2.4: 접촉 슬라이드 분석 및 현미경을 통한 토양 미생물 시각화

1. 토양 슬라이드 소우주 준비

1. 표면 (0-6"깊이)에서 정원 토양을 수집하고 150g 토양을 두 개의 별도 컵으로 무게.
   1. 토양에 유기물의 밀도가 높은 경우 무게는 100g입니다.
2. 한 컵 "치료"와 다른 "제어"라고 레이블을 지정합니다.
3. 수분 함량을 변경하는 데 필요한 양의 물을 계산합니다.
   1. 수분 함량은 종종 현장 용량에 가깝습니다.
      
4. 졸업한 실린더로 증류수의 양을 측정합니다.
5. 증류수 양을 두 개의 바이알에 붓습니다.
6. 하나의 유리병 "치료"와 다른 "제어"를 라벨.
7. "치료" 토양의 건조 중량 기준에 따라 1%의 최종 토양 포도당 농도에 대한 충분한 포도당으로 "치료" 유리병에서 물을 수정합니다.
8. 200 mg NH₄NO_3을 "치료"유리병에 넣고 개정을 용해하기 위해 저어줍니다. 질산염은 토양 미생물을 위한 양분의 질소 근원 역할을 합니다.
9. "제어" 바이알을 수정하지 마십시오.
10. 약 50 mg의 작은 알리쿼트에서 "치료"유리병의 내용을 "치료"컵에 섞습니다. 각 알리쿼트 추가 후 주걱으로 저어.
11. 작은 알리쿼트에서 "컨트롤" 유리병의 내용을 "컨트롤" 컵에 섞습니다. 각 알리쿼트 추가 후 주걱으로 저어.
12. 4개의 깨끗한 현미경 슬라이드를 라벨: 2개의 "처리" 및 2개의 "제어" 슬라이드.
13. "처리" 슬라이드 두 개를 "처리" 토양 컵에 삽입하고 두 개의 "제어" 슬라이드를 "제어" 토양 컵에 삽입합니다. 각 슬라이드의 2cm를 토양 표면 위에 투사하고 두 슬라이드 사이에 간격을 두십시오.
14. 컵에 플라스틱 랩으로 덮고 고무 밴드로 고정하십시오.
15. 공기를 허용하기 위해 랩을 여러 번 뚫지만 과도한 증발을 방지합니다.
16. 두 컵의 무게를 기록합니다.
17. 7일 동안 지정된 구역/인큐베이터에서 토양으로 채워진 컵을 실온에서 배양합니다.

2. 슬라이드 염색 및 현미경 검사법

1. 두 컵의 무게를 기록합니다.
2. 슬라이드 제거 시 토양 수분을 계산합니다.
3. 각 슬라이드를 경사 위치로 누르고 철회하여 각 컵에서 두 개의 슬라이드를 제거하여 슬라이드의 위쪽 면이 방해받지 않도록 합니다.
4. 슬라이드의 측면을 식별하고 표시하여 염색하고 관찰합니다.
5. 벤치 상단의 슬라이드를 부드럽게 탭하여 큰 토양 입자를 제거합니다.
6. 젖은 종이 타월을 사용하여 슬라이드의 아래쪽 면을 청소하십시오. 실온에서 슬라이드를 건조시다.
7. 보호 고글을 착용하고 각 슬라이드를 집게로 잡고 슬라이드를 40 % (v /v) 아세트산에 넣고 연기 후드 아래에서 1-3 분 동안 담급니다.
8. 부드러운 물 줄기 아래에서 여분의 산을 씻어 내보냅니다.
9. 드롭퍼 병을 사용하여 슬라이드 표면을 페놀 로즈 벵골으로 덮습니다. 용기 위에 얼룩진 랙의 슬라이드를 지원하여 과도한 얼룩을 잡습니다. 슬라이드 표면에서 미생물을 제거 할 수있는 힘으로 씻지 마십시오.
10. 5-10 분 동안 슬라이드를 염색하십시오. 필요에 따라 더 많은 얼룩을 추가합니다.
11. 슬라이드를 부드럽게 씻고 과도한 얼룩을 제거합니다.
12. 실온에서 슬라이드를 건조시키십시오.
13. 오일 침지 목표를 사용하여현미경(도 1)을사용하여 슬라이드를 관찰한다.

그림 1. 현미경 아래 슬라이드.

토양의 다양한 유기체와 무기 성분 간의 관계는 토양 변화와 환경 스트레스를 이해하는 데 필수적이지만 직접적인 시각화 없이는 설명할 수 없습니다.

