2.3: 환경 자원의 박테리아의 그람 염색

1. 샘플 수집

1. 미생물 분석을 위해 토양 샘플을 수집하고 실험실로 이송합니다.
2. 실험실에서 분석 균형을 사용하여 10g 샘플의 무게를 측정합니다.
3. 시료를 1:10으로 95mL의 인산염 완충식식염수(10개 부품 토양은 5부 수성 액체에 해당), 및 혼합하는소용돌이(도 2,1단계)를 희석시켰다.
4. 후속 1:10 희석은 mL당 최소 10-5g의 토양까지 수행하며, 낮은 영양통조매(예: 2, 단계 2-3)에 2~3개의 복제로 선택된 희석을 수행한다.
5. 상온에서 1 주일 동안 플레이트를 배양하십시오(그림 2,4 단계).
6. 고립을 위해 하나 또는 두 개의 식민지를 선택하고 신선한 한천 접시에 줄무늬(그림 3,단계 1-3).
7. 실온에서 2~3일 동안 줄무늬 플레이트를 배양한다(그림3,4단계).

2. 세균 얼룩의 준비

1. 고립 된 식민지에 대한 줄무늬 플레이트를 관찰.
2. 각 얼룩 준비를 준비하려면 에탄올에 접종 루프를 담그고, 화염 살균을 하고, 멸균 된 증류수 1~2루를 미리 세척한 유리 슬라이드 중앙에 놓습니다.
3. 이전에 설명한 대로 접종 루프를 다시 살균합니다. 냉각되면, 하나의 고립 된 식민지에서 문화의 작은 금액을 제거하고 슬라이드에 물방울과 혼합 (얼룩은 희석 탈지 우유를 닮아야한다). 식민지 격리 전에 접종 루프를 냉각해야 합니다. 너무 뜨겁게 된 루프는 식민지 및/또는 중간체가 튀어 나와 박테리아의 에어로졸화로 이어질 수 있습니다. 일반적으로 루프가 너무 뜨거워서 사용이 너무 뜨거워지면 한천이나 식민지에 적용될 때 "히싱" 소리가 들립니다. 루프의 부적절한 냉각은 또한 덜 효율적인 배양-슬라이드 전송 및 세포 형태의 왜곡을 초래할 수 있습니다.
4. 약 2.5cm x 2.5cm의 슬라이드 표면에 얼룩을 퍼뜨리고 공기 건조를 허용합니다. 공기 건조는 라미나르 유량 조건에서 발생하는 것이 중요합니다. 미끄럼이 얼룩을 방해하지 않도록 슬라이드가 건조해서는 안됩니다. 또한, 슬라이드는 세포 형태를 유지하기 위해, 화염 건조해서는 안됩니다.
5. 건조 후, 열은 2-3 x 불꽃을 통해 신속하게 슬라이드를 전달하여 얼룩을 고정합니다. 슬라이드는 세포 형태의 왜곡 및 /또는 유리 슬라이드의 손상을 방지하기 위해, 화염에 고정 개최해서는 안된다.

3화 그램 염색

1. 깨끗한 옷핀을 사용하여 한쪽 끝에서 슬라이드를 고정하십시오.
2. 크리스탈 바이올렛 (기본 얼룩)으로 얼룩을 덮고 2 ~ 3 분 동안 유지하십시오.
3. 슬라이드를 증류수로 조심스럽게 씻으십시오. 유리 슬라이드의 손상 및/또는 분리를 방지하기 위해 물 스트림은 얼룩을 향해서는 안됩니다.
4. 그람의 요오드로 얼룩을 덮고 2분 동안 누은 다음 슬라이드를 물로 부드럽게 헹구십시오.
5. 얼룩이 더 이상 슬라이드에서 세싱되지 않도록 95 %의 에탄올을 사용하여 얼룩을 탈색 (이것은 일반적으로 얼룩의 두께에 따라 20 s 이상 걸리지 않습니다), 즉시 증류수로 헹구십시오. 이 단계는 슬라이드를 변색하는 것을 피하기 위해 매우 중요하며, 이는 잘못된 Gram 얼룩지정(즉, 그램 변수)으로 이어질 수 있습니다.
6. 카운터스테인(사프란)을 얼룩에 넣고 30s를 잡습니다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 부드럽게 헹구고 흡수성 종이를 사용하여 건조하게 헹구십시오.

