개할 이해상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 랴오닝성 교육개혁 프로젝트(JG24DB110), 다롄시 생명건강 유도계획 프로젝트(2025ZDJH01PT101), 다롄의과대학 제2병원 1+X 프로그램(2024LCJSYL07), 중국과학원 다롄화학물리연구소와 다롄의과대학 공동기금(DMU-2)의 지원을 받아 수행되었습니다.&DICP UN202509)

재료

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0.25% Trypsin-EDTA (1×(HMC3-RFP 세포 분리)NCM BiotechC100C1세포 준비 과정 중 HMC3-RFP 세포를 분리하는 데 사용됨.
1.5 mL 원심분리 튜브Jet BiofilCFT001015종양 스페로이드를 수집, 세척 및 처리하는 데 사용됩니다.
12-웰 세포 배양 플레이트Jet BiofilTCP011012BBB/BTB 모델 구축 시 12-웰 세포 배양 인서트를 고정하는 데 사용됨.
3D 세포 배양 투명화 시약Thermo FisherV11326마운팅 및 공초점 이미징 전에 염색된 세포 배양 막을 세척하는 데 사용됩니다.
Alexa Fluor 488 표지 항-토끼 2차 항체ProteintechRGAR002토끼 일차 항체의 면역형광 검출에 사용되는 형광 이차 항체.
Alexa Fluor 647 표지 항-마우스 2차 항체ProteintechRGAM005마우스 1차 항체의 면역형광 검출에 사용되는 형광 2차 항체.
항체 희석액SolarbioA1800면역형광 염색을 위한 1차 항체 희석에 사용됩니다.
항퇴색 봉입제SolarbioS2100염색된 막을 고정하고 이미징 중 형광 퇴색을 줄이는 데 사용됩니다.
성상세포 성장 보충제 (AGS)ScienCell1852인간 성상세포 배양에 사용되는 보충제.
별아교세포 배지 (AM)ScienCell1801인간 성상교세포용 및 혼합 상단 챔버 배지의 구성 성분으로 사용되는 배양 배지.
세포 배양 접시ServicebioCCD-100일반적인 세포 배양 및 현수적(hanging-drop) 종양 스페로이드 제작에 사용됩니다.
제1형 콜라겐Corning354249세포 파종 전 배양 용기와 세포 배양 인서트를 코팅하는 데 사용됩니다.
커버슬립시토테스트(Citotest)10212450C마운팅 및 현미경 표본 제작에 사용됨.
DAPI 염색 용액ServicebioG1012-10ML면역형광 염색 과정 중 핵 대조염색에 사용됩니다.
DMEM 기본 배지 (1×)GibcoC11995500BTFITC-덱스트란 투과성 분석에서 기초 배지로 사용됨.
혈관내피세포 성장 보충제 (ECGS)ScienCell1052인간 뇌 미세혈관 내피세포 배양에 사용되는 보충제.
혈관내피세포 배양액 (ECM)ScienCell1001HBMEC 및 BBB/BTB 모델의 하단 챔버에 사용되는 배양 배지.
소태아혈청 (FBS)GibcoA5669701완전 세포 배양 배지에 사용되는 혈청 보충제.
FITC 표지 덱스트란 (분자량 4,000)BeyotimeST2930-50mg세포 간 투과성을 평가하고 Papp를 계산하는 데 사용되는 형광 추적자.
형광 항체 희석액SolarbioA1840면역형광 염색을 위한 형광 2차 항체의 희석에 사용됨.
빙초산시그마27225제1형 콜라겐 코팅 용액을 조제하는 데 사용됨.
히알루론산인간 성상교세포해당 없음종양 관련 형태학적 및 마커 반응 평가를 위한 성상세포 구성 성분
인간 뇌 미세혈관 내피세포인간 뇌 미세혈관 내피세포해당 없음BBB/BTB 내피 장벽 성분
HMC3-RFPRFP-표지된 인간 미세아교세포주 HMC3해당 사항 없음형광 추적을 위한 미세아교세포 성분
마트리젤Corning354230종양 구상체를 장벽 세포 구획으로부터 분리하기 위한 오버레이로 사용된 기저막 매트릭스.
MEM (NEAA 포함) 완전 배지 (10)Procell 시스템PM150410B혼합 상부 챔버 배양 배지의 구성 성분으로 사용되는 배지.
현미경 슬라이드시토테스트(Citotest)188105공초점 이미징을 위해 절제되어 염색된 막을 마운팅하는 데 사용됨.
마우스 항-인간 GFAP 항체EMD MilliporeMAB360-25μL면역형광법을 통해 성상교세포 내 GFAP를 검출하는 데 사용되는 1차 항체.
파라포름알데히드ServicebioG1101-500ML면역형광 염색 전 세포를 고정하는 데 사용됨.
PBS 인산완충생리식염수 분말ServicebioG0002-2L프로토콜 전반의 세척, 평형화 및 준비 단계에 사용됩니다.
페니실린-스트렙토마이신 용액 (P/S)ServicebioG4003-100ML완전 세포 배양 배지에 사용되는 항생제 보충제.
피펫Eppendorf3123000250세포 배양 및 분석 절차 전반의 액체 핸들링에 사용됩니다.
피펫 팁MWM 바이오800201일상적인 액체 핸들링에 사용하며, 종양 스페로이드 전이를 위해 끝단을 절단하여 변형한 팁을 사용합니다.
토끼 항-인간 PAN-CK 다클론 항체MedChemExpressHY-P81164면역형광법을 통해 종양 세포를 식별하는 데 사용되는 1차 항체.
토끼 항-인간 ZO-1 항체Proteintech21773-1-AP면역형광법을 통해 내피세포 밀착연접 조직화를 평가하는 데 사용된 1차 항체.
SK-BR-3인간 유방암 세포주해당 사항 없음BTB 구축을 위한 종양 스페로이드 성분
조직 배양 플레이트 인서트 (0.4 μm, PET 막), 12-웰 플레이트Jet BiofilTCS016012BBB/BTB 공동 배양 모델을 구축하는 데 사용된 다공성 세포 배양 인서트.
경상피 전기 저항(TEER) 측정기MillicellERS-2세포 배양 인서트의 전기 저항을 측정하여 장벽 무결성 판독값으로 사용한다.
TrypLE Express (1×) (HBMEC 및 HA 세포 분리)Gibco12605-010세포 준비 과정 중 HBMEC 및 HA 세포를 분리하는 데 사용됨.

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