매우 복잡한 시스템인 토양은 수백만 종의 다양한 유기체의 서식지입니다. 특히 뿌리권(rhizosphere)이라고 하는 식물 뿌리 바로 주변의 토양 영역에는 식물 뿌리의 직접적인 영향을 받는 독특한 유기체 배열이 포함되어 있습니다.

근권의 비생물적 또는 비생물학적 구성 요소에는 토양의 질감에 기여하는 크기와 모양의 무기 입자가 포함됩니다. 생물 또는 생물학적 부분에는 식물 잔류 물, 뿌리, 유기물 및 미생물이 포함됩니다.

이 비디오는 토양 변화에 영향을 미치는 요인을 이해하고 환경 스트레스를 예측하기 위해 근권 토양의 생물 및 비생물 구성 요소를 직접 시각화하는 방법을 보여줍니다.

미세한 유기체는 토양 기공 내에 위치한 물에 서식하는 경향이 있습니다. 박테리아는 토양에 존재하는 가장 단순하고 풍부한 유기체 중 하나이며 구균이라고 불리는 구체, 간균이라고 불리는 막대 및 사상 형태를 포함한 많은 형태에서 발견됩니다.

효모 및 곰팡이와 같은 곰팡이 종은 토양에서 두 번째로 풍부한 유기체입니다. 그들은 죽은 유기물을 분해하고 재활용하는 일을 합니다. 미세한 사상균은 포자를 방출하는 길고 분지된 균사를 가지고 있기 때문에 다른 미생물과 시각적으로 다릅니다.

이러한 유기체 간의 관계를 직접 관찰하는 것은 까다롭지만 접촉 슬라이드 분석을 사용하여 달성할 수 있습니다. 이 방법은 유리 슬라이드를 며칠 동안 토양에 담그고 유기체와 토양 입자가 슬라이드 표면에 흡착되도록 하여 수행됩니다.

그런 다음 슬라이드를 비스듬히 제거하여 표면이 번지는 것을 방지합니다. 미생물은 아세트산으로 고정되고 로즈 벵골 염색으로 염색되어 광학 현미경을 통해 시각화할 수 있습니다.

이제 접촉 슬라이드 분석 기법의 원리를 이해했으므로 실험실에서의 프로세스를 살펴보겠습니다.

먼저 표면 정원 토양을 수집하고 토양을 실험실로 옮깁니다. 2개의 별도 용기에 150g의 흙 무게를 잰다. 하나의 용기에 처리 샘플로 라벨을 부착해야 하며, 이는 유기체의 빠른 증식을 촉진하기 위해 영양소로 변형됩니다. 다른 하나는 변경되지 않는 컨트롤로 레이블을 지정합니다.

이 컬렉션의 토양 내 수분 함량 결정 비디오에 표시된 기술을 사용하여 토양의 수분 함량을 계산합니다. 이 계산을 기반으로 건조 중량 기준으로 토양의 수분량을 결정합니다. 이제 15%의 토양 수분 함량을 제공하기 위해 추가해야 하는 물의 양을 계산하십시오. 이것은 미생물 성장에 최적인 필드 용량으로 수분을 가져옵니다.

눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 계산된 증류수의 양을 측정합니다. 계산된 양의 물을 각 용기에 붓습니다. 이전에 결정된 토양의 건조 중량을 기준으로 건조 중량 기준을 사용하여 질량 기준 1%의 최종 토양 포도당 농도를 달성하는 데 필요한 포도당의 양을 계산합니다. 이 양의 포도당의 무게를 측정하여 처리 용기에만 첨가하십시오.

질산암모늄 200mg의 무게를 잰 다음 처리 용기에만 첨가하십시오. 질산암모늄은 토양 미생물의 질소 영양원 역할을 합니다. 용기에 토양, 포도당 및 질산 암모늄 혼합물을 혼합합니다.

다음으로, 4개의 깨끗한 현미경 슬라이드에 라벨을 붙입니다: 2개는 처리용으로, 2개는 대조군으로 사용합니다. 두 개의 처리 슬라이드를 처리 토양 용기에 삽입합니다. 각 슬라이드의 한 부분을 토양 표면 위에 노출된 상태로 두고 두 슬라이드 사이에 간격이 있는지 확인합니다.

같은 방법으로 두 개의 대조군 슬라이드를 대조군 토양 용기에 삽입합니다. 컵을 플라스틱 랩으로 덮고 고무 밴드로 고정합니다. 플라스틱 랩에 구멍을 여러 번 뚫어 공기가 전달될 수 있도록 하되 과도한 증발을 방지합니다.

