연구 논문

전사체 분석 및 배양된 인간 섬유아세포를 이용한 켈로이드 내 헴 대사 관련 바이오마커의 규명

16 조회수

⸱

DOI:

10.3791/73889

⸱

2026년 9월 29일

 ,  ,  , 
1Department of Dermatology, The Second Affiliated Hospital of Jiaxing University

이 논문에서

요약

통합 벌크 및 단일 세포 전사체 분석을 통해 켈로이드의 헴 대사 관련 진단 바이오마커 6종을 확인했습니다. 실험적 검증을 통해 켈로이드 섬유아세포에서 feline leukemia virus subgroup C receptor 1 (FLVCR1)의 조절 이상이 확인되었으며, 분자 도킹 분석을 통해 추가적인 기능 연구가 필요한 잠재적 FLVCR1 상호작용 화합물로 (+)-gallocatechin을 식별했습니다.

초록

켈로이드는 재발률이 높고 병인 기전이 불분명하며 효과적인 치료 표적이 부족한 섬유증식성 질환입니다. 최근의 증거들에 따르면 대사 재프로그래밍, 특히 헴(heme) 대사가 섬유화를 유도할 수 있다고 시사됩니다. 본 연구에서는 고양이 백혈병 바이러스 하위 그룹 C 수용체 1(FLVCR1)을 중심으로 켈로이드 병인에서의 헴 대사의 역할을 조사하고, 그 진단 및 치료적 잠재력을 탐색하였습니다. 저희는 벌크 RNA-seq 데이터셋과 단일 세포 RNA-seq 데이터(scRNA-seq)를 분석하였습니다. 차등 발현 분석, 최소 절대 수축 및 선택 연산자(LASSO) 및 랜덤 포레스트(RF) 모델을 통해 헴 대사 관련 진단 바이오마커를 식별하였습니다. 또한 면역 침윤 분석, 단일 세포 매핑, 마이크로RNA(miRNA) 네트워크 구축 및 전통 중약 화합물을 이용한 분자 도킹을 수행하였습니다. 6개의 헴 대사 관련 바이오마커가 식별되었으며, 이를 통해 높은 정확도의 진단 노모그램을 형성하였습니다. 혈관 내피세포와 멜라닌 세포에서 풍부하게 나타난 FLVCR1은 T 여포 도움 T 세포와 음의 상관관계를 보여, 면역-대사 간의 상호작용(crosstalk)을 시사하였습니다. miRNA 조절 네트워크 분석 결과, 6개 바이오마커 모두를 공동 표적으로 하는 5개의 miRNA가 밝혀졌습니다. 분자 도킹을 통해 (+)-gallocatechin이 고친화성 FLVCR1 리간드임을 확인하였습니다. 이러한 결과는 켈로이드 병인에서 FLVCR1 관련 헴 대사와 면역 변화 사이의 연관성을 시사합니다. 해당 바이오마커 패널은 탐색적 진단 잠재력을 보였으며, (+)-gallocatechin은 추가 검증이 필요한 FLVCR1 상호작용 후보 화합물로 식별되었습니다. 본 연구는 켈로이드를 대사-섬유화 스펙트럼 내에서 재정의하며, 대사-면역 개입을 새로운 치료 전략으로 제안합니다.

서론

켈로이드는 원래의 피부 손상 범위를 넘어 과도한 세포외 기질 침착이 나타나는 섬유증성 증식성 질환으로, 전 세계 인구의 4-16%에서 나타나며 아프리카, 아시아 및 히스패닉 혈통의 개인에게서 현저하게 높은 유병률을 보인다1,2. 조직학적으로는 양성임에도 불구하고, 켈로이드는 지속적인 가려움증, 통증, 기능적 구축 및 외관상 변형을 통해 상당한 신체적, 심리사회적 부담을 초래한다. 병변 내 코르티코스테로이드 주입, 외과적 절제, 방사선 치료 및 레이저 치료를 포함한 현재의 치료 방법들은 단독 요법 후 재발률이 50%를 초과하여 여전히 최적화되지 않은 상태이다3,4,5. 이러한 치료적 교착 상태는 켈로이드 발병 기전, 특히 전형적인 섬유화 촉진 신호 전달 외에 섬유화 폭포 현상을 개시하고 유지하는 상위 구동 인자에 대한 이해의 근본적인 공백을 강조한다.

현대 연구는 주로 TGF-β/Smad 신호 전달 및 비정상적인 섬유아세포 활성화와 같은 표준 경로에 집중되어 왔습니다6,7,8. 켈로이드 조직에서 면역 세포 침윤, 특히 M2-분극화 대식세포, 조절 T 세포 및 조절 장애가 있는 수지상 세포가 보고되었으나9,10, 이러한 연구들은 대체로 면역 변화를 상위 조절자가 아닌 섬유아세포 기능 장애의 하위 결과로 취급해 왔습니다. 결정적으로, 이러한 면역-섬유화 교차 작용을 능동적으로 형성할 수 있는 대사 프로그램은 켈로이드 병인에서 완전히 미개척 상태로 남아 있습니다11,12,13. 대사 재편성이 조직 리모델링의 핵심 조절자로 작용한다는 섬유화 질환의 새로운 패러다임을 고려할 때, 이러한 지식의 공백은 매우 두드러집니다.

대사 재프로그래밍은 최근 여러 장기 시스템에 걸친 섬유화 과정의 핵심 노드로 부상했습니다. 폐 및 간 섬유증에서 수송체, 스캐빈저 또는 생합성 효소의 발현 변화를 통한 헴(heme) 항상성 조절 장애는 콜라겐 침착을 직접적으로 촉진하는 산화 스트레스, 페로토시스(ferroptosis) 및 무균성 염증을 유발합니다14. 헴 축적은 NLRP3 인플라마솜을 활성화하여 섬유아세포 활성화를 유도하는 반면, 고양이 백혈병 바이러스 하위그룹 C 수용체 1 (FLVCR1) 결핍은 해결되지 않은 헴 독성을 통해 조직 섬유화를 악화시킵니다. 이러한 발견은 헴 대사가 단순히 유지 관리 과정이 아니라 섬유화 연쇄 반응을 시작할 수 있는 역동적인 신호 허브임을 시사하며, 이는 피부 섬유증식성 질환에서 아직 검증되지 않은 패러다임입니다.

헴 매개 면역 조절의 타당성은 암 및 만성 염증 모델의 기전적 증거를 통해 더욱 뒷받침됩니다. 헴은 면역 세포의 운명을 직접적으로 조절하는 신호 분자로 작용합니다. 즉, TLR4/NF-κB 신호 전달을 통해 M1에서 M2로의 대식세포 분극화를 촉진하고15, Bach2 매개 전사 억제를 통해 T세포 분화에 영향을 미치며16, FLVCR1 의존적 헴 수출을 통해 수지상 세포의 성숙을 결정적으로 조절합니다17,18. 특히, 세포 내 헴 항상성에 필수적인 세포막 헴 수출 단백질인 FLVCR1은 최근 면역 세포 발달 및 내피 세포 기능 장애와 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다19. 이러한 수렴적 증거들은 FLVCR1을 헴 대사 조절 장애와 병리적 면역 리모델링을 연결하는 타당한 분자적 결절로 설정하며, 이는 면역 세포가 풍부한 미세환경이라는 켈로이드의 특성을 고려할 때 켈로이드 발병 기전에 깊은 시사점을 주는 가설입니다.

다른 질병 상황에서 헴-면역 상호작용(heme-immune crosstalk)에 대한 이해는 크게 진전되었음에도 불구하고, 켈로이드에서 조절 장애가 발생한 헴 대사가 병리적 면역 환경을 개시하거나 증폭시키는 상위 구동 인자로 작용하는지는 완전히 미개척 상태로 남아 있습니다. 이러한 결정적인 지식 공백은 다음과 같은 몇 가지 상호 연관된 이유로 시급한 조사가 필요합니다. 우선, 켈로이드는 지속적인 염증 및 산화 스트레스를 포함하여 폐섬유증 및 간섬유증과 같은 대사 유도성 섬유성 질환과 핵심적인 병리적 특징을 공유하고 있으며, 이는 기저 조절 메커니즘에 잠재적인 공통점이 있음을 시사합니다. FLVCR1 중심의 헴 수출 기전은 비피부 조직에서 대식세포 분극화 및 수지상 세포 성숙과 같은 주요 면역 기능을 직접적으로 조절한다는 것이 기전적으로 입증되었으며, 이는 켈로이드 면역 병리학으로의 외삽을 위한 견고한 이론적 토대를 제공합니다20. 가장 중요한 점은, 이러한 대사-면역 축을 표적으로 삼는 것이 단순히 하위의 섬유화 효과를 억제하는 현재의 증상 완화 요법을 넘어, 질병 진행의 대사적 기원 단계에서 상위 개입을 가능하게 하는 패러다임 전환의 기회를 제공한다는 것입니다21.

이러한 근거를 바탕으로, 우리는 FLVCR1 중심의 헴(heme) 대사 조절 장애가 면역 미세환경을 능동적으로 재구성하여 켈로이드의 병인 기전을 유도한다는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 체계적으로 검증하기 위해, 우리는 벌크 및 단일 세포 전사체 분석을 통합한 다단계 접근 방식을 적용하였습니다. 먼저 머신러닝 알고리즘과 독립적 코호트 검증을 통해 켈로이드 조직에서 헴 대사와 관련된 진단성 바이오마커를 식별하고 검증하였습니다. 그 후, 단일 세포 해상도 매핑을 통해 내피세포, 섬유아세포, 멜라닌 세포 및 면역 세포 하위 집단을 포함한 서로 다른 세포 구획 전반에서 이러한 바이오마커의 공간적 발현 패턴을 분석하였습니다. 이어서, 특정 면역 세포 집단과의 정량적 상관관계를 규명하여 기능적 면역-대사 연결 고리를 확립하였습니다. 마지막으로, FLVCR1 중심의 microRNA(miRNA) 조절 네트워크를 구축하고 전통 중약 화합물과의 분자 도킹을 수행하여 약물 표적 개입 지점을 식별하였습니다. 이 종합적인 연구는 켈로이드 병인 기전에서 이전에는 알려지지 않았던 헴 대사-면역 축을 밝혀냈을 뿐만 아니라, 치료가 어려운 이 섬유증 증식성 질환에 대해 진단 및 치료적 잠재력을 모두 갖춘 임상 적용 가능한 바이오마커 패널을 제시합니다.

