이 프로토콜은 단리된 결정질 관류 마우스 심장에서의 ex vivo 심근경색 모델을 설명합니다. 이 접근 방식은 전신 변수를 배제함으로써, 연구자가 심근세포 생존에 영향을 줄 수 있는 외적 요인이 없는 상태에서 심장에 미치는 영향을 직접 평가하고 국소적인 약물 중재법을 테스트할 수 있도록 합니다.
방법 논문
결정질액 관류 마우스 심장의 Ex Vivo 심근경색 모델
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
실험적 심근경색(MI)은 일반적으로 동물에서 좌전하행동맥(LAD)의 일시적 폐쇄를 통해 모델링하거나, 세포 수준에서는 저산소-재산소화 프로토콜을 통해 모델링합니다. 허혈에 대한 대체 기관 수준 모델로서, Langendorff 관류 심장은 생리학적 섭동과 약물학적 개입이 심장 보호에 미치는 영향을 조사하는 데 있어 핵심적인 도구로 남아 있습니다. 본 연구에서는 분리된 마우스 심장에서 국소 심근 허혈/재관류 모델을 구축하는 데 필요한 기본 방법론과 필수 규칙을 제시합니다. 간단히 설명하면, 심정지 유도 후, 얼음처럼 차가운 PBS로 짧게 세척한 뒤 LAD를 결찰했습니다. 그 후 심장을 Langendorff 장치에 장착하고 110 cmH₂O의 일정 관류압 하에 37°C에서 영양분이 풍부한 산소화 버퍼로 관류했습니다. 심근 허혈 시간은 30, 45, 60, 90, 120분으로 유도한 후 90분간 재관류시켰습니다. 심근세포의 생존능과 경색 크기는 현미경적 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 염색법을 사용하여 평가했습니다. 우리는 이 ex vivo MI 모델이 허혈 시간이 길어짐에 따라 경색 영역 내에서 생존 심근세포가 점진적으로 소실되는 특성을 보이며, 재현 가능한 심근 손상을 안정적으로 유도함을 입증했습니다. 또한, TTC 기반의 경색 심근 경계를 명확하게 구분하기 위해서는 최소 30분의 재관류가 필요했습니다. 이 접근 방식은 전신적 변수를 배제함으로써, 연구자가 MI 진행을 방해할 수 있는 순환 체액 인자 및 면역 세포 침윤과 같은 외적 조절 영향이 없는 상태에서 심장에 미치는 영향을 직접 평가하고, 국소적인 약물학적 개입을 테스트할 수 있게 합니다. 따라서 ex vivo MI 모델은 심근세포에 직접 작용하는 심장 보호 기전을 조사하는 데 유용한 플랫폼이 됩니다.
서론
심근경색(MI)은 관상동맥 혈류가 중단되어 조직 괴사와 심각한 기능 장애가 발생할 때 일어납니다. 일반적으로 개체 전체를 대상으로 연구되지만, 이 용어는 특정 심장 구조에 국한된 국소적 MI나, 전신적 영향 없이 경색을 연구하기 위해 사용되는 ex vivo 격리 심장 실험 모델(예: Langendorff 관류)을 지칭할 수도 있습니다1. 따라서 Langendorff 관류 심장은 50년 이상 심근 허혈성 손상을 연구하기 위한 강력하고 잘 확립된 실험 모델로 활용되어 왔습니다2.
분리된 심장을 이용한 ex vivo MI 모델은 실험 환경의 정밀한 제어가 가능하고, 순환 체액 인자, 혈액 성분 및 신경호르몬 조절과 같은 전신적 영향과 무관하게 약물과 같은 중재 조치가 심근에 미치는 직접적인 효과를 평가할 수 있다는 여러 장점이 있습니다3. 이러한 혼란 변수를 최소화함으로써, ex vivo 모델은 in vivo 모델보다 더 예측 가능하고 재현 가능한 접근 방식을 제공하며, 따라서 MI에 관여하는 질환 과정과 분자 경로에 대한 엄격한 연구를 용이하게 합니다4.
격리된 심장에서 심근 허혈은 전역적으로 또는 국소적으로 유도될 수 있습니다5. 전역적 심근경색(MI) 모델에서는 전체 관상동맥 순환을 통한 관류액의 흐름이 완전히 차단되는 반면, 국소적 MI 모델에서는 좌전하행 관상동맥(LAD)만을 결찰하여 일시적으로 폐쇄함으로써 결찰 부위 원위부의 심근으로 국한된 허혈성 손상을 유도합니다. 전역적 MI 모델은 기술적으로 수행하기 간단하지만, 심장 보호 연구에 적용하는 데 몇 가지 제약이 있습니다6. 주요한 제약 중 하나는 허혈 시간이 심장 전체의 내구성 있는 내성에 의해 제한된다는 점이며, 이로 인해 in vivo 상황과 유사한 전층 경색의 가능성이 높아 장시간의 허혈을 유도하기 어렵습니다7. 또한, ex vivo 모델은 일반적으로 허혈 및 재관류 시간이 정밀하게 제어될 때 우수한 재현성을 제공하지만, 이러한 프로토콜은 실험실마다 상당히 다릅니다. 이러한 가변성은 격리된 마우스 심장에 대한 더 나은 표준화와 특성화의 필요성을 강조하며, 특히 많은 핵심적인 방법론적 세부 사항들이 문헌에 충분히 기술되지 않은 경우가 많기 때문입니다8.
