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xenopus laevis 여성의 난자를 구하기

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Xenopus의 달걀은 그대로, lysed, 및 / 또는 fractionated이 실험의 다양한 유용합니다 laevis. 이 프로토콜은, 달걀 누워을​​ 유도 달걀을 수집하고 dejelly, 및 손상된 계란을 제거하는 달걀을 정렬하는 방법을 보여줍니다.

Xenopus laevis 여성의 난자를 구하기

손상되지 않았거나, 용해되었거나, 그리고/또는 분획된 Xenopus laevis의 난자는 광범위한 실험에 유용합니다. 본 프로토콜에서는 산란을 유도하는 방법을 설명하며, ...

Xenopus laevis 난자 추출물은 핵 조립 및 핵 단백질 수송과 같은 세포 내 사건의 인비트로(in vitro) 재구성을 위한 세포질 및 세포소기관 물질의 유용한 공급원입니다. 물론 난자 추출물을 사용하기 전에는 먼저 암컷 개구리로부터 난자를 얻어야 합니다. 안녕하세요, 저는 조지아주 애틀랜타에 위치한 에모리 대학교 세포생물학과의 Maureen Power 박사님 연구실 소속 대학원생인 Marie Cross입니다.오늘은 성숙한 *Xenopus laevis* 암컷으로부터 젤리 형태의 알을 얻고 분리하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 절차에는 다음 단계가 포함됩니다: 임신한 암컷의 산란 유도 준비, 인간 함께성선 자극 호르몬(hCG)을 이용한 산란 유도, 그리고 불량 알이나 세포의 선별입니다. 이제 시작하겠습니다.알을 생성하기 위해, 성숙한 암컷 개구리에게 먼저 임신마 혈청 성선자극호르몬을 투여하여 프라이밍을 수행합니다. 프라이밍 절차를 시작하려면, 개구리를 수용할 100 mM sodium chloride가 포함된 수조를 준비하십시오. 주사 후, 프라이밍된 개구리는 리터당 약 한 마리의 밀도로 유지해야 합니다.개구리를 18°C에서 사육함으로써 최적의 산란 상태를 유지합니다. 1ml 시린지에 27G 바늘을 장착하여, 200 units/ml 농도의 Pregnant mare serum gonadotropin 0.5ml를 개구리의 등쪽 림프낭에 피하 주사합니다.프라임 개구리들을 100 mM sodium chloride가 포함된 수조로 옮깁니다. 2~3일 후, 100 units/mL 농도의 Human chorionic gonadotropin 0.5 µL를 개구리의 등쪽 림프낭에 다시 피하 주사하여 산란을 유도합니다.주사 후, 각 개구리를 100 mM 염화나트륨 5L 용액에 넣습니다. 개구리마다 알의 품질이 다르므로 각 개구리를 개별 용기에 넣는 것이 좋습니다. 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG) 주사 후 약 16~22시간이 지나면, 개구리를 깨끗한 물 탱크로 옮기고 알을 비커에 붓습니다.주사 부위에 감염 징후가 있는지 한두 일 동안 개구리를 관찰하는 것이 권장됩니다. 이 단계에서 각 알은 투명한 젤리 코트로 둘러싸여 있어 알들이 서로 닿는 것을 방지합니다. 젤리 알을 제거하려면, 알을 한 번 헹군 후 2%L cysteine pH 8 용액으로 씻어내고, 개구리당 2%L cysteine 용액 100 bills가 담긴 용기에서 약 5분 동안 계속 배양합니다. 실온에서 5분 후부터 주기적으로 알을 부드럽게 흔들어 줍니다.시스테인 용액을 제브라피쉬 알에서 따라내고 0.25 x modified ringer 용액으로 3회 세척합니다. 이물질을 제거하기 위해 해부 현미경 하에서 100mm 유리 페트리 접시에 알을 붓습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 상태가 좋지 않은 알을 제거합니다.성숙한 xip 난자는 상단부가 어둡게 색소 침착되어 있고 하단부는 밝은 색을 띱니다. 성숙한 난자의 어두운 색소 침착 반구 중심부에는 난모세포의 성숙을 나타내는 흰색의 핀포인트 크기 점이 보여야 합니다. 좋은 난자는 색소 침착이 고르게 형성된 난자입니다.이 흰색 점이 없는 것은 난모세포이므로 제거해야 합니다. 흰색으로 확대되었거나 색소 침착이 균일하지 않은 알 또한 제거해야 합니다. 상태가 특히 좋지 않은 알은 반구 사이의 경계가 완전히 가려진 흰색의 부푼 공 모양으로 보입니다. 알 용해 버퍼를 붓고 다시 조심스럽게 따라내는 과정을 2~3회 반복하여 선별된 알을 세척하며, 이때 알이 함께 쏟아지지 않도록 주의합니다.이제 난자를 용해하여 추출물을 준비할 수 있습니다. 지금까지 성숙한 Xenopus lavis 암컷에서 난자를 얻고 젤리층을 제거하는 방법을 보여드렸습니다. 조추출물을 준비하는 방법과 분획된 난자 추출물을 사용하여 인비트로(in vitro) 핵 조립을 재구성하는 방법을 다룬 다른 두 영상도 꼭 확인하시기 바랍니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Emory University.  Xenopus의 달걀은 그대로, lysed, 및 / 또는 fractionated이 실험의 다양한 유용합니다 laevis. 이 프로토콜은, 달걀 누워을​​ 유도 달걀을 수집하고 dejelly, 및 손상된 계란을 제거하는 달걀을 정렬하는 방법을 보여줍니다.

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