프로토콜

모든 데이터가 Gene Expression Omnibus (GEO)를 포함하여 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 수집되었으며, 식별 가능한 인간 참여자나 동물 피험자가 직접 관여하지 않았으므로, 본 연구에 윤리적 승인 및 고지된 동의는 적용되지 않았습니다.

데이터 획득 및 전처리

헴 대사 관련 유전자는 Molecular Signatures Database(MSigDB; 다음을 참조하십시오. 재료 목록 and 보충 표 S1), 여기에는 REACTOME_Heme_Biosynthesis, REACTOME_Heme_Degradation, Wikipathway_Heme_Biosynthesis, REACTOME_Scavenging_Heme_from_Plasma 및 HALLMARK_Heme_Metabolism의 유전자 세트가 포함됩니다. 본 연구에서 분석된 모든 데이터세트는 공개적으로 이용 가능한 소스에서 얻었습니다. 두 개의 벌크 유전자 발현 마이크로어레이 데이터세트를 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스에서 검색하였으며, 이는 켈로이드 샘플 18개와 정상 피부 샘플 14개로 구성된 GSE44270 및 켈로이드 샘플 10개와 정상 피부 샘플 9개로 구성된 GSE7890입니다. GSE44270과 GSE7890은 각각 GPL6244 및 GPL570 플랫폼에서 생성되었습니다. 시리즈 매트릭스 파일과 해당 샘플 정보를 다운로드하여 R 환경으로 가져왔습니다. 시리즈 매트릭스 파일의 발현 값이 이미 원본 데이터 제출자에 의해 전처리 및 정규화되었으므로, 추가적인 log2 변환이나 샘플 간 정규화는 수행하지 않았습니다. 두 데이터세트는 서로 다른 마이크로어레이 플랫폼에서 생성되었으므로 병합하지 않고 독립적으로 처리하였습니다. 데이터세트는 다음과 같이 전처리되었습니다 (다음의 재료 목록유전자 프로브를 해당 유전자 심볼에 매핑하였으며, 유전자 주석이 없거나 여러 유전자에 일치하는 프로브는 제외하였습니다. 여러 프로브 세트가 존재하는 유전자의 경우, 검출된 발현 수준이 가장 높은 값을 발현값으로 할당하였습니다. 또한, 3개의 켈로이드 샘플이 포함된 GSE163973의 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 데이터를 다운로드하고, 원문 연구에서 정의한 품질 관리 표준에 따라 처리하였습니다.

켈로이드에서 헴 대사 관련 진단 마커의 스크리닝 및 검증

켈로이드에서 차등 발현된 헴 대사 관련 유전자를 식별하기 위해, R 함수인 wilcox.test를 사용하여 GSE44270에 윌콕슨 순위합 검정(Wilcoxon rank-sum test)을 적용하였으며, 유의 수준 임계값은 P < 0.05. 켈로이드의 잠재적 진단 마커를 식별하기 위해 랜덤 포레스트(RF)와 최소 절대 수축 및 선택 연산자(LASSO) 로지스틱 회귀라는 두 가지 머신러닝 모델이 사용되었습니다. 재현성을 보장하기 위해 랜덤 시드 1을 사용하여 랜덤 포레스트 분석을 수행하였습니다(다음의 재료 목록). 모델은 500개의 트리(ntree = 500)를 사용하여 구축되었으며, 유전자 중요도는 노드 불순도 평균 감소량(IncNodePurity)을 기준으로 평가되었습니다. 중요도 값이 0.3보다 큰 유전자를 랜덤 포레스트 기반 후보 바이오마커로 선정하였습니다. LASSO 로지스틱 회귀 분석은 다음을 사용하여 수행되었습니다. α = 1이었으며, 모델 훈련 과정에서 50개의 lambda 값을 평가하였습니다(다음의 내용을 참조하십시오. 재료 목록). 최적의 패널티 파라미터는 이항 반응(binomial response)을 적용하여 cv.glmnet 함수를 이용한 5겹 교차 검증(5-fold cross-validation)으로 결정하였다. 회귀 계수가 0이 아닌 유전자를 LASSO 선택 후보군으로 유지하였다. 최종적으로 Random Forest와 LASSO 회귀 분석을 통해 식별된 유전자들의 교집합을 최종 진단 유전자 시그니처로 간주하였다. 최종 진단 유전자 시그니처는 노모그램 기반 모델을 사용하여 평가하였다. 모든 특성 선택 및 모델 파라미터 추정은 탐색 코호트(GSE44270)에서만 수행되었으며, 구축된 6개 유전자 시그니처는 독립 검증 코호트(GSE7890)에서 추가로 평가되었다. 노모그램의 진단 성능은 ROC(receiver operating characteristic) 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하여 평가하였다. 모델 안정성을 조사하기 위해 5겹 교차 검증과 1,000회의 붓스트랩 재표집(bootstrap resampling) 반복 수행을 분석에 포함하였으며, 이를 통해 낙관도 교정 AUC(optimism-corrected AUC)를 도출하였다. 이후 결정 곡선 분석(DCA)을 사용하여 노모그램의 잠재적 순 이익(net benefit)을 추정하였으나, 표본 크기가 작기 때문에 이 결과는 신중하게 해석하였다.

면역 세포 침윤 및 상관관계 분석

단일 샘플 유전자 세트 풍부도 분석(ssGSEA)을 통해 면역 세포 풍부도를 평가하였습니다(재료 표 참조). 면역 세포 시그니처 매트릭스는 Charoentong 등이 이전에 발표한 연구22에서 얻었으며, 28종의 적응 및 선천 면역 세포 집단을 나타내는 782개의 마커 유전자를 포함하고 있었습니다. 분석은 연속적이고 정규화된 마이크로어레이 발현 값에 가우시안 커널을 사용하여 수행되었습니다. 마커 유전자를 발현 매트릭스와 매칭한 후 최소 유전자 세트 크기는 10개로 설정하였으며, 산출된 ssGSEA 점수를 정규화하였습니다. 그 외 모든 설정은 기본값으로 유지하였습니다. 이후 면역 세포 풍부도 점수와 진단 유전자 발현 사이의 관계를 평가하기 위해 피어슨 상관 계수를 계산하였습니다. 결과로 얻은 상관 매트릭스는 상관관계 플롯으로 시각화하였으며, 선택된 연관성은 롤리팝 플롯으로 추가 표시하였습니다(재료 표 참조).

단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터 처리 및 분석

단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터는 GSE163973에서 확보하였으며, 본 분석에는 켈로이드 샘플 3종(KF1, KF2, KF3)만을 포함하였다. 발현 데이터의 가져오기 및 처리 과정은 다음과 같이 수행하였다(다음의... 참조). 재료 목록총 고유 분자 식별자(unique molecular identifier, UMI) 수가 200개 미만이거나 6,000개 초과인 세포는 제외하였으며, 더블릿(doublet)으로 예측되는 세포는 제거하였다. 각 세포의 유전자 발현 수는 총 세포 발현량으로 정규화한 후, 스케일 인자 10,000을 곱하고 로그 변환하였다. 데이터 스케일링 과정에서 배치 관련 변이를 회귀 분석으로 제거하였으며, 그 결과로 얻은 스케일링된 잔차를 후속 분석에 사용하였다. 평균 발현량과 분산도를 기준으로 상위 2,000개의 고변이 유전자를 선정하여 주성분 분석을 수행하였다. 상위 15개의 주성분을 사용하여 유클리드 거리를 기반으로 한 k-최근접 이웃(k-nearest-neighbor) 그래프를 구축하였고, 이를 다시 공유 최근접 이웃(shared nearest-neighbor) 그래프로 변환하였다. Louvain 알고리즘을 사용하여 0.8의 해상도로 세포를 클러스터링하였으며, 동일한 15개의 주성분을 사용하여 균일 매니폴드 근사 및 투영(uniform manifold approximation and projection, UMAP)을 수행하였다. 세포 유형은 원저 논문에 보고된 세포 유형 정의에 따라 주석을 달았으며, 해당 주석 내용을 메타데이터 필드에 기록하였다. 세포 유형 주석과 클러스터 할당 결과는 UMAP 좌표상에 시각화하였으며, 주석이 달린 각 세포 집단 전체에 걸쳐 진단 유전자 발현을 표시하였다.

miRNA–mRNA 조절 네트워크 구축

miRNA–mRNA 조절 네트워크는 다음과 같이 구축되었습니다(재료 표 참조). 유기체로는 Homo sapiens를 선택하였으며, 유전자 식별자는 Official Gene Symbols로 제공되었습니다. 후보 유전자를 Gene–miRNA Interactions 모듈에 입력하고, 상호작용 데이터베이스로 TarBase v9.0를 선택하였습니다. TarBase는 실험적으로 검증된 miRNA–유전자 조절 상호작용을 포함하고 있습니다. 네트워크 구축을 위해 입력된 후보 유전자가 포함된 실험적 근거가 있는 miRNA–mRNA 상호작용만 유지하였으며, 실험적 증거가 없는 예측된 상호작용은 제외하였습니다. 추가적인 신뢰도 점수 임계값은 적용하지 않았습니다.