반면, 국소적 MI 모델은 기술적으로 구축하기가 더 까다롭습니다. 본 논문에서는 특히 심장 보호를 목표로 하는 약리학적 중재법을 평가하기 위해, 분리된 마우스 심장에서 신뢰할 수 있는 ex vivo MI 유도를 최적화하기 위한 여러 가지 수정 사항과 실질적인 전략을 제시합니다9,10. 따라서 Langendorff 관류 마우스 심장을 이용한 이 수정된 ex vivo MI 프로토콜은 치료적 중재 이후의 심근 생존력을 직접적으로 평가할 수 있는 효과적인 플랫폼을 제공합니다.
프로토콜
여기서 설명하는 고립 관류 심장 모델은 급성 비생존 실험으로, 지역 당국(독일 노르트라인-베스트팔렌주 LANUV, O1019/25)의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 ARRIVE 가이드라인과 NIH 실험동물 보호 및 사용 지침에 따라 수행되었습니다. 실험에 필요한 장비와 화학 물질은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 고립된 마우스 심장을 위한 Langendorff 역관류 시스템 설정
참고: 산소화된 결정질 관류액(Krebs-Henseleit 완충액, KHB)을 분리된 생쥐 심장에 110 cmH2O의 일정 압력으로 전달하기 위해 비재순환식 중력 구동 시스템이 설계되었습니다(그림 1A).
- 시스템을 조립하기 전, Langendorff 유리 기구를 0.1 M/L HCl과 100% 에탄올로 세척한 후 증류수로 헹굽니다.
- 다음 최종 농도(mM)에 따라 변형된 KHB 2 L를 조제하는 데 필요한 모든 화학 물질의 무게를 잽니다: 116.02 NaCl, 4.63 KCl, 1.10 MgSO4·7H2O, 1.21 KH2PO4, 2.52 CaCl2·2H2O, 24.88 NaHCO3, 8.30 D-glucose, 2.0 sodium pyruvate.
- 침전물을 방지하기 위해 CaCl₂를 제외한 모든 화학 물질을 2 L 플라스크의 2중 증류수에 녹이며, pH를 7.4로 맞추기 위해 최소 10분 동안 Carbogen (95% O₂/5% CO₂)을 지속적으로 버블링합니다.
- 침전이 일어나지 않도록 CaCl₂를 용액에 순차적으로 첨가합니다.
- 용액에 Carbogen을 10분 더 버블링합니다.
- 관상동맥 미세혈관을 막을 수 있는 미세 입자를 제거하기 위해 KHB 용액을 0.2 µm 멤브레인 필터로 진공 여과합니다.
- 여과된 KHB 용액을 37 °C로 유지되는 예열된 항온수조에 놓인 2 L 유리 저장조로 옮깁니다.
- KHB 저장조를 유리 압력 컬럼에 연결하여, 저장조 내의 Carbogen 가스에 의해 생성된 압력으로 산소화된 KHB가 컬럼을 지속적으로 채우도록 합니다.
- 유출 튜브 시스템에 공기 방울이 없는지 확인합니다.
- 실험 시작 전 KHB 용액을 Carbogen으로 30분 더 평형화합니다.
2. 심장 적출 및 캐뉼라 삽입
참고: 본 실험에서는 체중 20–25 g의 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였습니다. 모든 실험 절차는 근거, 날짜 및 안락사 방법을 포함하여 지역 규정에 따라 적절하게 기록되어야 합니다.
- 마취 유도를 위해 마우스를 5% isoflurane (v/v)이 포함된 유도 챔버에 조심스럽게 넣습니다.
- 발가락을 강하게 꼬집었을 때 반응이 완전히 없는 것을 통해 마취 깊이를 확인한 후, 수술대로 옮깁니다. 호흡 부재와 하반신의 근긴장 소실로 확인되는 경추 탈구를 통해 마우스를 즉시 안락사시킵니다.
- 심장과 상행 대동맥이 완전히 노출되도록 흉곽을 흉골 방향으로 양측 절개합니다.
- 포셉으로 심장 외 조직을 잡고 심장을 적출합니다.
- 심장 정지를 유도하기 위해 50 mL의 ice-cold KHB 용액이 담긴 미리 냉각된 소형 비커에 심장을 최소 30 s 동안 담가 둡니다.
참고: 심장 활동은 온도에 매우 민감하므로, ice-cold KHB 용액에 침지하여 심장을 완전히 정지시킵니다. - 3방향 스톱콕(three-way stopcock)에 연결된 캐뉼라 시스템이 구축된 금속 접시 위, KHB로 적신 사전 냉각된 면 패드로 심장을 옮깁니다. (그림 1B).