4. 슬라이드의 현미경 관찰

1. 낮은(예:4X 또는 10X), 고건조(예: 40X), 오일 침지(100X) 목표를 사용하여 슬라이드를 관찰한다. 오일 침수의 경우 오일을 얼룩에 직접 추가합니다.
2. 그람 양성 및 그람 음성 토양 박테리아의 대표적인 결과는 그림 4 및 5를참조하십시오.

그림 2. 희석 및 확산 도금 기술. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 식민지 격리.

그림 4. 그램 양성 토양 박테리아 황색포도상구균.

그림 5. 그람 음성 토양 박테리아 에체리치아 대장균.

그람 염색을 통해 박테리아 형태를 빠르게 시각화하고 광범위한 환경 시료에서 광범위한 세포 구별을 할 수 있습니다. 박테리아를 염색하기 위해 유리 면에 균일한 도포를 적용하고 건조시킵니다. 얼룩을 열처리 한 후 크리스탈 바이올렛을 도포합니다.

탈색제는 그람 음성 세포에서 크리스탈 바이올렛을 헹구지만 그람 양성 세포는 헹구지 않습니다. 두 번째 염료인 일반적으로 사프라닌(safranin)은 그람 음성 세포를 시각화하기 위한 배경 염색으로 사용됩니다. 염색이 완료되면 세포의 형태, 크기 및 사슬 또는 클러스터와 같은 배열에 대해 세포를 평가할 수 있습니다.

이 비디오는 환경 샘플을 준비하고, 그 안에서 발견되는 박테리아 종을 분리하고, 격리된 집락

그램 염색을 수행하여 대부분의 박테리아를 그람 양성과 그람 음성의 두 가지 광범위한 구조 등급으로 분류할 수 있습니다. 두 종류 모두 기본 인지질 원형질막을 가지고 있지만 세포벽의 구조는 크게 다릅니다. 그람 양성 세포벽은 주로 당과 아미노산으로 구성된 고분자인 펩티도글리칸의 두꺼운 층으로 구성되어 있습니다. 그람 음성 세포벽은 두 번째 지질막 사이에 끼워진 더 얇은 펩티도글리칸 층을 가지고 있습니다. 이 외막에는 일반적으로 지질다당류가 포함되어 있습니다.

양전하를 띤 크리스탈 바이올렛은 음전하를 띤 박테리아 세포벽에 약하게 결합합니다. 그램의 요오드는 결정 바이올렛 염료와 불용성 복합체를 형성하여 세포벽에 고정시킵니다.

탈색 단계에서 그람 양성 세포의 펩티도글리칸은 탈수되어 수축하고 결정 바이올렛-요오드 복합체를 가두게 됩니다. 그람 음성 세포에서 탈색제는 외막을 손상시켜 다공성을 증가시킵니다. 이를 통해 결정 바이올렛-요오드 복합체를 씻어낼 수 있습니다.

이제 그람 염색 토양 박테리아의 원리를 이해했으므로 실험실에서 토양 박테리아에 대해 수행되는 과정을 살펴보겠습니다.

현장에서 토양 샘플을 채취한 후 분석을 위해 실험실로 가져옵니다. 체로 샘플을 정제하고 분석 저울을 사용하여 체질된 토양 10g의 무게를 잰다.

샘플을 95mL의 인산염 완충 식염수와 와류로 희석하여 혼합합니다. 추가로 1-10회 희석을 수행하여 각 희석 사이를 와류로 만듭니다. 최소 3회 연속 희석의 분취액을 저영양 아가로스 플레이트를 복제하여 전달합니다.

에탄올 화염 살균 및 매체를 두드려 구부러진 유리 막대를 냉각한 후 샘플을 플레이트 표면에 펴 놓습니다. 플레이트를 실온에서 배양합니다. 3-5일 동안 배양한 후 30-300개의 개별 콜로니로 가장 높은 희석을 선택합니다. 멸균 접종 루프를 통해 격리를 위해 관심 콜로니를 선택합니다.

새 접시의 한 부분에 식민지를 줄무늬로 만듭니다. 줄무늬 사이의 루프를 살균하고 플레이트의 각 섹션에 지그재그 패턴으로 연속적인 줄무늬를 만들어 개별 단일 콜로니의 후속 격리를 허용합니다. 플레이트를 실온에서 1-2일 동안 배양합니다.

