방법 논문

MODS의 결핵의 진단 방법과 내성 결핵을 multidrug

DOI:

10.3791/845

⸱

2008년 8월 11일

 ,  ,  , 
1The Warren Alpert Medical School of Brown University, 2Laboratorio de Investigacion de Enfermedades Infecciosas, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 3Department of International Health, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 4Wellcome Trust Centre for Clinical Tropical Medicine, Imperial College London

이 논문에서

요약

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현미경 - 관찰 약물 자화율 (MODS) 분석은 결핵의 고성능 감지 (TB)과 multidrug 모성 결핵 (MDRTB)에 대한 낮은 비용, 낮은 기술 도구입니다. 이 동영상은 MODS 액체 미디어 문화 방법을 설명합니다.

초록

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활성 폐 결핵 환자 (TB)는 환자를 치료하고 새로운 감염을 예방 모두에 필수적인 활성 TB를 진단하고, 매년 10-15 다른 사람을 감염. 또한, 강한 결핵 (MDRTB)를 multidrug의 출현은 약제 내성의 검색이 약물 모성 변종의 확산을 막을 필요가있다는 것을 의미합니다. 현미경 - 관찰 약물 자화율 (MODS) 분석 결핵 및 MDRTB의 고성능 감지를위한 저비용, 낮은 기술 도구입니다. mycobacterium 결핵 (MTB)는 미세한 MTB의 성장은 고체 미디어 콜로니의 매크로 모양을 기다리고 이전 액체 미디어 감지하고, 수) 고체 미디어 2 이상의 액체 매체에서 빠르게 성장 1) : MODS 분석은 세 원칙을 기반으로합니다 그 성장은 subculture가 수행의 필요성을 obviating, 그것이 마약 isoniazid와 rifampicin이 MDRTB 동시에 직접 감지 수 있도록 MODS 분석에 통합할 수있는 비정형 mycobacteria이나 곰팡이 또는 세균 오염 3)에서 구분할 수 있도록, MTB의 특징입니다 간접 약물 자화율 시험. 경쟁 현재 진단은 가래 세포진 검사와 함께 낮은 감도, 고체 미디어 문화, 기존의 액체 미디어 문화 방식과 prohibitively 높은 비용, MDRTB를 탐지하기 위해 간접 약물 자화율 테스트 subculture을 필요로 진단을 때까지 긴 지연에 의해 방해하고 있습니다. 반면, 비 - 독점 MODS 방법은, 결핵 및 MDRTB에 대한 높은 감도를 가진 상대적으로 급속한 문화 방식입니다 MDRTB 동시 약물 자화율 시험을 제공하고, 결핵에 대한 테스트를 위해 단지 달러 이하 3 자원 제한 설정에 액세스할 수 있으며 MDRTB.

프로토콜

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  1. 재고 솔루션을 준비
    1. 인산 버퍼 주식
      1. 인산 칼륨 일염기의 솔루션 950ml (1000ml 증류수에 녹아있는 인산 칼륨 일염기의의 9.07g)과 볶음과 함께 나트륨 이염 솔루션의 9​​50ml를 (1000ml 증류수에 녹아있는 인산 나트륨의 이염의 9.47g) 혼합, 조정 각 솔루션의 뒤로 50ml 유지 산도 필요한 경우
      2. 6.8 ± 0.2 산도를 조정 : 산도 마련에 추가 인산 나트륨 이염 솔루션, 낮은 산도로 인산 칼륨 일염기의 솔루션을 추가
      3. 121-124에서 압력솥 ° C 15 분 소독하기
      4. 플레이트 48 시간 37 페트리 접시와 부화에 영양소 한천 배지에 인산 버퍼 용액 ° C의 100μl 나누어지는가 불임을 확인하기
      5. 2-8에서 냉장고에 보관 ° C에 1 개월

        참고 : 각 가래 샘플은 인산 버퍼 용액 10ml을 필요로
    2. 오염 제거 주식
      1. 동일한 수산화 나트륨 솔루션의 볼륨 (200ml 멸균 증류수에 녹아 수산화 나트륨의 8.0g)과 나트륨 구연 산염 솔루션 (200ml 멸균 증류수에 소주 나트륨 구연 산염의 5.8g) 결합
      2. 15 분 동안 121-124 ° C에서 믹스 앤 압력솥
      3. 2-8에서 냉장고에 보관 ° C에 1 개월