참고: 관류 시스템 내에 공기 방울이 없어야 합니다. - 5-0 실크사를 사용하여 캐뉼라의 말단에 느슨한 half-square knot를 미리 만들어 둡니다.
- 흉선, 결합 조직 및 잔여 심장 외 조직(폐 및 식도 포함)을 조심스럽게 제거하여 대동맥 기저부를 노출시키고 다듬습니다.
참고: 성공적인 캐뉼라 삽입을 위해 상행 대동맥의 길이가 충분한지 확인하십시오. - 심장을 캐뉼라에 장착하고 미리 준비한 봉합사로 고정합니다.
- 5 mL의 ice-cold PBS로 심장을 헹구어 관상동맥 순환계의 잔류 혈액을 씻어냅니다.
3 Ex vivo 심근 허혈 및 재관류
참고: 전신 심근 허혈은 심장 관류를 단순히 중단시켜 유도하였으며, 국소 심근 허혈은 실체 현미경 하에서 LAD를 일시적으로 결찰하여 유도하였습니다.
- 하단 면솜 패드를 조절하여 심장을 부드럽게 회전시켜 LAD를 시야 중심에 위치시킵니다. PBS 관류 중에 LAD가 투명해지며 주변 심근과 명확하게 구별됩니다.
- 8-0 폴리프로필렌 봉합사가 달린 테이퍼 니들을 좌심방 하단 가장자리에서 1 mm 아래, LAD 밑으로 통과시킵니다.
참고: 결찰로 인한 혈관 손상을 방지하기 위해 LAD가 두 천자 지점의 중간에 위치하도록 하십시오. - LAD 위에 부드러운 플레젯(pledget) 조각을 놓습니다.
- 봉합사를 단단히 조여 결찰 부위 원위부의 관류를 중단시킵니다.
- 캐뉼라가 삽입된 심장을 Langendorff 장치로 옮기고 역행성 관류를 시작합니다.
- 실험 기간 동안 일정한 온도(37 °C)를 유지하기 위해 심장을 워터 재킷이 있는 장기 배양조(organ bath)에 담급니다.
- 최대 및 정상 상태의 관상동맥 혈류량을 모니터링합니다(표 1).
- 지정된 심근 허혈 시간(결과 섹션 참조)에 관류를 중단하고 관류 장치에서 캐뉼라가 삽입된 심장을 제거합니다.
- 심장 수축을 완전히 정지시키기 위해 즉시 심장을 얼음처럼 차가운 KHB(4 °C)에 담급니다.
- 심장을 미리 냉각된 금속 접시의 면솜 패드 위에 다시 놓고 LAD 결찰을 풉니다.
- 약물 중재 연구의 경우, 이 단계에서 30 G 인슐린 주사기를 사용하여 경색된 전벽에 Interleukin-6 (IL-6, 0.1 mg/mL) 5 µL를 주입합니다.
- 캐뉼라가 삽입된 심장을 관류 장치에 다시 장착하고 심장 관류(재관류)를 재개합니다.
4. 심근 손상 및 생존율 평가
참고: 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) 염색 시 생존 가능한 심근은 진한 빨간색으로 표시되는 반면, 경색/괴사된 조직은 Zamboni 용액으로 고정한 후 베이지색으로 나타납니다.
주의: TTC는 일반적으로 위험 물질로 간주되며, 가벼운 피부 자극 및 심각한 눈 자극을 유발할 수 있고 흡입 시 유해하므로 취급에 주의가 필요합니다. 폐기물 및 잔여물은 지역 당국의 규정에 따라 처리하십시오.
- 재관류 90분 후에 관류를 중단하고, 심장의 수축을 멈추기 위해 즉시 얼음처럼 차가운 KHB에 심장을 담그십시오.
- TTC 염색 용액(PBS에 용해된 1% TTC)이 미리 채워진 3 mL 주사기에 캐뉼라를 연결하십시오. ~을 통해 3방향 스톱콕.
- 심장에 TTC 용액 1mL를 주입하고, 이를 3회 반복하여 15분 동안 총 3mL의 부피를 주입하십시오.
- 표면이 건조해지는 것을 방지하기 위해 심장을 젖은 조직지로 덮어줍니다.
- 심장을 3 mL의 TTC 용액이 들어 있는 원심분리관에 넣고 4 °C 하룻밤 동안.
- Optimal Cutting Temperature (OCT) 화합물을 사용하여 조직 블록을 제작합니다.
참고: 조직 블록은 −에서 보관할 수 있습니다.80 °C 추가 분석 시까지 수개월 동안 보관한다. - OCT 화합물을 사용하여 조직 블록을 크라이오스탯 척(cryostat chuck)에 고정하십시오.
- 심장을 다음의 두께로 연속 동결 절편 제작하십시오. 50 µm 그리고 매 10분마다 수집한다th 섹션; 일반적으로 심장당 약 8개의 조직 절편을 얻습니다.
- 8개의 절편을 모두 하나의 현미경 슬라이드 위에 정렬하고, 헤어드라이어를 사용하여 2~3분 동안 건조시킵니다.