구조 기반 가상 스크리닝 및 분자 도킹 분석

구조 기반 가상 스크리닝(SBVS) 워크플로우를 사용하여 화합물 라이브러리에서 인간 FLVCR1(feline leukemia virus subgroup C receptor-related protein 1; 재료 표 참조)에 대한 후보 리간드를 우선순위화하기 위해 가상 스크리닝을 수행하였다. 인간 FLVCR1의 3차원 구조는 Protein Data Bank(PDB ID: 8UBZ)에서 검색하였다. 이 구조는 3.02 Å의 전체 해상도로 단일 입자 저온 전자 현미경(single-particle cryo-electron microscopy)을 통해 결정된 콜린 결합 인간 FLVCR1을 나타낸다(EMDB accession: EMD-42110). 실험적으로 결정된 구조가 선택된 이유는 FLVCR1의 기질 결합 형태를 포함하고 있어 생리학적으로 유의미한 리간드 결합 공동(cavity)을 정의하는 구조적 정보를 제공하기 때문이다. 수용체 준비 과정에서, 기질 진입 및 리간드 결합 영역 주변의 구조적 환경을 유지하기 위해 함께 분해된 콜린(CHT) 및 콜레스테롤 헤미석시네이트(Y01) 분자를 유지하였다. 도킹 탐색 공간은 함께 분해된 콜린 결합 영역을 포함하는 FLVCR1 기질/리간드 결합 공동 주변으로 정의하였다. 그리드 박스는 x = 160.587 Å, y = 160.613 Å, z = 160.484 Å를 중심으로 설정하였다. 도킹 박스의 크기는 기질 결합 공동과 주변 잔기를 충분히 포함하도록 [X × Y × Z Å]로 설정하였다. 이후 후보 화합물들을 이 미리 정의된 결합 영역에 도킹하였다. 도킹 포즈는 예측된 결합 친화도에 따라 순위를 매겼으며, 도킹 점수가 더 음수일수록 리간드-FLVCR1 상호작용이 더 유리할 것으로 예측됨을 나타낸다. 상위 순위 화합물들을 선택하여 이후의 결합 모드 및 단백질-리간드 상호작용 분석을 수행하였다.

분자 동역학 시뮬레이션 및 MM/GBSA 결합 자유 에너지 계산

예측된 단백질-리간드 복합체를 더욱 자세히 조사하기 위해 분자 동역학(MD) 시뮬레이션을 수행하였습니다(재료 표 참조). 리간드 토폴로지는 General Amber Force Field(GAFF) 파라미터를 할당하고 restrained electrostatic potential(RESP) 전하를 통합하여 준비하였습니다. 이후 복합체는 Amber99SB-ILDN 포스 필드로 기술되었으며, 3 points water 모델의 transferable intermolecular potential 내에 배치하고 세 개의 Na⁺ 이온으로 중화하였습니다. steepest-descent 에너지 최소화 후, 입자 수, 부피, 온도가 일정한 앙상블(NVT)에서 100 ps 동안, 그리고 입자 수, 압력, 온도가 일정한 앙상블(NPT)에서 추가로 100 ps 동안 평형화를 진행하였으며, 각 단계에서 100,000 steps를 수행하였습니다. 이어서 300 K 및 1 bar 조건에서 2 fs 시간 간격을 사용하여 100 ns의 프로덕션 런을 수행하였습니다. 결과 궤적에 대해 root mean square deviation(RMSD), root mean square fluctuation(RMSF), 회전 반경(Rg), 용매 접근 가능 표면적(SASA), 수소 결합 지속성 및 molecular mechanics/generalized Born surface area(MM/GBSA) 결합 자유 에너지를 분석하였습니다.

세포 배양

NHDF 정상 인간 진피 섬유아세포 세포주와 PKF 일차 켈로이드 섬유아세포 세포주는 2% fetal calf serum, 재조합 인간 basic fibroblast growth factor (1 ng/mL) 및 insulin (5 µg/mL)이 첨가된 섬유아세포 성장 배지에서 배양되었습니다. 두 세포주 모두 37 °C, 5% CO₂ 조건의 습윤 배양기에서 유지되었으며, confluence가 80–90%에 도달했을 때 계대 배양하였습니다.

웨스턴 블롯 분석

radioimmunoprecipitation assay, phenylmethylsulfonyl fluoride, protease inhibitor cocktail 및 phosphatase inhibitor로 구성된 lysis buffer를 사용하여 NHDF 및 PKF 세포에서 총 단백질을 분리하였습니다. bicinchoninic acid assay로 단백질 농도를 측정하였으며, 이후 동일한 양의 단백질을 sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis로 분리하고 polyvinylidene fluoride membrane으로 전이시켰습니다. membrane을 Tween/Tris-buffered saline으로 조제한 5% 탈지분유로 상온에서 90분 동안 블로킹한 후, FLVCR1 (rabbit polyclonal, 1:1,000) 및 GAPDH (mouse monoclonal, 1:20,000)에 대한 1차 항체를 사용하여 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시켰습니다. 다음 날, 2차 항체를 사용하여 상온에서 90분 동안 반응시켰습니다. 밴드 강도는 ImageJ로 측정하였으며, 상대적 단백질 수준은 GAPDH 내부 대조군을 기준으로 표준화하였습니다. 모든 western blot 분석에는 최소 3회 이상의 독립적인 생물학적 반복 실험이 수행되었습니다.

실시간 형광 정량적 역전사 PCR (qRT-PCR) 분석

NHDF 및 PKF 세포로부터 언급된 키트를 사용하여 총 RNA를 준비하였습니다. 그 후, qPCR용 언급된 cDNA 합성 믹스(dsDNase 포함)를 사용하여 cDNA를 생성하였습니다. qRT-PCR은 실시간 PCR 시스템에서 수행되었으며, FLVCR1 발현은 언급된 SYBR Green Fast Mix로 측정하였습니다. GAPDH mRNA를 정규화를 위한 내부 대조군으로 사용하였습니다. 모든 qRT-PCR 반응은 기술적 반복으로 3회씩 수행되었으며, 상대적 mRNA 수준은 2−ΔΔCt 방법으로 계산하였습니다. 각 실험은 최소 3회 독립적으로 수행되었으며, 프라이머 서열은 보충 표 S2에 제공되어 있습니다.

통계 분석

그룹 간 차이는 Wilcoxon 순위합 검정으로 테스트하였으며, 값은 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다. 연속 변수 간의 연관성은 Pearson 상관계수를 사용하여 분석하였다. P < 0.05인 결과를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. 유의 수준은 ns, P > 0.05; *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; 및 ****, P < 0.0001로 표시하였다.

결과

머신러닝 알고리즘을 이용한 켈로이드 후보 진단 바이오마커 스크리닝

본 연구에는 총 283개의 헴 대사 관련 유전자가 포함되었습니다. 켈로이드 조직과 정상 피부 조직을 비교한 GSE44270 데이터 세트의 차별 발현 분석을 통해 25개의 유의미한 차별 발현 유전자를 확인하였습니다(그림 1A 및 보충 표 S3). 질병 관련 바이오마커를 추가로 스크리닝하기 위해, LASSO 회귀 분석을 통해 9개의 후보 유전자를 식별하였다(그림 1B,C 그리고 보충 표 S3), 반면 랜덤 포레스트(RF) 알고리즘은 예측 중요도가 높은 11개의 유전자를 선정하였다(그림 1D 및 보충 표 S3). LASSO 및 RF 결과의 중첩 부분은 벤 다이어그램을 사용하여 시각화하였으며, 이를 통해 다음과 같은 6개의 핵심 바이오마커를 도출하였다. FLVCR1, TMCC2, EIF2AK1, XK, HPX, 그리고 KEL (그림 1E 그리고 보충 표 S3). GSE44270 코호트에서 수신자 조작 특성(ROC) 분석을 수행한 결과, 6가지 바이오마커 모두 우수한 진단 성능을 보였으며, AUC 값은 각각 0.8016으로 나타났다. FLVCR1, 0.7063에 대한 TMCC2, 0.7817에 대해 EIF2AK1, 0.7460에 대해 XK, 0.7500의 경우 HPX, 그리고 0.7857은 ~을 위한 값입니다. KEL (그림 1F). 이 6가지 바이오마커를 기반으로, R의 rms 패키지를 사용하여 켈로이드 진단 노모그램을 구축하였습니다.그림 1G).

figure-results-1
그림 1: 머신러닝 알고리즘을 이용한 켈로이드 관련 헴 대사 관련 후보 유전자의 식별. (A) 켈로이드 조직과 정상 조직 간의 헴 대사 관련 유전자의 차별적 발현을 나타내는 박스 플롯. (B,C) 후보 진단 마커 스크리닝을 위한 LASSO 로지스틱 회귀 분석. (D) RF 알고리즘에 의해 선택된 후보 바이오마커. (E) 두 가지 머신러닝 알고리즘에 의해 식별된 중복 유전자를 보여주는 벤 다이어그램. (F) 후보 바이오마커의 진단 성능을 평가하는 ROC 곡선 분석. (G) 6개 유전자 시그니처를 기반으로 한 켈로이드 예측 노모그램. 약어: LASSO, least absolute shrinkage and selection operator; RF, random forest; ROC, receiver operating characteristic. 통계적 유의성: ns, P > 0.05; *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; 및 ****, P < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

진단 노모그램의 예측 성능을 훈련 코호트(GSE44270)와 검증 코호트(GSE7890) 모두에서 평가하였습니다. 이 모델은 각각 0.984 (95% CI: 0.950–1.000) 및 0.922 (95% CI: 0.806–1.000)의 AUC 값을 달성하며 우수한 진단 정확도를 나타냈습니다(그림 2A,D). 6개 유전자 진단 시그니처의 강건성과 잠재적 과적합을 추가로 평가하기 위해, 발견 코호트(GSE44270)에서 추가적인 내부 검증 분석을 수행하였습니다. 5겹 교차 검증(Fivefold cross-validation) 결과, 하위 집합 전반에서 평균 AUC 0.925의 일관된 판별 성능을 보였으며, 이는 훈련 샘플의 변동에도 불구하고 모델이 안정적인 분류 성능을 유지했음을 나타냅니다. 또한, 1,000회의 재추출 반복을 통한 부트스트랩 검증 결과 평균 AUC 0.930 (95% CI: 0.794–1.000)을 얻었습니다. 제한된 샘플 크기로 인해 발생할 수 있는 잠재적 낙관도를 조정한 후에도 낙관도 교정 AUC(optimism-corrected AUC)는 0.930으로 유지되었으며, 이는 6개 유전자 시그니처의 진단 성능이 내부 검증 후에도 비교적 안정적이었음을 시사합니다. 나아가, 결정 곡선 분석(DCA) 결과, 제한된 샘플 크기를 고려하여 신중하게 해석해야 함에도 불구하고, 노모그램이 다양한 임계 확률 범위에서 다른 진단 전략보다 더 높은 잠재적 순 이익(net benefit)을 나타내는 것으로 확인되었습니다(그림 2B,E). 또한, 훈련 및 검증 코호트 모두에서 켈로이드 샘플이 건강한 대조군보다 유의하게 높은 위험 점수를 보였으며(그림 2C,F), 이는 진단 모델의 안정성과 신뢰성을 더욱 입증합니다.