        참고 : 각 가래 샘플은 방사능 제거 주식 ​​2ml 필요
    3. 문화 미디어 주식
      1. 멸균 증류수의 900ml에 글리세린과 7H9 중간 가루 casitone과 5.9g의 1.25g의 3.1ml 추가, 지속적인 교반과 혼합 완전히 해산까지
      2. 15 분 동안 121-124 ° C에서 압력솥
      3. 쿨 및 항생 솔루션과 내부 통제의 준비를위한 무균 샘플 준비 16X 100mm 유리 튜브 및 10.8ml aliquots에 4.5ml aliquots에 멸균 매체를 나누어
      4. ° C 48 시간 동안 불임을 (탁​​도의 부족) 확인하기 위해 37 알을 품다
      5. 2-8 ° 모자와 C의 저장소가 긴밀하게 1 개월에 폐쇄

        참고 : 각 가래 샘플 7H9 매체 중 하나가 포함된 튜브 4.5ml 필요
    4. 항생제 재고 솔루션
      1. A. Isoniazid 주식 (8 MG / ML)
        1. 20 MG는 2.5ml 멸균 증류수에 완전히 용해 isoniazid
        2. 수성 용매에 대한 0.2μm 주사기 필터와 필터
        3. 최대 6 개월까지 -20 ° C에서 살균 마이크로 원심 분리 튜브에 20μl aliquots에 저장

          참고 : 각 저장 20μl 나누어지는가 최대 100 개의 샘플 (소모 포함)에 대한 충분
      2. B. Rifampicin 주식 (8 MG / ML)
      1. 1.25ml DMSO 완전히 20mg rifampicin을 풀다
      2. 1.25ml 무균 증류수와 혼합 추가
      3. 유기 용매에 대한 0.2μm 주사기 필터와 필터
      4. 최대 6 개월까지 -20 ° C에서 살균 microcentrifuge 튜브에 20μl aliquots에 저장

        참고 : 각 저장 20μl 나누어지는가 최대 100 개의 샘플 (소모 포함)에 대한 충분
  2. 작업 솔루션을 준비
    1. 오염 제거 작업 솔루션
      1. 필요한 오염 제거 솔루션의 모든 20ml에 NALC 결정을 0.1g을 풀다

        참고 : 각 예제는 오염 제거 솔루션 2ml 요구

        참고 : NALC은 시간이 경과함에 따라 mucolytic 활동을 잃는 등 24 시간 후에 사용하지 않는 남아있는 NaOH - NALC의 오염 제거 솔루션을 무시
    2. 문화 미디어 작업 솔루션
      1. 아웃 설정 :
        1. 모든 가래 샘플 7H9 중간 1 튜브 처리, 플러스마다 접시 하나 추가 튜브 (부정적인 제어 열)으로
        2. 긍정적인 컨트롤 7H9 중간 2 튜브 (3 monoresistant 종자를 사용하는 경우)
        3. 항생제 솔루션 준비 10.8ml 7H9과 1-2 튜브
      2. 각 샘플 튜브 7H9의 4.5ml을 0.5ml OADC 추가
      3. 10.8ml 7H9와 튜브에 1.2ml OADC 추가
      4. (이들은 PANTA 필요하지 않습니다) 항생제 솔루션 준비에 사용되는 12ml 7H9 - OADC로 (S) 5ml 긍정적인 컨트롤 7H9 - OADC하고, 튜브 2 튜브를 따로 설정
      5. Reconstitute의 PANTA 각 샘플 튜브와 부정적인 제어 튜브 (7H9 - OADC - PANTA : 전체 볼륨 = 5.1ml)을 0.1ml 추가

        참고 : PANTA (7H9 - OADC - PANTA)와 완전한 매체가 가래 샘플 및 부정적인 제어에 사용되며 긍정적인 컨트롤과 항생 솔루션 준비 PANTA없이 7H9 - OADC 사용
    3. 항생제 작업 솔루션
      1. 1. 사용하지 않는 24 - 잘 판에 항생제 작업 솔루션을 제작하는 단계에 대한 그림 1을 참조

        참고 : 정확한 자화율 결과, 최종 항생제 농도가 중요합니다. 다음 절차는 리터에 적합합니다aboratories는 micropipettes 갖춘. micropipettes를 사용할 수없는 경우, 투베르쿨린 주사기는 modsperu.org에서 가이드 부록 3 사용자에 설명되어 dilutions의 다른 시리즈와 함께 사용할 수 있습니다