마지막으로, 두 컵의 무게를 측정하고 무게를 기록한 다음 지정된 장소에서 실온에서 7일 동안 배양합니다.

7일간의 배양 후 토양 컵의 무게를 측정하여 토양 수분 함량을 계산합니다. 수분 증발로 인해 무게가 손실되었는지 확인하고 필요한 경우 물을 교체합니다.

용기에서 플라스틱 랩을 제거하고 각 슬라이드를 기울어진 위치로 누르고 슬라이드의 윗면이 방해받지 않도록 당겨 토양에서 두 개의 슬라이드를 제거합니다.

슬라이드를 부드럽게 두드려 큰 흙 입자를 제거합니다. 젖은 종이 타월을 사용하여 슬라이드의 아래쪽 면을 청소합니다. 흄 후드에서 실온에서 건조시키십시오. 건조되면 집게로 슬라이드를 잡고 1-3분 동안 아세트산에 담그십시오.

슬라이드 상단을 증류수를 부드럽게 헹구어 과도한 산을 제거합니다. 모든 슬라이드에 대해 이 단계를 반복합니다. 슬라이드를 자연 건조시키십시오.

과도한 염료를 잡기 위해 용기 위의 염색 선반에 있는 슬라이드를 지지합니다. 스포이드를 사용하여 각 슬라이드의 표면을 페놀 로즈 벵골 염료로 부드럽게 덮습니다. 슬라이드가 5-10분 동안 얼룩이 지도록 하고 슬라이드가 젖지 않도록 필요에 따라 염료를 더 추가하도록 주의하십시오. 슬라이드를 물로 부드럽게 헹구어 과도한 얼룩을 제거하고 슬라이드를 실온에서 건조시킵니다.

오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 광학 현미경에서 슬라이드를 검사합니다. 처리된 토양에는 더 많은 토양 미생물이 있습니다.

일반적인 토양 샘플에서 곰팡이 유기체와 박테리아 유기체 간의 공간적 상호 작용을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 토양 입자는 어둡고 불규칙한 모양을 표시합니다.

곰팡이 유기체는 두꺼운 사상 균사를 나타내는 반면 방선균류는 얇은 사상 균사를 나타냅니다.

박테리아는 일반적으로 토양 입자 또는 라이닝 곰팡이 균사에서 작은 구균 또는 막대 모양으로 발견됩니다.

토양에서 유기체를 직접 격리하는 것은 토양 및 환경 특성을 이해하는 데 중요합니다.

곤충병원성 선충은 곤충에 기생하는 미세한 둥근 벌레입니다. 접촉 슬라이드 분석에서 시각화되지는 않지만 이 예와 같이 수집된 토양 샘플에서 분리할 수 있습니다.

먼저, 육안 검사에서 확인된 곤충을 사용하여 선충을 토양에 미끼로 던졌습니다. 선충은 죽은 곤충을 습하고 어두운 환경에 놓고 선충이 주변 물로 이동할 수 있도록 함으로써 죽은 곤충 미끼로부터 분리되었습니다. 그런 다음 물에서 선충을 채취하여 분석했습니다.

사상균은 영양분 재활용에 중요한 역할을 하기 때문에 토양 건강에 필수적입니다. 토양에서 사상균의 분리 및 관찰이 이 예에서 수행되었습니다.

토양 샘플을 물로 희석하고 별도의 멸균 Rose Bengal 스트렙토마이신 한천 플레이트에 첨가했습니다. 스트렙토마이신은 박테리아 성장을 방지하고 곰팡이 성장을 가능하게 했습니다. 곰팡이 군체를 세고 접착 테이프를 사용하여 유리 슬라이드에 장착했습니다. 그런 다음 광학 현미경을 사용하여 곰팡이를 이미지화했습니다.

토양 미생물은 죽은 식물 및 유기체와 같은 토양의 구성 요소를 자연적으로 분해합니다. 생분해성 플라스틱 필름의 생분해 및 집락화는 이 예와 같이 조사되었습니다.

곰팡이는 몇 달 동안 토양에 묻힌 플라스틱 필름에서 분리되었습니다. 그런 다음 곰팡이가 플라스틱 필름에서 자랐는지 개별적으로 테스트했습니다. 그런 다음 곰팡이에 의한 플라스틱의 직접적인 분해를 관찰하기 위해 성장 배지 없이 선택된 곰팡이 균주로 플라스틱 필름을 배양했습니다.

토양 미생물의 정성적 이미징을 위한 접촉 슬라이드 분석에 대한 JoVE의 소개를 시청하셨습니다. 이제 접촉 슬라이드를 준비하고 토양 미생물을 시각화하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!