- 절편들을 Zamboni 용액(2% 파라포름알데히드와 0.4% 피크린산(w/v)을 포함하는 고정액)이 담긴 염색 챔버에 넣고 하룻밤 동안 다음 온도에서 침지하십시오. 4 °C.
주의: Zamboni 고정액은 알레르기성 피부 반응을 일으킬 수 있으며, 유전적 결함 및 발암 가능성이 있는 것으로 의심됩니다. 폐기물과 잔류물은 지역 당국의 규정에 따라 처리하십시오. - 슬라이스를 PBS로 3회 세척하고, 절편을 마운팅 매질로 덮습니다.
참고: TTC 염색된 심장 샘플은 실온에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. - CellSens 소프트웨어를 사용하여 1.25배 대물렌즈가 장착된 광학 현미경으로 심장 이미지를 획득합니다.
- 경색 크기를 정량화하기 위해, 이미지 파일을 ImageJ 플랫폼으로 불러옵니다.
- ImageJ 메뉴에서 다음을 선택하십시오. 이미지 -> 조정 -> 색상 임계값 Color Threshold 창을 열려면 (그림 2B).
- 심장 절편 내에서 작은 관심 영역(ROI)을 선택하고, 진한 붉은색의 생존 심근과 베이지색의 경색/괴사 조직을 색상 참조 기준으로 사용하십시오.
- 클릭하십시오 샘플 ~에 있는 색상 임계값 창을 조절하고 채도 범위를 미세하게 조정하여 선택된 영역이 대상 색상 영역과 정확히 일치하도록 합니다.
- 클릭하십시오 선택 선택한 색상에 해당하는 영역을 설정하기 위해.
- ImageJ 메뉴에서 다음을 선택하십시오. 분석하십시오 -> 측정선택된 영역의 면적이 픽셀 단위로 결과(Results) 창에 표시됩니다.
- 평면법에 의한 경색 크기(planimetric infarct size)를 계산하기 위해 측정 데이터를 Excel 스프레드시트로 내보내십시오.
- 경색 부위 내의 생존 심근을 정량화하려면, IL-6를 주입한 전심실벽의 경색 부위를 중심으로 관심 영역(ROI)을 설정하십시오.
- ~을 여십시오 ROI 관리자 ImageJ 메뉴에서 클릭하십시오. 추가하십시오 선택한 ROI를 ROI 목록에 저장하려면 (그림 2C).
- 위에서 설명한 “샘플(Sample)” 및 “선택(Selection)” 기능을 사용하여 생존 심근(진한 빨간색)의 영역을 설정하십시오.
- 선택한 생존 영역을 “ROI Manager” 목록에 추가한 다음, 선택하십시오. 및 관심 영역(ROI)과 생존 심근 사이의 중첩 영역을 얻기 위해.
- 생존 심근의 면적을 측정하고, 선택한 관심 영역(ROI) 내에서 심근세포 생존율을 계산하십시오.
참고: TTC 염색 및 경색 크기 정량화를 위한 방법론적 세부 사항은 이전에 보고되었습니다.11.
결과
ex vivo MI 플랫폼에서 두 가지 허혈 프로토콜을 분리된 마우스 심장에서 평가하였다. ex vivo MI 연구에서 널리 사용되어 온 전심성 허혈(Global ischemia)은 심장 전체에 걸쳐 불균일한 허혈성 손상을 야기했다. 신뢰도 높고 해상도가 뛰어난 현미경 기반 TTC 검출법12을 사용하여, 45분간의 전심성 무혈류 허혈 후에도 심방 심근과 심첨 부위는 허혈에 상대적으로 저항성이 있으며 생존 상태로 남아 있음을 입증하였다(그림 2A, 상단 패널). 반면, 국소적 MI는 LAD 결찰 부위 원위부의 심근에 국한된 허혈성 손상을 유도했다. 이 조건에서 심외막하 심근의 일부는 TTC 양성으로 남아 있어 생존 조직이 보존되었음을 나타냈다(그림 2A, 하단 패널). 이러한 결과는 두 허혈 프로토콜 간에 심근 생존 패턴이 뚜렷하게 다름을 보여준다.
심근경색을 신뢰성 있고 재현 가능하게 유도하는 데 필요한 허혈 및 재관류의 최소 지속 시간을 분리된 마우스 심장에서 추가로 조사하였습니다. 허혈 지속 시간을 30분에서 120분으로 연장함에 따라 심근 손상이 점진적으로 증가하였습니다 (그림 3A). 특히, 경색 크기는 허혈 시간이 30분(n = 3)에서 45분(n = 5) 사이일 때 두 배 이상 증가하였으며, 허혈 지속 시간이 60분(n = 5), 90분(n = 4), 120분(n = 3)으로 연장되면서 고원에 도달한 것으로 보였습니다 (그림 3B). 이러한 결과는 심근 생존력이 30분 이상의 허혈 지속 시간에 매우 민감하다는 것을 나타냅니다. in vivo MI (ivMI, n = 5) 모델과 비교했을 때, ex vivo MI (evMI, n = 8) 모델은 유사한 허혈 및 재관류 지속 시간 하에서 거의 동일한 경색 크기를 나타내었으며 (36.88% ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0.27), 이는 심근 손상이 결정질액 관류에 의해 실질적으로 영향을 받지 않았음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고, evMI 심장은 결정질액 관류와 관련된 심근 부종으로 인해 더 두꺼운 심실벽과 감소된 심실 내강을 보였습니다 (그림 3C).
