이 문서에서 우리는 세번째 instar Drosophila의 유충에서 중추 신경계를 해부하다하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
Drosophila의 애벌레의 중추 신경계 (CNS)는 복잡하고 제대로 이해합니다. CNS 조사 방법 중 하나는 각종 소설 및 마커 단백질의 표현을 검토하는 immunohistochemistry를 사용하는 것입니다. 어려운 표피가 뱃속 내부 관통 항체를 방지하기 때문에 전체 애벌레의 스테 이닝 것은 허무합니다. 이러한 조직을 얼룩하기 위해서는 고정과 얼룩하기 전에 동물을 해부하다하는 것이 필요합니다. 이 문서에서 우리는 CNS를 손상하지 않고 Drosophila의 유충을 해부하다하는 방법을 보여줍니다. 좋은 포셉 한 쌍의로 절반 유충을 찢어로 시작, 다음 CNS를 노출하기 위해 표피 "내부 아웃"을 설정합니다. 해부가 신중하게 수행하면 CNS는 표피에 부착된 상태로 유지됩니다. 우리는 보통 고정 및 얼룩 단계에 걸쳐 표피에 부착된 CNS를 유지하고, 오직 완전히 유리 슬라이드에 샘플을 장착하기 직전 표피에서 CNS를 제거합니다. 우리는 또한 이브, CNS의 뉴런의 집합으로 표현 전사 인자 물들일 애벌레 CNS의 일부 대표 이미지를 보여줍니다. 이 문서는이 기술과 발생할 수있는 잠재적인 문제의 실질적인 사용의 몇 가지 논의로 마칩니다.
프로토콜
- 표피에 부착된 CNS를 떠나, 3 차 instar의 유충을 해부하다. 1.5 ML 튜브에 놓습니다.
- 락을 40 분 2 % 포름 알데히드를 포함하는 PBS (1X)에서 수정. ; 모든 50-10 해부 CNS에 대한 250ul를 사용하십시오.
- 포름 알데히드를 제거하고 짧게 3 번 씻어 PBS + 0.1 % 트리톤 X - 100 (PBST). 조직의 손실을 피하기 위해 가늘게 뽑아 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
- 비 - 특정 단백질 바인딩 사이트를 차단하고 PBST에서 조직 1-8 시간을 잠복기하여 세포 세포막을 permeabilize + 4 락을 5 % BSA, ° C.를
- 4 ° C 하룻밤에 PBST + 5% BSA 락을에 희석 일차 항체에 품어. 최적의 항체 희석 다른 항체에 따라 다를 수 있습니다.
- 4 두 30 분 세척 ° C. 다음 PBST로 3 배 린스
- PBST로 희석 이차 항체에 품어 + 4 락을 1-3 시간에 대한 5 % BSA ° C.를 4 두 30 분 세척 ° C. 다음 PBST로 3 배 린스 보조가 빛을 민감한 화합물을 복합하는 경우, 알루미늄 호일에 튜브를 바꿈.
- 추가 조직을 해부하다 (필요한 경우) 및 슬라이드에 탑재합니다.
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토론
이 비디오는 세번째 instar Drosophila의 유충에서 CNS를 해부하다하는 방법을 보여줍니다. 절개 후, CNS는 표준 immunohistochemistry 프로토콜을 사용하여 얼룩하실 수 있습니다. 현재, 한결 성인 신경계가 그 상점 얼마나뿐만 아니라 생성되는 방법에 대해 알 수 있으며, 정보를 전송합니다. 개발 Drosophila 애벌레의 CNS의 연구 신경계 배선과 기능에 대한 지식을 강화해야합니다.
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공개 사항
저자들은 공개할 사항이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 포셉 | 미세 팁 | |||
| 9-웰 시계 유리 | ||||
| 플라스틱 페트리 접시 |
참고문헌
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13, 507-523 (1994).
- Park, Y., Fujioka, M., Kobayashi, M., Jaynes, J., Datta, S. even skipped is required to produce a trans-acting signal for larval neuroblast proliferation that can be mimicked by ecdysone. Development 128. , 1899-1909 (2001).
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재인쇄 및 허가