figure-results-2
그림 2: 켈로이드 예측 노모그램의 검증. (A) GSE44270 데이터셋에서 노모그램의 예측 성능을 평가한 ROC 곡선. (B) GSE44270에서 노모그램의 임상적 유용성을 평가한 DCA. (C) GSE44270의 켈로이드 샘플과 건강한 샘플 간의 위험 점수 분포 비교. (D) 독립적인 GSE7890 데이터셋에서 노모그램의 예측 성능을 평가한 ROC 곡선. (E) GSE7890에서 노모그램의 임상적 유용성을 평가한 DCA. (F) GSE7890의 켈로이드 샘플과 건강한 샘플 간의 위험 점수 분포 비교. 약어: ROC = 수신자 조작 특성; DCA = 결정 곡선 분석. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

진단 바이오마커는 켈로이드의 면역학적 특성과 관련이 있다

6가지 진단 바이오마커와 면역 미세환경 사이의 관계를 탐구하기 위해, 바이오마커 발현과 면역 세포 침윤 사이의 연관성을 평가하는 상관관계 분석을 수행하였다. 분석 결과, 6가지 바이오마커 모두 여러 침윤 면역 세포 집단과 유의미한 연관성이 있는 것으로 나타났다(그림 3A). 구체적으로, FLVCR1 발현은 T 여포 도움 세포(T follicular helper cells)와 음의 상관관계를 보였다(그림 3B). TMCC2 자연 살해 세포(natural killer cells) 및 활성 수지상 세포(activated dendritic cells)와는 양의 상관관계를 보인 반면, 미성숙 수지상 세포(immature dendritic cells) 및 미성숙 B 세포(immature B cells)와는 음의 상관관계를 보였다(그림 3C–F). 또한, EIF2AK1 발현은 CD56과 음의 상관관계를 보였다.흐릿함 자연살해세포 (그림 3G), 반면 XK는 호산구와 음의 상관관계를 보였다(그림 3H).

figure-results-3
그림 3후보 헴 대사 관련 유전자와 면역 세포 침윤 간의 상관관계. (A) 후보 유전자와 면역 세포 집단 간의 상관관계를 보여주는 히트맵. 빨간색은 양의 상관관계를, 파란색은 음의 상관관계를 나타냄. (B). ~ 사이의 상관관계 FLVCR1 발현 및 T 여포 도움 세포. (C-F) 간의 상관관계 TMCC2 발현 및 각각 자연살해세포, 활성화된 수지상세포, 미성숙 수지상세포, 그리고 미성숙 B세포. (G) 간의 상관관계 EIF2AK1 발현 및 CD56dim 자연살해세포. (H). ~간의 상관관계 XK 발현 및 호산구. 약어: FLVCR1 = 고양이 백혈병 바이러스 서브그룹 C 수용체 1; TMCC2 = transmembrane and coiled-coil domains 2; EIF2AK1 = 진핵세포 번역 개시 인자 2 알파 키나아제 1; CD56희미한 cluster of differentiation 56 dim (CD56 dim). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

단세포 전사체 데이터 분석

켈로이드 미세환경 내에서 확인된 진단 바이오마커의 발현 패턴을 특성화하기 위해, 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터셋 GSE163973을 분석하였습니다. 품질 관리 및 데이터 통합 후, 후속 분석을 위해 21,488개의 고품질 세포를 유지하였습니다. 총 고유 분자 식별자(UMI) 카운트가 200개 미만이거나 6,000개 이상인 세포는 제외하였으며, DoubletDetection 패키지를 사용하여 잠재적인 더블릿(doublet)을 식별하고 제거하였습니다. 발현 변동성이 가장 큰 2,000개의 유전자를 선택한 후, Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)을 이용해 차원 축소 및 시각화를 수행하였습니다. 그 결과 내피세포, 섬유아세포, 근섬유, 각질형성세포, 면역세포, 림프 내피세포, 선세포, 신경세포, 멜라닌세포 및 분류되지 않은 세포군을 포함하여 총 10개의 주요 세포군이 확인되었습니다(그림 4A,B). 발현 프로파일링을 통해 진단 바이오마커의 뚜렷한 세포 유형 특이적 분포 패턴이 드러났습니다. FLVCR1은 주로 내피세포와 멜라닌세포에서 발현된 반면, EIF2AK1은 신경세포, 선세포 및 섬유아세포에서 상대적으로 높은 발현을 보였습니다. HPX는 주로 멜라닌세포에 농축되어 있었으며, KEL은 선세포에서 지배적인 발현을 나타냈습니다(그림 4C,D).

figure-results-4
그림 4: 켈로이드 단일 세포 전사체 내 헴 대사 관련 진단 바이오마커의 분포. (A) 켈로이드 샘플의 21,488개 세포로 구성된 21개 세포 클러스터를 보여주는 UMAP 플롯. (B) 원본 연구에서 보고된 주석을 기반으로 한 세포 유형 주석. (C) 다양한 세포 유형 전반에 걸친 헴 대사 관련 진단 바이오마커의 발현을 보여주는 피처 플롯. (D) 다양한 세포 유형 전반에 걸쳐 헴 대사 관련 진단 바이오마커를 발현하는 세포의 평균 발현 수준과 백분율을 보여주는 버블 플롯. 약어: UMAP = uniform manifold approximation and projection. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

후보 진단 바이오마커의 식별 및 상호작용 네트워크 분석

후보 진단 바이오마커의 기저에 있는 조절 메커니즘을 탐구하기 위해 miRNA-mRNA 조절 네트워크를 구축하였다. 예측된 상호작용의 신뢰도를 높이기 위해, 후보 바이오마커를 표적으로 하는 중첩된 miRNA를 식별하였다. 6개의 진단 바이오마커와 상호작용하는 총 282개의 miRNA를 얻었으며, 그 결과로 생성된 조절 네트워크는 그림 5에 나타내었다. 특히 hsa-miR-34a-5p, hsa-let-7a-5p, hsa-let-7d-5p, hsa-let-7e-5p 및 hsa-miR-26b-5p는 6개의 후보 바이오마커 모두를 동시에 조절하는 것으로 예측되었다.

figure-results-5
그림 5: 헴 대사 관련 진단 바이오마커의 miRNA 조절 네트워크.이 네트워크는 6가지 진단 바이오마커 유전자(FLVCR1, HPX, TMCC2, KEL, XK, EIF2AK1)와 이와 관련된 miRNA 사이의 조절 관계를 보여줍니다. 유전자 노드는 진단 바이오마커를 나타내며, 주변 노드는 miRNA를 나타냅니다. 엣지는 실험적으로 입증된 miRNA-mRNA 상호작용을 나타냅니다. 약어: FLVCR1 = feline leukemia virus subgroup C receptor 1; HPX = hemopexin; TMCC2 = transmembrane and coiled-coil domains 2; KEL = Kell metallo-endopeptidase; XK = X-linked Kx blood group; EIF2AK1 = eukaryotic translation initiation factor 2 alpha kinase 1; miRNA = microRNA; mRNA = messenger RNA. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

FLVCR1 발현의 실험적 검증 및 잠재적 치료 화합물의 분자 도킹 분석

생정보학적 분석 결과를 검증하고 확인된 허브 유전자의 기능적 관련성을 입증하기 위해, PKF와 NHDF에서 FLVCR1의 발현을 실험적으로 평가하였습니다. qRT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석 결과, 켈로이드 섬유아세포에서 FLVCR1이 정상 대조군에 비해 유의미하게 상향 조절되었음이 일관되게 나타났습니다.그림 6A–C, 보충 그림 S1 및 보충 표 S4). 이러한 세포 내 발현 증가는 켈로이드 병인에서 FLVCR1 관련 헴 대사 조절 장애가 관여할 가능성을 뒷받침합니다.

헴 대사 관련 면역 변화에 FLVCR1이 관여할 가능성이 있음을 고려하여, 다음으로 우리는 이 병리적 축을 차단하기 위해 FLVCR1을 직접적으로 표적할 수 있는 잠재적 치료 화합물을 식별하고자 했습니다. 준비된 단백질 구조와 중의약(TCM) 화합물 라이브러리를 사용하여 고속 가상 스크리닝을 수행하였습니다. 도킹 점수가 가장 우수한 20가지 화합물을 선정하여 추가 평가를 진행하였습니다.보충 표 S5일반적으로 결합 에너지가 낮을수록 결합 친화도가 더 강함을 나타내며, -5 kcal/mol 미만의 도킹 에너지는 안정적인 리간드-단백질 상호작용을 나타내는 것으로 간주됩니다. 스크리닝된 화합물 중 (+)-Gallocatechin, (−)-Epicatechin, (−)-Gallocatechin 및 Cyanidin (chloride)이 FLVCR1에 대해 양호한 결합 친화도를 보였습니다. 특히, (+)-Gallocatechin이 가장 강력한 상호작용을 나타냈습니다. FLVCR1 GLU214, ASN245, GLN246 및 GLN471과 4개의 수소 결합을 형성함으로써 안정적인 리간드-단백질 결합 모드를 시사한다(그림 6D–G). 이러한 결과는 (+)-gallocatechin이 다음을 표적으로 하는 기전 기반의 치료적 개입을 위한 유망한 후보 물질임을 강조합니다. FLVCR1.

figure-results-6
그림 6: FLVCR1 발현의 실험적 검증 및 FLVCR1을 표적으로 하는 잠재적 화합물의 분자 도킹. (A) CON 및 켈로이드에서 FLVCR1 단백질 발현을 보여주는 대표적인 western blot 이미지. GAPDH를 로딩 대조군으로 사용하였다. (B) GAPDH로 표준화한 FLVCR1 단백질 수준의 정량 분석. (C) qRT-PCR을 통해 측정한 CON 및 켈로이드 섬유아세포의 FLVCR1 상대적 mRNA 발현 수준. GAPDH를 내부 참조로 사용하였다. (D–G) FLVCR1과 선택된 저분자 화합물 간의 예측된 결합 모드에 대한 3차원 표현: (D) (+)-Gallocatechin. (E) (-)-Epicatechin. (F) (-)-Gallocatechin. (G) Cyanidin (Chloride). 약어: FLVCR1 = feline leukemia virus subgroup C receptor 1; CON, 대조군; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; qRT-PCR, quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; SD, 표준편차. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. 통계적 유의성: ns, P > 0.05; *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; 및 ****, P < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