심외적 영향이 없는 비교적 통제된 환경을 이용하여, 심근 내 IL-6 투여의 심장 보호 효과를 평가하였다. PBS를 처리한 대조군 심장에서는 45분간의 허혈 후에도 경색/괴사 부위(베이지색) 내에 산재해 있지만 측정 가능한 수준의 생존 심근세포(생존 CM; 진한 빨간색)가 검출되었다(그림 4; 1.05% ± 0.44%, SEM, n = 4). 특히, 심근 내 IL-6 투여(i.m.; 화살표)는 생존 CM의 양을 유의미하게 증가시켰으며, 이들은 주로 관심 영역(ROI) 내의 주사 부위 주변에 국소화되어 있었다(4.08% ± 0.99%, SEM, n = 6; p = 0.005, Student’s t-test). 이러한 결과는 IL-6가 허혈성 손상 후 심근세포의 생존을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
마지막으로, 현재의 ex vivo MI 모델은 실험 결과의 재현성에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 잠재적인 문제점이 있습니다. 그림 5에서 보여준 바와 같이, 결찰사의 미끄러짐으로 인해 LAD 폐쇄가 불충분하게 이루어져 광범위한 심근 생존이 나타날 수 있으며(4/168), 동시에 LAD의 분지들이 손상될 경우 불완전한 재관류가 발생할 수 있습니다(12/168). 또한, 대동맥 캐뉼라 삽입 중 공기 색전증이 발생하여 심근 손상을 유발할 수 있으며(화살표, 7/168), 이로 인해 정량 분석 시 허혈성 손상과 색전성 손상을 구분하기 어려워집니다. 마지막으로, 심장에 과도한 관류가 이루어질 경우 TTC 염색이 불충분하게 나타날 수 있으며(11/168), 이는 경색 부위의 경계를 설정하는 데 상당한 지장을 줍니다.
그림 1실험 설정 도식도. 비재순환식 중력 구동 정압 랑겐도르프(Langendorff) 시스템은 110 cmH₂O의 일정한 정수압으로 영양분이 풍부하고 산소가 공급된 Krebs–Henseleit 완충액(KHB)을 전달하도록 설계되었습니다.₂O. KHB를 먼저 다음 온도로 예열하였습니다. 37 °C 저장조에 담겨 워터 재킷 압력 컬럼으로 공급되며, 여기서 110 cmH₂O의 일정한 정수압이 유지된다.2O가 유지되었다 ~을 통해 압력 조절기. 관류된 심장은 일정 온도를 유지하기 위해 높이 조절이 가능하고 워터 재킷이 설치된 장기 욕조(organ bath)에 침전되었습니다. 37 °C 전 실험 기간 동안 (A). 사전 냉각된 금속 접시 내의 솜 패드 위에서 심정지 유발 후, 좌전강하동맥(LAD)을 일시적으로 결찰하여 심근경색을 유도하였다.B해당 절차는 실체 현미경 하에서 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 국소적 심근경색(MI)과 전신적 심근경색 및 경색 크기 결정. 전신적 MI는 현미경 TTC 이미지의 노란색 염색에서 나타나듯이 심장 전체에 허혈성 손상을 유도합니다. 심방 심근과 심첨 부위는 허혈에 더 강한 저항성을 보이는 것으로 나타났으며, 45분간의 전신적 무혈류 허혈 후에도 생존 상태를 유지했습니다(A의 위쪽 패널). 국소적 MI는 LAD 결찰 부위 원위쪽의 심근에 허혈성 손상을 유도합니다. 이 설정에서는 심외막하 심근의 일부가 붉은색으로 염색되어 생존 조직이 보존되었음을 시사합니다(A의 아래쪽 패널). 경색 크기는 ImageJ를 사용하여 정량화하였으며, 뚜렷한 염색 색상을 기준으로 경색/괴사 부위와 생존 심근을 구분하였습니다(B). 관심 영역(ROI) 내의 심근세포 생존율은 선택된 ROI에서 진한 붉은색 염색의 백분율을 측정하여 계산하였습니다(C). 스케일 바: 1 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 허혈 시간에 따른 경색 크기의 영향. 허혈 지속 시간이 30분에서 120분으로 연장됨에 따라 심근 손상이 점진적으로 악화되었다(A). 경색 크기는 허혈 시간이 30분(n = 3)에서 45분(n = 5) 사이일 때 2배 이상 증가했으며, 허혈 지속 시간이 60분(n = 5), 90분(n = 4), 120분(n = 3)으로 연장되면서 고점에 도달한 것으로 보였다(B). in vivo MI(ivMI, n = 5) 모델과 비교했을 때, ex vivo MI(evMI, n = 8) 모델은 유사한 허혈 지속 시간 하에서 거의 동일한 경색 크기를 나타냈다(36.88% ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0.27, Student’s t-Test). evMI 심장은 결정질 용액 관류와 관련된 심근 부종으로 인해 심실벽이 더 두껍고 심실강이 감소한 양상을 보였다(C). 오차 막대는 평균의 표준편차(SDM)를 나타낸다. 스케일 바: 1 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 허혈성 손상 후 IL-6에 의한 심근세포 생존 강화. evMI 모델에서 IL-6를 심근 내(i.m.)로 투여했을 때, 경색/괴사 부위(베이지색) 내에서 측정 가능한 수의 생존 심근세포(생존 CM; 진한 빨간색)가 확인되었으며, 주로 IL-6 주입 부위 주변에 국한되어 나타났다(화살표, 왼쪽 패널). 관심 영역(ROI, 점선으로 표시) 내 생존 CM을 정량화한 결과, PBS 주입 시에는 생존 심근의 분율이 매우 낮았으나(1.05% ± 0.44%, SEM, n = 4), IL-6 주입 시에는 ROI 내 생존 CM의 양이 유의미하게 증가하였다(4.08% ± 0.99%, SEM, n = 6; p = 0.005, Student’s t-test). 오차 막대는 평균의 표준 편차(SDM)를 나타낸다. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.