        참고 :하지 마십시오 다시 동결 또는 마약 관련 활동은 유실될 수 있으므로 항생제 작업 또는 주식 솔루션을 다시 사용하는 처리 하루 그림 1의 끝 부분에 모두 사용하지 않는 항생제 솔루션을 폐기하십시오.. (modsperu.org에서 사용자 설명서에서) 항생제 작업 솔루션을 만들기
  3. 가래 샘플 및 플레이트 준비
    1. 오염을 제거하는 것
      1. 15ml 원심 튜브에 가래 샘플의 장소 2ml (면 이하, 인산 버퍼 2ml까지하게, 더 많은 경우에만 2ml를 사용하십시오)
      2. 2ml NaOH - NALC 솔루션 추가
      3. 캡 밀접하게 관 20 초 소용돌이, NaOH - NALC 솔루션 연락처에게 전체 내부 튜브의 표면과 뚜껑을 보장하기 위해 튜브를 반전
      4. 15 분 최소 스탠드하자 - 샘플 특히 점성 경우 몇 분 연장하실 수 있습니다. 치료를 통해 방지를 위해, 20 분 넘지 않아야
      5. 4 번 알칼리 중화 및 오염 제거 프로세스를 종료하고, 반전 튜브로 잘 섞어 인산 버퍼 (산도 6.8)와 14ml로 튜브를 채우
      6. 15 분 동안 3,000그램에서 원심 분리기 (3천g에 도달하기 위해 필요 분당 회전의 방정식에 대한 modsperu.org의 사용 설명서의 부록 2 참조)
      7. 조심스럽게 10 % 나트륨 차아 염소 산염 또는 기타 적합한 살균제와 액체 폐기물 컨테이너에 뜨는를 부어 및 펠릿을 유지
    2. 최종 샘플 정지 및 백업의 준비
      1. 7H9 - OADC - PANTA을 (5.1ml이 들어있는 튜브에서) 사용하면 파스퇴르 피펫으로 원심 튜브에 2ml의 총 볼륨의 샘플 펠렛을 resuspend; 잘 혼합
      2. 백업으로 2-8에서 샘플 서스펜션과 microcentrifuge 관에 저장 ° C의 1ml를 제거
      3. 나머지 7H9 - OADC - PANTA와 튜브 샘플 중지의 두 번째 1ml를 추가, 잘 섞는다. 이것은 도금을위한 준비 최종 샘플 솔루션입니다
    3. 24 잘 플레이트로 샘플 suspensions 배치
      1. 24 잘 플레이트의 칼럼의 4 우물의 각에 최종 샘플 정지 플레이스 900μl
      2. , 열 세를 제외하고 접시의 모든 열 때까지 추가 샘플과 함께 반복 (또는 모든 샘플이 도금까지) 채워집니다
      3. 각 시료 접시의 열 3 4 우물 (부정적인 내부 통제)에 샘플 않고 7H9 - OADC 매체 플레이스 900μl
    4. 샘플로 항생제 추가
      1. 멀티 채널 피펫을 사용하여 조심스럽게 7H9 - OADC 및 항생 작업 솔루션 (항생제 희석의 열 두 그림 1 판 - 참조)와 우물에서 100μl 4 개의 도움말을 기입
      2. 판이나 샘플을 건드리지 않고도 900μl 샘플 솔루션을 열 한 우물에 100μl aliquots 추가
      3. 모든 열이 매체의 추가 100μl (약물이없는 우물) 또는 (대조군 열 세 포함) 항생제 솔루션을받은 때까지 반복
      4. sealable polythene (애) 가방 및 인감 년에 덮개 및 장소 접시를 닫습니다 (가방이 포인트 이후 다시 오픈되지 않습니다)
      5. 37 ° C (CO 2 농축이 필요하지 않습니다)에 품어
  4. 품질 관리
    1. 부정적인 통제는 각 접시에 실행됩니다. 대조군 열에있는 우물의 어떤 성장의 존재가 교차 오염, 따라서 전체 접시가 폐기되어야하고 샘플을 다시 도금을 나타냅니다.
    2. 양성 컨트롤이 하루의 끝에 별도의 접시에 실행됩니다. 하나는 완벽하게 약물 민감한 변형이 열이 다른 열에 실행 INH와 RIF에 스트레인 방지에서 실행됩니다. MDR 스트레인 실행에 대한 우려, INH monoresistant 변형 모두와 RIF monoresistant 변종이 감염될와 MDR 긴장의 장소에서 실행할 수있다면. 모든 긍정적인 컨트롤하는 미디어 지원 성장을 증명하기 위해 약물없는 우물 성장이 있어야합니다. 약물 농도가 올바른지 입증하려면 민감한 긴장은 INH RIF이나 우물에서 성장하지 말아야하지만, MDR 스트레인은 ​​INH와 RIF 우물도 성장 성장해야합니다.
  5. 플레이트 읽기
    1. 로 도금의 하루 "일 0,"판 읽기 5 일에 시작하고, 부정적인 경우에는 주 5 독서는 일 14 다음 일 15 매 2~3일 때까지 (또는 작업 부하에 따라 대체 일간) 매일 이루어집니다 -21. 접시가에 대한 검사 아르10X 목적으로 바뀌 가벼운 현미경
    2. 긍정적인 문화는 마약없는 우물 둘 다에서 두 개 이상의 콜로니 형성 단위 (> 2 CFU)가있는 하나입니다. 조기 mycobacterial 성장은 작은 곡선이나 컴마 나선 은하 (일 5-9) 같다. 콜로니 형성은 일반적으로 "코드"또는 "꼬인 것"(modsperu.org에 이미지 라이브러리를 참조) 진행
    3. 당일 문화 약물 함유 우물이 읽어야 2 약물없는 우물에 긍정적인 것입니다. 약물의 존재의 모든 성장은 약물에 대한 저항력을 나타냅니다.