분자 동역학 시뮬레이션을 통한 FLVCR1–(+)-Gallocatechin 복합체의 안정성 확인

예측된 리간드-단백질 결합 모드의 신뢰성을 검토하기 위해, FLVCR1–(+)-gallocatechin 복합체에 대해 분자 동역학(MD) 시뮬레이션을 수행하였다. 분석은 RMSD, RMSF, 회전 반경(Rg), SASA, 수소 결합 분석 및 MM/GBSA 계산을 통해 복합체가 시간이 지남에 따라 구조적으로 안정적으로 유지되는지, 그리고 리간드 결합이 단백질의 형태적 거동을 변화시키는지에 중점을 두었다. RMSD 분석(그림 7A) 결과, apo 단백질과 리간드 결합 복합체 모두 처음 20 ns 동안 초기 변동을 보인 후 점진적으로 안정화되었으며, 이는 시뮬레이션 동안 시스템이 평형 상태에 도달했음을 나타낸다. 평형 도달 후, FLVCR1–(+)-Gallocatechin 복합체의 RMSD 값은 0.2 nm 미만으로 유지되었으며, 이는 리간드 결합이 FLVCR1의 구조적 안정성을 유지하는 데 기여했음을 시사한다. RMSF 분석(그림 7B)에서는 대부분의 잔기가 시뮬레이션 전반에 걸쳐 제한적인 변동을 보여 전반적인 단백질 무결성이 유지됨을 입증하였으며, 몇몇 유연한 영역은 리간드 수용에 관여하는 루프 영역일 가능성이 있음을 보여주었다. 또한, 안정적인 Rg 및 SASA 프로파일(그림 7C,D)은 복합체가 조밀한 형태를 유지하였으며, 뚜렷한 구조적 확장이나 용매 노출의 변화가 없었음을 나타냈다. 수소 결합 분석(그림 7E) 결과, FLVCR1–(+)-Gallocatechin 복합체는 시뮬레이션 동안 약 3–4개의 수소 결합을 형성하며 지속적인 분자 간 상호작용을 유지하였으며, 이는 리간드-단백질 결합의 안정성을 뒷받침한다. MM/GBSA 분석 결과, FLVCR1–(+)-Gallocatechin 복합체는 유리한 결합 자유 에너지(ΔGtotal = −34.87 ± 4.13 kcal/mol)를 나타냈다(부록 표 S6). 에너지 분해 분석 결과, 극성 용매화 에너지(ΔGsolvation = 25.55 ± 0.74 kcal/mol)의 불리한 기여에도 불구하고 반데르발스 상호작용(ΔVDWAALS = −46.34 ± 2.16 kcal/mol)과 정전기적 상호작용(ΔEelec = −14.09 ± 3.45 kcal/mol)이 결합에 주요하게 기여하는 유리한 요인임을 확인하였다(부록 표 S6). 종합적으로, 이러한 MD 시뮬레이션 결과는 (+)-Gallocatechin이 FLVCR1과 안정적인 복합체를 형성함을 입증하였으며, 도킹으로 예측된 결합 모드의 신뢰성을 추가로 뒷받침하였다.

figure-results-7
그림 7: FLVCR1–(+)-Gallocatechin 복합체의 분자 동역학 시뮬레이션 분석. (A) 100 ns 분자 동역학 시뮬레이션 동안의 apo FLVCR1 및 FLVCR1–(+)-Gallocatechin 복합체의 RMSD 프로파일. (B) 시뮬레이션 동안 FLVCR1의 잔기 수준 변동을 나타내는 RMSF 프로파일. (C) FLVCR1–(+)-Gallocatechin 복합체의 용매 접근 가능 표면적 변화를 나타내는 SASA 프로파일. (D) 시뮬레이션 동안 FLVCR1–(+)-Gallocatechin 복합체의 콤팩트함을 평가한 Rg 프로파일. (E) 시뮬레이션 전반에 걸쳐 FLVCR1과 (+)-Gallocatechin 사이의 동적인 분자 간 상호작용을 보여주는 수소 결합 분석. 약어: FLVCR1 = feline leukemia virus subgroup C receptor 1; RMSD = root mean square deviation; RMSF = root mean square fluctuation; SASA = solvent-accessible surface area; Rg = radius of gyration. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

데이터 가용성:

본 연구에서 분석된 공개 전사체 데이터세트는 Gene Expression Omnibus (GEO)에서 등록 번호 GSE44270, GSE7890 및 GSE163973을 통해 이용할 수 있습니다. qRT-PCR 측정값, 원본 western blot 이미지 및 western blot 정량 데이터를 포함하여 본 연구에서 생성된 실험적 검증의 기초가 되는 소스 데이터는 부록 그림 S1, 부록 표 S1, 부록 표 S2, 부록 표 S3 및 부록 표 S4로 제공됩니다. 분자 도킹 결과와 MM/GBSA 결합 자유 에너지 데이터 또한 부록 표 S5 및 부록 표 S6에 제공되어 있습니다.

보충 그림 S1: 웨스턴 블로팅 원본 데이터.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: 헴 대사 관련 유전자.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S2: 선택된 유전자의 프라이머 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S3: 켈로이드의 잠재적 진단 바이오마커 식별을 위한 머신러닝 접근법이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S4: FLVCR1 발현의 실험적 검증을 뒷받침하는 원시 데이터.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

부록 표 S5: FLVCR1과의 분자 도킹을 통해 확인된 상위 20가지 후보 화합물.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S6: FLVCR1–(+)-Gallocatechin 복합체의 MM/GBSA 결합 자유 에너지 분석.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 연구는 켈로이드 형성 과정에서 조절 장애가 일어난 헴(heme) 대사, FLVCR1 발현, 그리고 면역 미세환경 변화 사이의 잠재적 연관성을 규명합니다. 벌크 및 단일 세포 전사체 분석을 통합함으로써, 우리는 FLVCR1이 헴 수출 결핍과 병리적 면역 재프로그래밍을 연결하는 분자적 결절(molecular nexus)임을 입증하였으며, 이를 통해 켈로이드를 최근 부상하고 있는 "대사-섬유화(metabo-fibrotic)" 질환의 범주에 포함시켰습니다23,24,25. FLVCR1의 잠재적 중요성은 다각적인 분석 단계의 수렴된 증거들에 의해 뒷받침됩니다. 벌크 전사체 분석 결과, 켈로이드 조직에서 FLVCR1이 유의하게 상향 조절되었으며 강력한 진단 능력을 갖춘 것으로 나타났습니다. 한편, 단일 세포 해상도 매핑을 통해 해당 발현이 주로 내피세포와 멜라닌 세포에 국한되어 있음을 확인하였는데, 이 두 세포 유형은 각각 비정상적인 혈관 신생과 과색소 침착을 통해 켈로이드 병인에 결정적으로 관여하는 세포들입니다26,27. 가장 주목할 만한 점은, FLVCR1 발현이 여포성 헬퍼 T(Tfh) 세포와 강한 음의 상관관계를 보였다는 것입니다. Tfh 세포는 섬유화 미세환경에서 Th2 편향적 면역 반응과 콜라겐 침착을 촉진하는 림프구 하위 집합으로 점점 더 중요하게 인식되고 있습니다28. 이전 연구들은 FLVCR1 매개 헴 수출이 수지상 세포의 성숙 및 항원 제시에 관여함을 보여주었으며29, 이는 FLVCR1 관련 헴 항상성과 면역 조절 사이의 잠재적 연결 고리를 시사합니다. 따라서 관찰된 FLVCR1의 상향 조절과 Tfh 세포 침윤과의 음의 상관관계는 면역 항상성의 변화를 반영하는 것일 수 있으며, 여기에는 IL-4 및 IL-13과 같은 Tfh 관련 전섬유화 사이토카인이 잠재적으로 관여할 수 있습니다29,30,31.

또한, FLVCR1 기능 장애로 인한 세포 내 heme 축적은 NLRP3 인플라마좀을 활성화할 가능성이 높으며, 이는 heme이 무균성 염증을 유발하는 손상 관련 분자 패턴(DAMP)으로 작용하는 간 섬유화 과정에서 잘 입증된 메커니즘입니다32,33,34. 이러한 인플라마좀 활성화는 IL-1β/IL-18 방출을 촉진하여 TLR4/NF-κB 신호 전달을 통해 M2 대식세포 분극화를 유도하고, 산화적 스트레스와 섬유아세포 활성화의 자가 지속 루프를 형성하게 됩니다35,36. 종합적으로, 이러한 데이터는 FLVCR1이 켈로이드의 heme 대사-면역 상호작용에 기여하는 잠재적 요인이자 후보 바이오마커임을 뒷받침하지만, 제안된 메커니즘의 연쇄 반응은 직접적인 기능적 검증이 필요합니다. 즉, 세포 내 heme 정체가 먼저 산화적 손상을 유도하고 인플라마좀을 활성화하며, 이는 결과적으로 수지상 세포 기능 장애로 이어져 여포성 헬퍼 T 세포 및 Th2 유형 면역 반응으로의 편향을 촉진합니다. 이러한 면역 편향은 다시 대식세포를 M2 표현형으로 분극화시켜, 최종적으로 섬유아세포 활성화와 섬유화 진행을 초래하게 됩니다.

FLVCR1 단독의 작용을 넘어, 6가지 모든 바이오마커의 시너지적 조절 장애는 여러 조절 노드에 걸친 헴 항상성의 통합적 붕괴를 보여줍니다. 활성화된 수지상 세포와 양의 상관관계를 가지면서 미성숙 서브셋과는 음의 상관관계를 보이는 TMCC2는 헴 스트레스 속에서 면역 능력을 회복하려는 보상 기전을 나타낼 수 있습니다37,38. 켈로이드 섬유아세포와 선세포에서 높게 발현되는 EIF2AK1은 헴 과잉의 직접적인 분자 센서 역할을 하며, eIF2α를 인산화하여 단백질 합성을 전반적으로 억제하는 동시에 스트레스 반응 유전자를 선택적으로 상향 조절합니다39,40,41. 이는 EIF2AK1을 헴 축적을 섬유아세포 표현형 전환으로 번역하는 핵심 가교로 설정하며, 켈로이드 섬유아세포가 왜 세포 사멸에 대해 높은 저항성을 보이고 콜라겐 생성을 과도하게 하는지를 잠재적으로 설명해 줍니다42,43,44. 주요 혈장 헴 스캐빈저인 HPX는 멜라닌 세포에서 제한적인 발현을 보여, 색소가 풍부한 구획 내에서 헴 독성을 완충하려는 세포 자율적인 시도를 시사합니다45,46,47. XK 및 KEL의 동시 조절 장애는 켈로이드 병인에 있어 적혈구 계열의 헴 처리 기전이 관여함을 추가적으로 시사하며, 이는 미세 출혈이 동반된 외상 부위에서 켈로이드가 빈번하게 발생하는 이유를 이해하는 데 흥미로운 시사점을 제공합니다. 이 6가지 유전자를 독립적인 마커로 보기보다, 우리는 이들의 집합적 조절 장애를 헴 구획화의 시스템 전반적인 실패에 대한 증거로 해석하며, 여기서 손상된 수출(FLVCR1), 감지(EIF2AK1), 스캐빈징(HPX) 및 막 수송(XK, KEL)이 수렴되어 섬유화 촉진 및 헴이 풍부한 미세환경을 조성하게 됩니다.