그림 5: 기술적 실패로 인한 불만족스럽거나 성공하지 못한 결과. ex vivo MI 모델의 대표적인 심근 손상 사례(왼쪽)에서 볼 수 있듯이, 전형적인 TTC 염색에서는 생존 심근과 괴사 심근을 일반적으로 명확하게 구분할 수 있습니다. 하지만 몇 가지 기술적 실패는 불만족스럽거나 해석 불가능한 결과를 초래할 수 있습니다. 봉합사 미끄러짐으로 인해 LAD 결찰이 부적절하게 이루어지면, 장기간의 허혈에도 불구하고 광범위한 심근 생존이 나타날 수 있습니다. 결찰 중 LAD의 분지들이 손상되어 이후 관류가 제대로 이루어지지 않을 경우 불완전한 재관류가 발생할 수 있으며, 이는 임상적으로 관찰되는 “no-reflow” 현상과 유사한 패턴을 생성합니다. 이러한 영역은 분홍색으로 보일 수 있습니다(화살표). 캐뉼레이션 과정 중 관상동맥 순환계로 유입된 공기 방울에 의한 미세혈관 색전증 또한 심근 손상을 유발할 수 있으며(화살표), 이로 인해 정량화를 위한 허혈성 손상과 색전성 손상의 구분이 어려워집니다. 마지막으로, 심장에 과도한 관류가 이루어질 경우 부적절한 TTC 염색이 나타날 수 있으며, 이는 허혈 외의 심근 손상을 유발할 수 있습니다. 스케일 바: 1 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
| F-피크 (n = 19) | F-steady (n = 19) | RF-피크 (n = 19) | RF-steady (n = 19) | |
| 평균 (mL/min) | 2.54 | 0.78 | 2 | 0.99 |
| 표준 편차 | 0.59 | 0.29 | 0.56 | 0.53 |
표 1: 허혈 및 재관류 동안의 최대(F-peak) 및 정상 상태(F-steady) 수준의 관상동맥 혈류(RF-peak 및 RF-steady).
토론
현재의 ex vivo MI 모델은 주로 정교한 Langendorff 관류 심장 시스템에 기반하고 있습니다2. 준비 과정 중 흔히 발생하는 실수는 관상동맥 순환계에 공기 방울이 유입되는 것이며, 이는 색전성 손상을 유발하고 허혈성 손상 평가를 방해할 수 있습니다. 이러한 문제를 방지하기 위해 각 실험 직전에 관류 시스템을 세심하게 점검하는 것이 필수적입니다. 튜브 시스템 내에 작은 공기 방울이 갇힌 경우, KHB로 역방향 플러싱을 수행하여 공기 방울을 압력 컬럼 쪽으로 밀어내면 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
본 프로토콜의 핵심 단계는 LAD 관상동맥의 결찰입니다. 따라서 우선적으로 LAD를 정확하게 시각적으로 식별하는 것이 매우 중요합니다. 대부분의 경우, 심장을 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하면 관상동맥이 반투명해져 LAD를 주변 심근과 명확하게 구별할 수 있게 됩니다. 또한, 8-0 Polypropylene 봉합사에 과도한 장력이 가해지면 LAD가 절단되어 이후의 재관류가 불가능해질 수 있으므로, 적절하고 숙련된 결찰 기술이 마찬가지로 중요합니다. 이러한 위험을 최소화하기 위해, 봉합사와 혈관 사이에 적절한 크기의 부드러운 pledget을 배치하여 결찰력을 분산시키고 관상동맥을 기계적 손상으로부터 보호해야 합니다. 그럼에도 불구하고, 결찰로 인해 발생하는 경미한 심근 손상은 불가피하지만, 일반적으로 관상동맥 관류를 저해하거나 실험 결과에 영향을 미치지는 않습니다. 마지막으로, 심근 손상은 온도에 매우 민감하므로13, 실험 전반에 걸쳐 일정한 온도를 유지하는 것이 결정적으로 중요합니다. 특히 정압 관류 조건에서는 관류 컬럼과 심장 사이에서 열 손실이 발생하기 쉬우며, 이는 관상동맥 혈류 속도에 따라 동적으로 변화합니다14. 따라서 이러한 변동은 심근 온도의 변화로 이어질 가능성이 있습니다. 이러한 환경에서는 안정적인 열 조건을 유지하기 위해 워터 재킷형 장기조(water-jacketed organ bath)를 사용하는 것이 매우 권장됩니다 (그림 1A).