      참고 : 긍정적인 문화가 마약없는 우물에 기록됩니다> 일주 후 약물이 포함된 웰스의 읽는이 완료되면,이 성장 브레이크를 통해 같은 저항을 대표하지 않을 수도 가끔 볼 수 있습니다
    4. 일 21에 의해 긍정하지 않습니다 샘플은 부정적인 문화로 간주됩니다
    5. mycobacterial 성장 흐려 발생하지 않는 반면, 우물의 흐려은 오염 전면에 자라난의 결과입니다
    6. 21일 완료에 문화가 삭제할 수 있습니다. 문화는 밀폐 봉지에 남아 압력솥 가방에 위치하고 45-60분에 대한 121-124 ° C에서 autoclaved 아르

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토론

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MODS의 분석은 자원 제한 설정 대상으로합니다. 처음으로, MODS은 결핵의 빠른 액체 문화 감지 기능을 제공하고 테스트 당 단지 달러 이하 3 자원 제한 설정에 대한 내성 결핵을 multidrug. MODS이 아닌 독점적인 반복 방법론이며, MODS 커뮤니티는 항상 다른 실험실 만들 수 있었다 것을 개선에 관심을 가지고있다.

액체가 쏟았거나 aerosolized 수 있기 때문에 회귀 우려가 결핵의 액체 미디어 문화의 biosafety입니다. 우리는 간접 약물 자화율 시험은 spillage 및 aerosolization의 수행자 위험과 mycobacteria의 고도로 집중 솔루션의 조작을 포함하기 때문에 MODS 분석 어떤 분석되는 관련 간접 약물 자화율 시험보다 biosafe이라고 믿고, 반대로, MODS는 단순히의 접종 관련 접시에 가래 샘플은, 그 이후 판은 비닐 봉지 안에 봉인하고 다시 오픈되지 않습니다. 이것은 직업 위험 약물 자화율 테스트를하지 않고 가래 샘플을 도금 실험실 노동자 가래 비방 현미경을하고 근로자에​​보다 더 없었다는 보여...