이러한 대사-면역 모델은 설득력 있는 후성유전적 층에 의해 더욱 강화됩니다. 본 연구진은 특정 miRNA(예: let-7 family 및 miR-34a-5p)의 하향 조절이 헴(heme) 대사 관련 경로와 섬유화 경로를 동시에 탈억제할 수 있는 ceRNA 네트워크를 확인하였으나, 이 조절 모델은 추가적인 검증이 필요합니다23. 단일 세포 분석이 제공하는 공간 해상도는 이 과정의 근저에 있는 세포들의 정교한 상호작용을 조명하며, 구조 세포의 대사 기능 장애가 파라크린 헴 신호 전달을 통해 면역 세포가 풍부한 미세환경을 어떻게 능동적으로 조성하는지를 보여줍니다. 이를 통해 우리의 이해는 "벌크 조직" 관점에서 역동적인 세포 생태계 모델로 전환됩니다48,49,50. 혈관 내피세포의 헴 축적은 heme oxygenase-1 유도 및 접착 분자 상향 조절을 통해 혈관 누출과 백혈구 혈관 외 유출을 촉진할 수 있으며, 결과적으로 켈로이드에서 관찰되는 면역 세포가 풍부한 미세환경을 조성할 수 있습니다51,52,53. 동시에 멜라닌 세포에서의 FLVCR1 발현은 켈로이드의 과색소 침착에 대한 임상적 관찰과 일치하며, 이는 색소 형성 경로와 섬유화 경로 사이에 공유되는 대사적 취약성이 존재함을 시사하며, 이는 아마도 산화 스트레스 반응에 의해 매개될 가능성이 있습니다54,55. 이러한 공간적 매핑은 우리의 이해를 "벌크 조직" 관점에서 구조 세포(내피세포, 멜라닌 세포)의 대사 기능 장애가 파라크린 헴 신호 전달을 통해 면역 세포의 행동을 능동적으로 형성하는 세포 생태계 모델로 전환시킵니다.

중개 연구 관점에서, 6가지 바이오마커를 모두 통합한 당사의 노모그램은 거의 완벽한 진단 정확도를 달성했으며, 단일 마커보다 실질적으로 우수한 성능을 보였고 결정 곡선 분석(decision curve analysis)을 통해 명확한 임상적 순이익을 입증했습니다. 더욱 흥미로운 점은, 분자 도킹을 통해 녹차와 전통 중약재에 풍부한 생성 활성 폴리페놀인 (+)-gallocatechin이 GLU-214, ASN-245, GLN-246 및 GLN-471과 안정적인 수소 결합을 형성하는 고친화성 FLVCR1 리간드임을 확인했다는 것입니다. 이러한 발견은 카테킨이 켈로이드 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 억제하고, transforming growth factor-beta 1 분비를 저해하며, 산화 스트레스를 완화한다는 기존의 증거56,57,58를 고려할 때 특히 설득력이 있습니다. 당사는 (+)-gallocatechin이 FLVCR1의 구조를 안정화하여 헴(heme) 수출 능력을 향상시킴으로써, 섬유화의 대사적 트리거를 근본적으로 차단할 수 있다고 가설을 세웠으며, 이는 단순히 하위 단계의 콜라겐 생성을 억제하는 기존 치료법과는 근본적으로 다른 전략입니다. 이러한 유형의 대사적 개입이 켈로이드 재발에 영향을 미칠 수 있는지 여부는 향후 추가적인 실험적 및 임상적 검증이 필요합니다.

물론, 본 연구에도 한계점이 있습니다. 첫째, 분석이 주로 계산 방식에 의존하고 있으며, FLVCR1 발현과 T follicular helper (Tfh) 세포 침윤 사이에서 관찰된 연관성이 직접적인 인과 관계를 입증하는 것은 아닙니다. 면역 조절에서 FLVCR1의 잠재적 역할을 명확히 하기 위해서는 Tfh 세포에 대한 유세포 분석 검증과 켈로이드 섬유아세포에서의 FLVCR1 녹다운 또는 과발현을 포함한 기능 연구, 그리고 섬유아세포-면역 세포 상호작용 또는 조건 배지 분석이 필요합니다. 둘째, 상대적으로 작은 표본 크기로 인해 6개 유전자 시그니처의 추정 성능에 불확실성과 낙관적 편향이 도입되었을 수 있습니다. 내부 검증을 수행하였으나, 진단 성능과 보정(calibration)에 대한 신뢰할 수 있는 평가는 여전히 제한적입니다. 따라서 이 6개 유전자 패널은 더 크고 독립적인 코호트에서 추가 검증이 필요한 탐색적 분자 시그니처로 간주되어야 합니다. 셋째, 환자 간 이질성과 희귀 세포 집단을 더 잘 포착하기 위해 단일 세포 데이터셋의 확장이 필요합니다. 넷째, 바이오마커 발현의 단백질 수준 검증과 면역조직화학염색을 통한 공간적 국소화 확인이 이루어진다면 연구 결과의 임상적 관련성이 더욱 강화될 것입니다. 마지막으로, 분자 도킹 결과는 (+)-gallocatechin과 FLVCR1 사이의 잠재적 결합을 시사하지만, 임상 적용 전에는 in vitro 결합 분석 및 in vivo 효능 연구가 필요합니다. 이러한 한계에도 불구하고, 본 연구 결과는 FLVCR1 관련 헴(heme) 대사와 켈로이드의 면역 변화를 연결하는 다차원적 프레임워크를 제공하며, 향후 연구를 위한 잠재적 분자 바이오마커 및 치료 후보 물질을 제시합니다.

공개 사항

저자들은 선언할 이해관계 충돌이 없습니다.

저자 기여도

Qiuyan Yang은 연구 설계에 기여하였습니다. Jianping Zhang은 데이터 수집에 기여하였습니다. Qiuyan Yang과 Xiaofang Sun은 통계 분석에 기여하였습니다. Qiuyan Yang과 Jing Wang은 도표 작성 및 원고 완성에 기여하였습니다. 모든 저자는 원고의 최종본을 읽고 승인하였습니다.