이러한 기술적 난제들이 해결되면, ex vivo MI 모델은 분리된 생쥐 심장에서 심근 손상을 유도할 수 있는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다(그림 3A). 따라서 이는 MI 이후의 심근 생존력을 조사하고, 국소적으로 전달되는 치료적 중재법을 평가하며, 호흡이나 심장 박동의 간섭 없이 고해상도 이미징을 수행하는 데 매우 가치 있는 실험 시스템이 됩니다. 전심성(global) MI 프로토콜은 기술적으로 간단하며 이전 연구들에서 널리 사용되어 왔지만4, 주요한 한계점은 전심성 허혈의 지속 시간이 일반적으로 45 min 미만으로 제한된다는 것입니다3. 결과적으로, 국소성(regional) MI 모델과 달리 전심성 모델에서는 전층 경색(transmural infarction)이 거의 발생하지 않습니다(그림 2).
ex vivo MI 모델의 한 가지 독특한 특징은 신경 조절 및 혈액 순환 성분을 포함한 전신적 영향이 없다는 점이며, 이를 통해 연구자들은 심근에 가해지는 치료적 개입의 직접적인 국소 효과를 평가할 수 있습니다8. 이는 단리된 심근세포에서 심장 보호 효과가 입증된 IL-6와 같은 사이토카인 및 하위 PI3K/AKT 신호 전달 경로에 특히 유효합니다15. 반면, in vivo에서 IL-6의 심장 영향은 종종 일관성이 없거나 심지어 상충되는데, 이는 IL-6가 면역 세포를 동시에 활성화하고 직접적인 심장 보호 작용을 상쇄할 수 있는 염증 반응을 촉진하기 때문입니다16. 이러한 개념과 일치하게, 당사의 ex vivo 모델은 IL-6의 국소 심근 내 투여가 허혈성 손상 후 심근 생존력을 유의미하게 보존한다는 것을 설득력 있게 입증하였으며17,18, 이는 심근세포에 대한 IL-6의 직접적인 심장 보호 효과를 뒷받침합니다 (그림 4).
본 ex vivo MI 모델의 몇 가지 한계점을 인정합니다. 현재의 설정에서, 본 프로토콜3에서는 심장 수축 기능이 평가되지 않았습니다. 이는 일차적인 목적이 지역적 MI 모델에서 심근 생존력을 특성화하는 것이었으며, 수축 기능 장애는 허혈성 손상 후의 기능적 손상을 반영하지만 반드시 심근세포의 사멸을 나타내는 것은 아니기 때문입니다8. 또한, ex vivo MI 모델은 본질적으로 in vivo에서 MI 진행과 심장 리모델링에 실질적으로 기여할 수 있는 혈액 성분, 면역 세포 및 신경 호르몬의 영향을 배제합니다. 이러한 시스템적 복잡성의 감소는 ex vivo MI 모델의 주요 장점이지만, in vivo에서 발생할 수 있는 염증성, 혈관계, 신경 및 내분비 반응을 모사하는 광범위한 활용을 제한하기도 합니다. 마지막으로, 결정질 액체 관류는 in vivo MI 심장과 비교했을 때 심실벽 두께 증가와 심실강 감소로 입증된 바와 같이 심근 부종과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 부종의 발생은 심근 구조, 조직 확산 및 잠재적으로 세포 생존력을 변화시킬 수 있습니다. 따라서 본 모델은 심근 손상 및 심근세포 특이적 기전을 조사하기 위한 제어된 플랫폼으로 간주되어야 합니다.
그럼에도 불구하고, 여기서 설명한 ex vivo MI 모델은 외부의 조절 영향이 없는 상태에서 심근 생존력을 평가할 수 있는 간단하고 비용 효율적인 플랫폼입니다. 유전자 변형 마우스 모델의 사용이 증가하고 있다는 점을 고려할 때, 이 접근법은 고급 이미징, 전기생리학적 기록 및 분자 분석을 통해 심장 보호 기전을 조사하는 데 특히 유용할 수 있습니다. 또한, 이 모델은 국소적인 약물 또는 유전자 기반 중재법을 체계적으로 테스트하고, 전신적인 혼란 변수 없이 심근세포 특이적 기전을 분석하도록 조정될 수 있습니다. 따라서 ex vivo MI 모델은 심장 보호 경로의 식별과 기전 조사를 촉진하는 보완적인 실험 플랫폼을 제공합니다.
