환경 자원의 박테리아의 그람 염색

1. 샘플 수집

1. 미생물 분석을 위해 토양 샘플을 수집하고 실험실로 이송합니다.
2. 실험실에서 분석 균형을 사용하여 10g 샘플의 무게를 측정합니다.
3. 시료를 1:10으로 95mL의 인산염 완충식식염수(10개 부품 토양은 5부 수성 액체에 해당), 및 혼합하는소용돌이(도 2,1단계)를 희석시켰다.
4. 후속 1:10 희석은 mL당 최소 10-5g의 토양까지 수행하며, 낮은 영양통조매(예: 2, 단계 2-3)에 2~3개의 복제로 선택된 희석을 수행한다.
5. 상온에서 1 주일 동안 플레이트를 배양하십시오(그림 2,4 단계).
6. 고립을 위해 하나 또는 두 개의 식민지를 선택하고 신선한 한천 접시에 줄무늬(그림 3,단계 1-3).
7. 실온에서 2~3일 동안 줄무늬 플레이트를 배양한다(그림3,4단계).

2. 세균 얼룩의 준비

1. 고립 된 식민지에 대한 줄무늬 플레이트를 관찰.
2. 각 얼룩 준비를 준비하려면 에탄올에 접종 루프를 담그고, 화염 살균을 하고, 멸균 된 증류수 1~2루를 미리 세척한 유리 슬라이드 중앙에 놓습니다.
3. 이전에 설명한 대로 접종 루프를 다시 살균합니다. 냉각되면, 하나의 고립 된 식민지에서 문화의 작은 금액을 제거하고 슬라이드에 물방울과 혼합 (얼룩은 희석 탈지 우유를 닮아야한다). 식민지 격리 전에 접종 루프를 냉각해야 합니다. 너무 뜨겁게 된 루프는 식민지 및/또는 중간체가 튀어 나와 박테리아의 에어로졸화로 이어질 수 있습니다. 일반적으로 루프가 너무 뜨거워서 사용이 너무 뜨거워지면 한천이나 식민지에 적용될 때 "히싱" 소리가 들립니다. 루프의 부적절한 냉각은 또한 덜 효율적인 배양-슬라이드 전송 및 세포 형태의 왜곡을 초래할 수 있습니다.
4. 약 2.5cm x 2.5cm의 슬라이드 표면에 얼룩을 퍼뜨리고 공기 건조를 허용합니다. 공기 건조는 라미나르 유량 조건에서 발생하는 것이 중요합니다. 미끄럼이 얼룩을 방해하지 않도록 슬라이드가 건조해서는 안됩니다. 또한, 슬라이드는 세포 형태를 유지하기 위해, 화염 건조해서는 안됩니다.
5. 건조 후, 열은 2-3 x 불꽃을 통해 신속하게 슬라이드를 전달하여 얼룩을 고정합니다. 슬라이드는 세포 형태의 왜곡 및 /또는 유리 슬라이드의 손상을 방지하기 위해, 화염에 고정 개최해서는 안된다.

3화 그램 염색

1. 깨끗한 옷핀을 사용하여 한쪽 끝에서 슬라이드를 고정하십시오.
2. 크리스탈 바이올렛 (기본 얼룩)으로 얼룩을 덮고 2 ~ 3 분 동안 유지하십시오.
3. 슬라이드를 증류수로 조심스럽게 씻으십시오. 유리 슬라이드의 손상 및/또는 분리를 방지하기 위해 물 스트림은 얼룩을 향해서는 안됩니다.
4. 그람의 요오드로 얼룩을 덮고 2분 동안 누은 다음 슬라이드를 물로 부드럽게 헹구십시오.
5. 얼룩이 더 이상 슬라이드에서 세싱되지 않도록 95 %의 에탄올을 사용하여 얼룩을 탈색 (이것은 일반적으로 얼룩의 두께에 따라 20 s 이상 걸리지 않습니다), 즉시 증류수로 헹구십시오. 이 단계는 슬라이드를 변색하는 것을 피하기 위해 매우 중요하며, 이는 잘못된 Gram 얼룩지정(즉, 그램 변수)으로 이어질 수 있습니다.
6. 카운터스테인(사프란)을 얼룩에 넣고 30s를 잡습니다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 부드럽게 헹구고 흡수성 종이를 사용하여 건조하게 헹구십시오.

4. 슬라이드의 현미경 관찰

1. 낮은(예:4X 또는 10X), 고건조(예: 40X), 오일 침지(100X) 목표를 사용하여 슬라이드를 관찰한다. 오일 침수의 경우 오일을 얼룩에 직접 추가합니다.
2. 그람 양성 및 그람 음성 토양 박테리아의 대표적인 결과는 그림 4 및 5를참조하십시오.

그림 2. 희석 및 확산 도금 기술. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 식민지 격리.

그림 4. 그램 양성 토양 박테리아 황색포도상구균.

그림 5. 그람 음성 토양 박테리아 에체리치아 대장균.