감사의 글

Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스를 통해 GSE44270, GSE7890 및 GSE163973 데이터세트를 생성하고 공개적으로 공유해주신 연구자분들께 깊은 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AmberTools앰버 프로젝트AmberTools는 분자 시뮬레이션 및 분석을 위한 종합 소프트웨어 패키지입니다. 이는 Amber 분자 역학 패키지의 구성 요소이며, 분자 시스템의 준비, 분석 및 조작을 위한 강력한 도구 모음을 제공합니다. 주요 특징 및 기능: - 시스템 준비: LEaP를 통한 분자 모델 구축, 파라미터 할당 및 토폴로지 생성. - 구조 분석: RMSD 계산, 수소 결합 분석 및 상호작용 탐색. - 에너지 최소화 및 평형화: 복잡한 생체 분자 시스템의 안정화를 위한 도구. - 데이터 처리: Trajectory(궤적) 파일 처리 및 분석을 위한 유틸리티. - 호환성: 다양한 분자 포맷 지원 및 타 소프트웨어와의 연동 가능성. AmberTools는 오픈 소스로 제공되어 전 세계 연구자들이 분자 수준의 생물학 및 화학 연구를 수행하는 데 널리 사용되고 있습니다.버전 22; GAFF 포스 필드를 이용한 리간드 파라미터 생성
항-FLVCR1Proteintech26841-1-AP
Anti-GAPDHProteintech60004-1-Ig
AutoDock Vina스크립스 연구소https://vina.scripps.edu/버전 1.2.3; 분자 도킹 및 리간드 결합 친화도 예측
AutoDockToolsThe Scripps Research Institutehttps://ccsb.scripps.edu/autodocksuite/adt/버전 1.5.6; 분자 도킹을 위한 리간드 및 수용체 준비
BCA 단백질 분석 키트ServicebioG2026
dsDNase가 포함된 qPCR용 cDNA 합성 믹스유니언스크립트qRT-PCR을 위한 역전사
ChemBio3DPerkinElmerhttps://revvitysignals.com/products/research/chemdraw 제품 / 연구 / ChemDraw 화학 구조 그리기 및 분석을 위한 업계 표준 소프트웨어 ChemDraw는 수십 년 동안 화학자와 연구원들이 신뢰해 온 업계 표준 소프트웨어로, 정밀한 화학 구조, 반응식 및 실험 도식의 작성을 지원합니다. 핵심 기능: 구조 및 반응 그리기 직관적인 도구 모음을 사용하여 복잡한 분자 구조와 화학 반응식을 신속하고 정확하게 작성하십시오. 지능형 표기법 및 명명법 구조를 이름으로 변환하거나, 이름을 입력하여 구조를 생성하는 강력한 이름-구조 변환 기능을 활용하십시오. 데이터 통합 및 분석 화학적 성질을 계산하고, 데이터베이스와 통합하며, 출판 가능한 수준의 고해상도 그래픽을 생성하십시오. 주요 장점: 정밀성: IUPAC 표준을 준수하는 정확한 명명법과 구조 표기법을 제공합니다. 효율성: 반복적인 작업을 줄여주는 단축키와 템플릿을 통해 연구 시간을 단축합니다. 호환성: 다양한 화학 파일 형식과 호환되어 데이터 공유 및 협업이 용이합니다. 출판 품질: 저널 제출 기준에 부합하는 전문가 수준의 도식과 레이아웃을 구현합니다. 지금 시작하여 당신의 화학 연구를 시각화하고 가속화하십시오.버전 14.0; 리간드의 3D 구조 최적화 및 에너지 최소화
화학발광 이미징 시스템웨스턴 블롯 밴드 시각화
DoubletDetection 패키지GitHub / JonathanShorhttps://github.com/JonathanShor/DoubletDetectionscRNA-seq 분석에서 예측된 더블렛의 검출 및 제거
ECL 화학발광 기질웨스턴 블롯 신호 검출
태아 송아지 혈청최종 농도 2%; 섬유아세포 배양 배지용 보충제
섬유아세포 성장 배지 2PromoCellC-23020
FLVCR1 및 GAPDH 프라이머보충 표 S2표적 및 참조 유전자의 qRT-PCR 증폭
가우시안Gaussian, Inc.https://gaussian.com/Gaussian 16W; 리간드 파라미터화를 위한 RESP 원자 전하 계산
겔 전기영동 장치SDS-PAGE 단백질 분리
GEOquery 패키지Bioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GEOquery/버전 2.68.0; GEO 데이터베이스로부터의 유전자 발현 및 메타데이터 추출
ggplot2 패키지CRANhttps://cran.r-project.org/package=ggplot2버전 4.0.2; 데이터 시각화
glmnet 패키지CRANhttps://cran.r-project.org/package=glmnet버전 4.1.10; LASSO 특성 선택
GROMACSGROMACS 개발팀https://www.gromacs.org/버전 2022.3; 분자 동역학 시뮬레이션 및 궤적 분석
GS AntiQ qPCR SYBR Green Fast Mix (Universal)유전자와SQ410
GSE163973GEO 데이터베이스**GEO 데이터셋** **제목:** 코로나19 환자의 혈청에서 발견되는 혈소판 활성화 및 보체 활성화의 체계적 분석 **요약:** 본 연구에서는 중증 코로나19 환자의 혈청에서 혈소판 및 보체 활성화를 평가하기 위해 고해상도 단백질 분석을 수행하였습니다. 우리는 중증 및 비중증 환자군을 비교하여 질병의 중증도와 관련된 생체 표지자를 식별하였습니다. **샘플 정보:** - **샘플 수:** 40 - **생물체:** *Homo sapiens* - **샘플 유형:** 혈청 - **실험 설계:** 환자군(중증 vs 비중증) 간의 비교 분석 **플랫폼:** - **플랫폼 ID:** GPL (해당 플랫폼 상세 정보 참조) - **기술:** 단백질 분석/항체 기반 분석 **키워드:** 코로나19, SARS-CoV-2, 혈소판 활성화, 보체 체계, 혈청 단백질 분석, 중증도 생체 표지자3개의 켈로이드 시료; 단일 세포 발현 분석
GSE44270GEO 데이터베이스**GEO 데이터셋** **제목:** 인간 유래 유도만능줄기세포(hiPSC) 기반 심근세포의 전사체 분석 **요약:** 본 연구에서는 인간 유도만능줄기세포(hiPSC)로부터 분화된 심근세포의 분자적 특성을 이해하기 위해 전사체 프로파일링을 수행하였습니다. 우리는 다양한 분화 단계에 있는 세포들의 유전자 발현 패턴을 분석하여 심근세포 분화 과정의 핵심 조절 인자와 마커를 식별하였습니다. **요약 정보:** * **GEO 액세션 번호:** GSE44270 * **플랫폼:** GPL570 [HG-U133_Plus_2] * **샘플 수:** 12 * **유기체:** *Homo sapiens* **데이터 유형:** 발현 프로파일 (Expression profiling by array) **핵심어:** 인간 유도만능줄기세포, 심근세포, 전사체 분석, 분화, 마이크로어레이, 심장 발달18개의 켈로이드 및 14개의 정상 샘플; 차등 발현 및 바이오마커 스크리닝
GSE7890GEO 데이터베이스**유전자 발현 옴니버스 (GEO)** **시리즈** **GSE7890: 성인 뇌 조직에서 인간 유전자 발현 프로파일링** **요약** 이 데이터 세트는 성인 인간 뇌의 다양한 부위에서 유전자 발현 패턴을 조사하기 위해 수행되었습니다. 이 연구의 목적은 뇌의 서로 다른 해부학적 영역 간의 전사체 차이를 분석하여 영역 특이적인 유전자 발현을 정의하는 것입니다. **전체 디자인** 다양한 성인 인간 뇌 영역에서 총 RNA를 추출하여 마이크로어레이 분석을 통해 유전자 발현 수준을 측정하였습니다. **샘플** 성인 인간 뇌의 여러 영역에서 수집된 샘플. **플랫폼** **GPL570: Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array** **키워드** 인간, 뇌, 유전자 발현, 전사체, 마이크로어레이, 뇌 영역 특이성10개의 켈로이드 및 9개의 정상 샘플; 진단 바이오마커의 독립적 검증
GSVA 패키지Bioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVA/버전 1.48.3; ssGSEA 기반 면역 세포 침윤 분석
HRP-결합 goat anti-mouse IgGAbcamab97040
HRP-접합 염소 항-토끼 IgGAbcamab97051
가습된 CO₂2 배양기37 °C, 5% CO₂2NHDF 및 PKF 세포의 유지 관리
ImageJ미국 국립보건원https://imagej.nih.gov/ij/웨스턴 블롯 밴드 강도의 정량화
인슐린5 μg/mL 최종 농도; 섬유아세포 배양 배지 보충제
분자 시그니처 데이터베이스 (MSigDB)Broad Institute유전자 세트 농축 분석-분자 시스템 서명 데이터베이스버전 2024.1.Hs; 헴 대사 관련 유전자 세트의 출처
네트워크 분석기NetworkAnalysthttps://www.networkanalyst.ca/버전 3.0; miRNA-mRNA 상호작용 네트워크 구축
정상 인간 진피 섬유아세포ProcellCP-H106
무지방 분유5% 용액; 웨스턴 블롯 분석을 위한 막 블로킹
광학 밀봉 필름 또는 캡qRT-PCR 반응 밀봉
인산완충생리식염수ProcellPB180327
PDB ID: 8UBZRCSB PDB구조 ID: 8UBZ 구조 이름: 인간 CDC42-GTP-α-PIDDosome 복합체 분류: 단백질 분자: - 분자 1: CDC42 (인간) - 분자 2: PIDD1 (인간) - 분자 3: RAIDD (인간) - 분자 4: CASPASE-2 (인간) 방법: X-선 결정학 해상도: 2.50 Å R-값: 0.215 R-free 값: 0.247 결정 체계: 정방정계 (Tetragonal) 공간군: P 42 1 2인간 FLVCR1 구조; 구조 기반 가상 스크리닝을 위한 FLVCR1 단백질 구조의 출처
인산가수분해효소 억제제단백질 용해 버퍼용 보충제
PKFProcellGCP-H235
PMSFServicebioG2008-1ML
pROC 패키지CRANhttps://cran.r-project.org/package=pROC버전 1.19.0.1; ROC 곡선 및 AUC 분석
단백질 분해 효소 억제제 칵테일Roche4693124001
단백질 전이 장치PVDF 막으로의 단백질 전사
PVDF 막MilliporeIPVH08100
PyMOL슈뢰더ödinger, LLChttps://pymol.org/버전 2.6.1; 단백질-리간드 도킹 포즈 및 분자 상호작용의 시각화 및 분석
qRT-PCR 플레이트 또는 튜브qRT-PCR 반응 설정
RR Foundation for Statistical Computinghttps://www.r-project.org/버전 4.3.1; 통계 및 생물정보학 분석
randomForest 패키지CRANhttps://cran.r-project.org/package=randomForest버전 4.7.1.2; 랜덤 포레스트 특성 선택
REACTOME_헴_생합성; REACTOME_헴_분해; WIKIPATHWAYS_헴_생합성; REACTOME_혈장_내_헴_청소; HALLMARK_헴_대사분자 시그니처 데이터베이스 (MSigDB)https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb버전 2024.1.Hs; 병합 후 283개의 고유 유전자; 헴 대사 관련 유전자의 정의
실시간 PCR 시스템qRT-PCR 증폭 및 검출
재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자최종 농도 1 ng/mL; 섬유아세포 배양 배지용 보충제
RIPA 완충액ServicebioG2002
rms 패키지CRANhttps://cran.r-project.org/package=rms버전 6.7.1; 노모그램 구축
SDS-PAGE 시약 또는 프리캐스트 겔SDS-PAGE를 이용한 단백질 분리
Seurat 패키지CRANhttps://satijalab.org/seurat/버전 5.4.0; scRNA-seq 전처리, 클러스터링 및 시각화
TarBaseDIANA 도구https://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/버전 9.0; 실험적으로 입증된 miRNA-mRNA 상호작용의 출처
Total RNA Kit II오메가R6934-01
전통 중의학 활성 화합물 라이브러리가상 스크리닝을 위한 후보 화합물 공급원
Tween/Tris 완충 식염수블로킹 버퍼 준비 및 멤브레인 세척
qPCR용 UnionScript 제1가닥 cDNA 합성 믹스 (dsDNase 포함)유전자와SR511