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감사의 글

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우리는 결핵의 성장 시간 저속 비디오 세그먼트에 대한 숀 피츠 워터와 카르멘 Giannina 루나 콜롬보을 인정하고 싶습니다. 우리는 현재의 프로토콜은 대부분 그대로 찍은있는 사용자 가이드를 편집하는 동안 그녀의 철저하고 탁월한 의견에 마티 로퍼 감사 및 공동 제작. 이 비디오의 제작은 NIH / 포가티 국제 센터에 의해 투자되었다 http://www.fic.nih.gov/ 데이비드 AJ 무어 임페리얼 칼리지 런던 대학에서 전염병에 열대 의학 및 리더의 웰컴 트러스트 임상 연구원 (펠로우쉽으로 기여 보너스 번호 078067/Z/05). 마크 F. 브래디는 NIH / 포가티 국제 센터 연구원으로 기여.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
냉장고/ 냉동미리 준비된 육수와 항생제 재고를 저장하는장비
Vortex장비는가래 오염 제거를 돕기 위한
원심분리기장비; 3000 g에 도달할 수 있음; d– 냉장 보관할 필요는 없지만 생물학적 안전성이 있어야 합니다(버킷을 밀봉할 수 있음)인
큐베이터(37°C)배양용
도향광 현미경MODS 플레이트를 판독하기 위한현미경
매체, PBS 및 중고 플레이트를 살균하는오토클레이브
밸런스장비이소니아지드, 리팜피신 및 NALC 무게를 측정하기 위해
Middlebrook 7H9 국물(Difco)시약Fisher ScientificDF0713-17-9500gr/bottle;배양 배지 베이스
Casitone(췌장 분해 카제인)시약Fisher ScientificDF0259‐ 17‐ 9500gr/bottle; 배양 매체 염기
글리세롤 (글리세린) 동결건조시약시그마-알드리치G‐ 33‐ 500500ml/bottle; 배양 배지 베이스
PANTA (항생제 혼합물 동결건조 BD) 시약Fisher ScientificB43451146병/팩; 항생제 배지 보충제
OADC (Middlebrook OADC enrichment BD)시약Fisher ScientificB1188610 x 20ml/pack; 영양 배지 보충제
Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max)시약Sigma-AldrichD-2650100ml/bottle; rifampicin stock 준비
항생제 stock: isoniazid시약Sigma-AldrichI-337750gr/bottle; 직접 감수성 검사
항생제 stocks: rifampicin시약Sigma-AldrichR-35011gr/bottle; 직접 감수성 검사
수산화나트륨 (펠릿)시약Sigma-Aldrich221465500gr / 병; 가래 오염 제거
구연산 나트륨 (트리 나트륨 염 이수화물)시약시그마 - 알드리치S-4641500gr / 병; 가래 오염
제거 N- 아세틸 -L- 시스테인시약시그마 - 알드리치A-725050gr / 병; 가래 오염 제거
인산 칼륨 일 염기성 결정. KH2PO4시약Sigma-AldrichP0662500gr / bottle; 가래 오염 제거
인산나트륨 이염기성, 무수. Na2HPO4시약Sigma-AldrichS0876500gr/bottle; 가래 오염 제거
차아염소산나트륨시약된 폐기물을 버리기 위한가정용 표백제
15ml 원심분리기 튜브 (폴리프로필렌 15ml Falcon 35‐ 2096)소모성Fisher Scientific14‐ 959‐ 49B500ea/케이스; 객담 오염 제거 및 농축용
24웰 플레이트(플레이트 조직 24웰 BD Falcon 35‐ 3047)소모품Fisher Scientific08-772-150판/케이스; 배양 및 읽기용
밀봉 가능한 폴리에틸렌 백 6 X 6 “ (지퍼락)생물 보안을 위해 24개의 웰 플레이트
(16 x 100mm 및 18 x 145mm)소모품VWR international47729-583500 튜브/케이스; 준비된 육수의 분취액을 저장하기 위해
스크류 캡 마이크로 원심분리기 튜브 (1.5ml)소모품Fisher Scientific05‐ 669‐ 221000ea/case; 항생제 재고의 분취량을 저장하기 위하여
0.22μ m 필터 (수성 용제) 주사기 필터 Millex 블루소모품Fisher ScientificSLGL 025 OS50 단위/케이스; 항생제 재고를 필터링하기 위해
0.22μ m 필터 (유기 용제) 주사기 필터 Millex 노란색소모품Fisher ScientificSLGV 033 RS50 개/케이스; 항생제 재고 필터링
일회용 파스퇴르 피펫 붕규산 유리 9″소모품Fisher Scientific13‐ 678‐ 20C720ea/case; PANTA를 미디어 믹스
에어로졸 장벽 팁과 혼합하려면 1000‐ 1300&뮤; l소모품피셔 과학02‐ 707‐ 511000ea/pk; 플레이트에 매체를 분배하기 위해
USA Scientific Tips One 1‐ 200&뮤; l 노란색 팁소모품Fisher Scientific1111‐ 00061000 팁/가방; 항생제 재고를 희석하기 위해
고 장비; CO2가 농축될 필요가 없음 장비 오염유리관과 뚜껑을 포함하는 소모품

참고문헌

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