공개 사항
저자들은 이해관계의 충돌이 없음을 선언합니다. 저자들은 본 연구의 초안 작성, 데이터 분석, 그림 생성 또는 검증 과정에서 인공지능(AI) 도구 또는 생성형 AI 보조 기술을 사용하지 않았음을 선언합니다.
감사의 글
본 연구는 Jiangsu Geriatrics Society 일반 프로젝트(WO에게 JGS2026MS019), Zhenjiang City 과학기술부 사회발전재단(H.Z.에게 SH2023023 및 X.L.에게 SH2023057), FoKo 프로그램(ZD에게 23/2013) 및 Cardiovascular Research Institute Düsseldorf (CARID)의 지원을 받아 수행되었습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Milipore | 1.08380.0100 | 화학 시약 |
| 대동맥 캐뉼라 | BD | 305895 (20 G) | 역관류 |
| Aquamount | BDH | 362262H | 동결 절편 제작 |
| 전자저울 | Ohaus | - | 화학 시약 칭량 |
| 대형 포셉 | AESCULAP | - | 수술 도구 |
| 혈액 가스 분석기 | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | 가스 분석기 |
| 염화 칼슘 이수화물 | Fluka | 21097 | 화학 시약 |
| 카보젠 | Linde | 4040152 | 랑겐도르프 장치 |
| CellSens | Olympus | Version 3.1.1 | 이미징 소프트웨어 |
| 면 패드 | BEESana | PZN-1330900 | 수술 도구 |
| 커버 슬립 | Epredia | BB02400500A113MN20 | 동결 절편 제작 |
| 크라이오스탯 | Leica | M850 | 동결 절편 제작 |
| D(+)-글루코스 무수물 | Merck | 8337.1000 | 화학 시약 |
| 2회 증류수 | Milipore | - | 화학 시약 용해 |
| 에탄올 (100%) | Merck | 64-17-5 | 튜브 세척 |
| 에탄올 (70%) | VWR | UN1170 | 튜브 세척 |
| 필터 막 (0.2 µm) | Thermo Scientific | 8-000-230511 | 랑겐도르프 장치 |
| 유량계 | Transonic | T4S410 | 랑겐도르프 장치 |
| 유리 현미경 슬라이드 | Engelbrecht | 11102 | 동결 절편 제작 |
| 유리 수주 | Homemade | - | 랑겐도르프 장치 |
| 염산 | Roth | P074.1 | 화학 시약 |
| ImageJ | NIH | version 1.54g | 소프트웨어 |
| 인터루킨-6 | Biolegend | 570804 | 화학 시약 |
| 이소플루란 | Piramal | 14150097146754 | 화학 시약 |
| 광학 현미경 | Olympus | BX61 | 이미징 |
| 황산 마그네슘 칠수화물 | Merck | 5886.1000 | 화학 시약 |
| 의료용 유량 프로브 | Transonic | 3PXN | 랑겐도르프 장치 |
| 금속 접시 | Homemade | - | 수술 도구 |
| 마이크로 파인 주사기 | BD | 30G / 0.3 mL | 랑겐도르프 장치 |
| 마우스 | Janvier | C57BL/6J | 동물 |
| 대물렌즈 (x 1.25) | Olympus | PlanApo 1.25X/0.04 | 이미징 |
| OCT 화합물 | Sakura | 4583 | 화학 시약 |
| 페트리 접시 | Thermo Scientific | 172931 | 랑겐도르프 장치 |
| 인산 완충 식염수 | Roth | 9143.1 | 화학 시약 |
| 염화 칼륨 | Merck | 4936.1000 | 화학 시약 |
| 인산 이수소 칼륨 | Merck | 4873.1000 | 화학 시약 |
| 실크 봉합사 | F.S.T | 18020-60 | 수술 도구 |
| 염화 나트륨 | Sigmaaldrich | SZBD0810V | 화학 시약 |
| 탄산 수소 나트륨 | Roth | 6885.2 | 화학 시약 |
| 피루브산 나트륨 | Sigmaaldrich | 113-24-6 | 화학 시약 |
| 소프트 플레짓 | Deknatel | L-705 | 수술 도구 |
| 스테인리스 포셉 (8mm) | F.S.T | 11052-10 | 수술 도구 |
| 스테인리스 가위 | AESCULAP | BC702R | 수술 도구 |
| 스테인리스 가위 | AESCULAP | BC257R | 수술 도구 |
| 실체 현미경 | Leica | MZ6 | 수술 도구 |
| 봉합사 (8-0) | Ethicon | TG-108 | 수술 도구 |
| 주사기 (3 mL) | B. Braun | 4617100V | 역관류 |
| 3방향 스톱콕 | B. Braun | 16494C | 역관류 |
| 튜브 | Tygon | T3304-23 | 랑겐도르프 장치 |
| 항온 수조 | HAAKE | DC1/B3 | 랑겐도르프 장치 |
| 잠보니 용액 | Morphisto | 12773.0050 | 화학 시약 |
참고문헌
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