참고문헌

  1. Dirand Z, et al. Macrophage phenotype is determinant for fibrosis development in keloid disease. Matrix Biol. 2024;128:79-92.
  2. Fang X, et al. Hypertrophic scarring and keloids: epidemiology, molecular pathogenesis, and therapeutic interventions. MedComm (2020). 2025;6(10):e70381.
  3. Adler R, et al. Pentoxifylline and long-term risk of keloid formation: a real-world 10-year outcomes study using TriNetX. J Am Acad Dermatol. 2026;94(5):1561-3.
  4. Banerjee P, et al. Anti-fibrotic properties of a decellularized extracellular matrix scaffold from porcine small intestinal submucosa in normal human and keloid fibroblasts. Int J Mol Sci. 2025;26(24):11764.
  5. Chang YH, McGrath JA, Hsu CK. Regression of extensive keloids during imatinib therapy for gastrointestinal stromal tumor. JAMA Dermatol. 2025;161(12):1293-4.
  6. Wang QR, et al. CCL17 drives fibroblast activation in the progression of pulmonary fibrosis by enhancing the TGF-β/Smad signaling. Biochem Pharmacol. 2023;210:115475.
  7. Higuchi Y, et al. Cavin-2 promotes fibroblast-to-myofibroblast trans-differentiation and aggravates cardiac fibrosis. ESC Heart Fail. 2024;11(1):167-78.
  8. Zhang H, et al. Plasma apolipoprotein E protein attenuates pulmonary fibrosis through LRP1 and PLAU dual receptor-mediated TGF-β/Smad inhibition. J Adv Res. 2025. doi:10.1016/j.jare.2025.12.045.
  9. Chen Q, et al. Immune imbalance drives keloid pathogenesis: emerging targets for precision immunotherapy. Adv Wound Care (New Rochelle). 2026:21621918261417702.
  10. Deng CC, et al. Single-cell RNA-seq reveals immune cell heterogeneity and increased Th17 cells in human fibrotic skin diseases. Front Immunol. 2024;15:1522076.
  11. Wang Q, et al. Weighted gene co-expression network analysis and machine learning identified the lipid metabolism-related gene LGMN as a novel biomarker for keloid. Exp Dermatol. 2024;33(1):e14974.
  12. Zhang W, et al. New insights into keloid pathogenesis: biomarker potential for CDK7 and DDB2. Front Cell Dev Biol. 2025;13:1718189.
  13. Li W, et al. Altered arginine metabolism affects proliferation and radiosensitivity of keloids. Exp Dermatol. 2025;34(3):e70077.
  14. Jiang J, et al. Ambient fine particulate matter induces cardiac fibrosis through triggering ferroptosis by heme degradation induced-iron overload. Ecotoxicol Environ Saf. 2025;297:118227.
  15. Lin W, et al. Heme oxygenase-1 overexpression activates the IRF1/DRP1 signaling pathway to promote M2-type polarization of spinal cord microglia. Drug Dev Res. 2024;85(8):e70033.
  16. Knez J, Kovačič B, Goropevšek A. The role of regulatory T-cells in the development of endometriosis. Hum Reprod. 2024;39(7):1367-80.
  17. Voltarelli VA, et al. Heme: the lord of the iron ring. Antioxidants (Basel). 2023;12(5):1074.
  18. Wilks A, Egoshi R. Heme trafficking and the importance of handling nature's most versatile cofactor. Chem Rev. 2025;125(23):11358-78.
  19. Bertino F, et al. Dysregulation of FLVCR1a-dependent mitochondrial calcium handling in neural progenitors causes congenital hydrocephalus. Cell Rep Med. 2024;5(7):101647.
  20. Kumar A, et al. Iron regulates the quiescence of naive CD4 T cells by controlling mitochondria and cellular metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(17):e2318420121.
  21. Jiang H, et al. Gut microbiota dysbiosis in diabetic nephropathy: mechanisms and therapeutic targeting via the gut-kidney axis. Front Endocrinol (Lausanne). 2025;16:1661037.
  22. Charoentong P, et al. Pan-cancer immunogenomic analyses reveal genotype-immunophenotype relationships and predictors of response to checkpoint blockade. Cell Rep. 2017;18(1):248-62.
  23. Chen Y, et al. 5-ALA photodynamic metabolite-powered zero-waste ferroptosis amplifier for enhanced hypertrophic scar therapy. Nat Commun. 2025;16(1):8321.
  24. Li X, et al. Hypericin-mediated photodynamic therapy promotes apoptosis and inhibits fibrosis by inducing HMOX1-mediated ferroptosis in hypertrophic scar fibroblasts. J Photochem Photobiol B. 2025;273:113303.
  25. Chen Y, et al. Functional transdermal nanoethosomes enhance photodynamic therapy of hypertrophic scars via self-generating oxygen. ACS Appl Mater Interfaces. 2021;13(7):7955-65.
  26. Oh S, et al. Revealing the pathogenesis of keloids based on the status: active vs inactive. Exp Dermatol. 2024;33(5):e15088.
  27. Zhao S, et al. New anti-fibrotic strategies for keloids: insights from single-cell multi-omics. Cell Prolif. 2025;58(6):e13818.
  28. Yasujima T, et al. The role of FLVCR1 and FLVCR2 in choline transport in the Caco-2 intestinal epithelial cell model and rat small intestine. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2025;1871(6):167883.
  29. Zhang M, Chen H, Qian H, Wang C. Characterization of the skin keloid microenvironment. Cell Commun Signal. 2023;21(1):207.
  30. Wang Y, et al. FoxC1 activates Notch3 signaling to promote the inflammatory phenotype of keloid fibroblasts and aggravates keloid. Exp Cell Res. 2025;444(2):114402.
  31. Zhang J, et al. ERG transcriptionally activates SFRP1 to promote apoptosis of keloid fibroblasts and inhibit epithelial-mesenchymal transition and fibrosis through the Wnt3a/β-catenin pathway. Arch Dermatol Res. 2025;317(1):467.
  32. Ramos-Tovar E, Muriel P. NLRP3 inflammasome in hepatic diseases: a pharmacological target. Biochem Pharmacol. 2023;217:115861.
  33. Brahadeeswaran S, et al. NLRP3: a new therapeutic target in alcoholic liver disease. Front Immunol. 2023;14:1215333.
  34. Xiao Y, et al. STING mediates hepatocyte pyroptosis in liver fibrosis by epigenetically activating the NLRP3 inflammasome. Redox Biol. 2023;62:102691.
  35. Paolucci T, et al. Quantum molecular resonance inhibits NLRP3 inflammasome/nitrosative stress and promotes M1 to M2 macrophage polarization: potential therapeutic effect in osteoarthritis model in vitro. Antioxidants (Basel). 2023;12(7):1358.
  36. Wei J, et al. FERM domain containing kindlin 1 knockdown attenuates inflammation induced by intracerebral hemorrhage in rats via NLR family pyrin domain containing 3/nuclear factor kappa B pathway. Exp Anim. 2023;72(3):324-35.
  37. Tao L, Zhou Y, Wu L, Liu J. Comprehensive analysis of sialylation-related genes and construct the prognostic model in sepsis. Sci Rep. 2024;14(1):18110.
  38. Sun Q, et al. Identification of hub genes and key pathways associated with sepsis progression using weighted gene co-expression network analysis and machine learning. Int J Mol Sci. 2025;26(9):4433.
  39. Chen JJ. HRI protein kinase in cytoplasmic heme sensing and mitochondrial stress response: relevance to hematological and mitochondrial diseases. J Biol Chem. 2025;301(5):108494.
  40. Chakrabarty Y, Yang Z, Chen H, Chan DC. The HRI branch of the integrated stress response selectively triggers mitophagy. Mol Cell. 2024;84(6):1090-100.e6.
  41. Bora P, et al. Drug repurposing screen identifies an HRI activating compound that promotes adaptive mitochondrial remodeling in MFN2-deficient cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2025;122(48):e2517552122.
  42. Zhang C, et al. CaMKII suppresses proteotoxicity by phosphorylating BAG3 in response to proteasomal dysfunction. EMBO Rep. 2024;25(10):4488-514.
  43. Chaabani H, et al. Trifloxystrobin induces oxidative stress-dependent activation of the OMA1-DELE1-HRI integrated stress response leading to apoptosis in human neuroblastoma cells. Environ Pollut. 2026;390:127562.
  44. Das R, et al. CMT2A-linked MFN2 mutation, T206I promotes mitochondrial hyperfusion and predisposes cells towards mitophagy. Mitochondrion. 2024;74:101825.
  45. De Simone G, et al. Heme scavenging and delivery: the role of human serum albumin. Biomolecules. 2023;13(3):575.
  46. Turilli-Ghisolfi ES, Lualdi M, Fasano M. Ligand-based regulation of dynamics and reactivity of hemoproteins. Biomolecules. 2023;13(4):683.
  47. Zhang P, et al. Risk factors and prediction models for cardiotoxicity induced by anthracyclines in malignant chemotherapy. Cancer Chemother Pharmacol. 2025;95(1):73.
  48. Petrillo S, et al. Endothelial cells require functional FLVCR1a during developmental and adult angiogenesis. Angiogenesis. 2023;26(3):365-84.
  49. Fiorito V, Tolosano E. Unearthing FLVCR1a: tracing the path to a vital cellular transporter. Cell Mol Life Sci. 2024;81(1):166.
  50. Manco M, et al. FLVCR1a controls cellular cholesterol levels through the regulation of heme biosynthesis and tricarboxylic acid cycle flux in endothelial cells. Biomolecules. 2024;14(2):149.
  51. Shi X, et al. Increased melanin induces aberrant keratinocyte-melanocyte-basal-fibroblast cell communication and fibrogenesis by inducing iron overload and ferroptosis resistance in keloids. Cell Commun Signal. 2025;23(1):141.
  52. Khunger N, Dash A. Impact of air pollution on skin pigmentation: mechanisms and protective strategies. Int J Dermatol. 2025;64(10):1788-801.
  53. Ahuja K, Raju S, Dahiya S, Motiani RK. ROS and calcium signaling are critical determinant of skin pigmentation. Cell Calcium. 2025;125:102987.
  54. Dutta A, Chakraborty S, Roy A, Mittal A, et al. Tissue fibrosis in cardiorenal syndrome: crosstalk between heart and kidneys. Nephrol Dial Transplant. 2025;40(7):1273-83.
  55. Noah AA, et al. Reversal of fibrosis and portal hypertension by empagliflozin treatment of CCl4-induced liver fibrosis: emphasis on gal-1/NRP-1/TGF-β and gal-1/NRP-1/VEGFR2 pathways. Eur J Pharmacol. 2023;959:176066.
  56. Murakami T, Shigeki S. Pharmacotherapy for keloids and hypertrophic scars. Int J Mol Sci. 2024;25(9):4674.
  57. Jin J, Zheng Z. Gut microbiota-derived metabolites in keloid and hypertrophic scarring. Front Microbiol. 2025;16:1644758.
  58. Aubert A, et al. Potential implications of granzyme B in keloids and hypertrophic scars through extracellular matrix remodeling and latent TGF-β activation. Front Immunol. 2024;15:1484462.

재인쇄 및 허가

태그

켈로이드 바이오마커FLVCR1RNA 시퀀싱면역 침윤단일 세포 매핑miRNA 네트워크분자 도킹
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.