세균성 도말 준비를 시작하려면 취급하기 쉽도록 미리 청소된 유리 슬라이드에 클립을 부착하십시오. 각 박테리아 얼룩에 대해 접종 루프를 청소하고 화염 살균합니다. 멸균 증류수 2루프를 슬라이드 중앙에 놓습니다.

루프를 다시 살균한 후 고립된 군체에서 소량의 배양물을 제거하고 슬라이드의 물과 혼합합니다. 배양물을 만지기 전에 한천의 접종되지 않은 부분을 여러 번 두드려 루프를 식히는 것이 중요합니다. 번짐은 희석된 우유와 비슷해야 합니다. 슬라이드를 실온에서 건조시키십시오. 건조 후 화염을 통해 빠르게 통과시켜 번짐을 가열하여 고정하십시오.

건조되면 크리스탈 바이올렛을 얼룩에 피펫으로 바르고 2-3 분 동안 그대로 두십시오. 슬라이드 상단을 향하는 직접적인 흐름을 조준하여 슬라이드를 증류수로 조심스럽게 헹구어 물이 부드럽게 흘러내리도록 합니다. 물의 흐름을 얼룩에 직접 조준하지 마십시오.

슬라이드를 그램의 요오드로 덮습니다. 2분 후 증류수로 부드럽게 헹굽니다. 얼룩이 더 이상 씻겨 나가지 않을 때까지 슬라이드를 95% 에탄올로 탈색합니다. 즉시 증류수로 헹굽니다. 이렇게 하면 번짐의 과도한 탈색을 제한할 수 있습니다.

30초 동안 얼룩에 대한 얼룩 방지로 사프라닌을 추가합니다. 이것은 존재하는 모든 그람 음성 세포를 염색합니다. 증류수로 부드럽게 헹구고 흡수성 종이로 닦아내십시오. 결과 슬라이드를 현미경으로 관찰합니다. 먼저 저전력 대물렌즈를 사용하여 대략적으로 조정하고 더 높은 배율의 더 작은 시야로 이동하기 전에 번짐의 이상적인 부분을 찾으십시오.

추가 이미징 및 중간 파워 대물렌즈로 도말을 조정한 후 도말에 직접 이멀젼 오일을 추가합니다. 오일은 최상의 현미경 사진을 제공하는 고출력 목표에 필요합니다. 그람 양성 박테리아는 파란색 또는 보라색으로 나타나고 그람 음성 세포는 빨간색 또는 분홍색으로 나타납니다. 세포벽 구조 외에도 결과 현미경 사진에서 모양과 배열이 설명됩니다.

박테리아를 정성적으로 연구하는 그람 염색 능력은 광범위한 과학 분야에서 중요합니다.

토양은 박테리아를 분리하고 분석할 수 있는 환경 공급원 중 하나일 뿐입니다. 식수의 경우 샘플 준비를 수정해야 합니다. 수도꼭지에서 수돗물 샘플을 추출하여 다양한 종속영양 박테리아 군집의 성장을 촉진하는 성장 매체에 도금할 수 있습니다. R2A와 같은 매체에 도금할 때 이 과정은 토양 절차와 거의 동일합니다.

특정 박테리아 식별 기술의 경우, 매개변수는 관심 박테리아의 세포벽 유형에 따라 달라집니다. 이 예에서는 패혈증 환자의 혈액을 검사한 결과 그람 양성 박테리아가 있는 것으로 밝혀졌습니다.

이 정보를 바탕으로 세포의 rRNA에 결합할 종 특이적 펩타이드 핵산 프로브를 선택했습니다. 이 프로브는 존재하는 종을 식별하는 데 사용되는 형광 염료에 결합되었습니다.

그람 양성 및 음성 세포 구조의 근본적인 차이로 인해 박테리아는 결정 바이올렛 이외의 다른 화합물에 대해 고유한 반응을 보입니다. 이 실험은 배설물 샘플에서 그람 양성 박테리아인 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)를 분리하기 위한 것이었습니다. 그람 음성 세포의 성장을 억제하는 시클로세린(Cycloserine)을 한천 플레이트에 첨가했습니다. 플레이트에서 자란 그람 양성 세포는 다른 방법을 통해 추가로 분리되었습니다.

환경 연구를 위한 그람 염색에 대한 JoVE의 소개를 시청하셨습니다. 이제 프로세스의 이점과 기술을 수행하고 결과를 활용하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!