침전물에서 생물지표 추출-가속 용매 추출
출처: 제프 살라컵 연구소 - 매사추세츠 대학교 애머스트
고고학 및 박테리아 의 제품군에 의해 생성 된 글리세롤 -dialkyl 글리세롤 테트라에테르 (GDGTs)라는 유기 바이오 마커의 그룹의 분포는 공기 또는 수온1,2에대한 응답으로 예측 가능한 방식으로 변화하는…
1. 필요한 재료의 수집
- 샘플을 추출합니다. 샘플(이 경우 퇴적물)은 추출 전에 동결, 동결 건조, 분쇄 및 균질화되며, 효율성을 극대화하기 위해 그룹으로 추출됩니다.
- 샘플크기에 따라 40mL 또는 60mL의 볼륨이 있는 수집 바이알을 사용합니다. 이 실험을 위해, 보로실리케이트 유리 바이알(40mL) 및 용매 안전 캡이 사용된다. 연소 유리, 보로실리케이트 유리 파이펫, 550°C의 계량 주석은 6시간 동안 가능한 유기 오염 물질을 제거합니다.
- 디클로로메탄(DCM)과 메탄올은 대부분의 유기 지질화학 실험실에서 흔히 볼 수 있습니다. 개별적으로 사용하길( 메탄올 먼저, DCM이 뒤따랐음)을 사용하여 사용 전에 실험실 도구와 유리 제품을 헹구는 것입니다. 메탄올(MeOH; 9:1)에 디클로로메탄을 혼합하여 광범위한 극성을 가진 바이오마커를 효율적으로 추출하는 데 사용됩니다. 용매는 유기 오염 물질이 없어야합니다.
- 이 실험에 사용할 가속 용매 추출기를 구하십시오.
2. 샘플 셀 의 준비
- 추출할 각 샘플에 대한 샘플 셀과 빈 1개를 어셈블합니다.
- 각 셀에 대해 끝 캡을 셀 본체의 한쪽 끝에 나사로 세면합니다.
- 용매 린핀셋을 사용하여 각 셀 위에 연소 유리 섬유 필터를 놓습니다. 그런 다음 필터 플런저를 사용하여 필터를 셀로 부드럽게 천천히 누릅니다.
- 각 샘플에 대해 셀바디(예: 1 -22)로 라벨을 지정하고 빈 셀에 "공백"을 작성합니다.
- 비블랭크를 투이코러스 어스(또는 모래)로 채우고 캡을 두 번째 끝 캡으로 채웁니다. 손으로 조입니다.
3. 샘플 준비
- 연소된 계량 주석을 실험실 규모에 놓고 용기를 놓습니다.
- 용매로 실험실 주걱을 헹구고 적절한 양의 샘플을 계량 주석으로 전송하고 질량을 기록합니다.
- 샘플의 질량은 유기물 함량에 따라 다릅니다. 상대적으로 유기물질 린(marine mud)은 여러 그램을 필요로 할 수 있으며, 유기물질이 풍부한 물질(잎 조직)은 훨씬 적게 필요할 수 있다.
- 계량 주석의 모든 재료를 준비된 ASE 셀로 옮기.
- 다른 유리 섬유 필터를 셀 상단에 놓고 필터 플런저를 사용하여 샘플 상단에 도달할 때까지 천천히 부드럽게 누릅니다.
- 거의 가득 차때까지 세포에 투이토마오스 어스(또는 모래)를 추가합니다. 셀 바디 스레드에서 이물질을 제거하십시오.
- 다른 끝 캡으로 셀 의 상단을 캡합니다.
- 각 샘플에 대해 3.1 - 3.6 단계를 반복합니다.
4. 컬렉션 바이알 준비
- 각 유리병에 해당셀(예: 1 - 22 또는 공백) 및 뚜껑을 ASE 컬렉션 바이알 캡으로 레이블을 지정합니다.
5. 추출
- 각 샘플 셀을 ASE 상단 트레이의 번호가 매겨진 슬롯에 넣습니다.
- 해당 컬렉션 바이알을 아래 ASE 트레이에 동일한 수 슬롯에 배치합니다.
- ASE의 키패드를 사용하여 추출 방법을 만듭니다. 100 °C 및 1,200 psi에서 추출하십시오. 10분의 정적 홀드로 각 샘플을 3배 추출하고 정적 홀드 사이에 총 부피의 50%를 사용하여 셀 바디를 플러시합니다.
- 용매 병에 모든 샘플을 추출하기에 충분한 용매가 포함되어 있는지 확인하십시오.
- ASE 제어 패드의 "헹도" 버튼을 눌러 실행을 시작하기 전에 ASE 3x를 헹군다.
- 시작을 누릅니다.
가속 용매 추출은 많은 수의 지질 퇴적물 샘플에서 유기 바이오마커를 분리하는 데 사용되는 빠르고 효율적이며 처리량이 많은 기술입니다.
전통적으로 초음파 처리 또는 Soxhlet과 같은 추출 방법이 사용되지만 이러한 프로토콜의 단점은 상세한 고기후 재구성을 위한 충분한 물질을 처리하기에는 너무 느리다는 것입니다. 새로운 기술인 가속 용매 추출 또는 ASE 방법은 효율성과 높은 처리량을 염두에 두고 개발되었습니다.
ASE 방법은 고온과 고압의 조합을 사용하여 샘플을 추출하고 비교적 빠른 단일 준비 실행으로 여러 샘플을 수행할 수 있습니다.
이 비디오는 퇴적물에서 바이오마커를 추출하는 방법을 자세히 설명하는 시리즈의 세 번째 비디오입니다. 절차를 다루고 초음파 처리 또는 Soxhlet 추출에 대한 ASE의 장점에 대한 통찰력을 제공합니다.
가속 용매 추출에서는 샘플이 강철 셀에 적재된 다음 캐러셀에 적재됩니다. 각 샘플 셀에 대한 수집 바이알도 별도의 캐러셀에 로드됩니다. 기기는 샘플 셀을 내부 오븐에 로드합니다. 용제는 충분한 압력에 도달할 때까지 일련의 밸브를 통해 솔벤트 병에서 펌핑됩니다.
이 압력은 샘플과 분석물에 의해 결정된 시간 동안 유지됩니다. 그런 다음 용매는 샘플 셀에서 강철 라인을 통해 해당 수집 바이알로 플러시됩니다. 이 과정은 여러 번 반복될 수 있습니다. 온도, 압력 및 지속 시간은 모두 샘플에 맞게 사용자 정의할 수 있습니다.
사용된 고온은 추출의 역학을 증가시키는 반면 높은 압력은 용매가 휘발되는 것을 방지합니다. 수집 바이알에는 이제 총 지질 추출물이 포함되어 있으며, 샘플 셀에 남아 있는 것을 잔류물이라고 합니다. 그것은 비유기 물질뿐만 아니라 케로겐(kerogen)이라고 하는 용매 추출할 수 없는 유기 물질로 구성됩니다.
이제 가속 용매 추출의 원리에 익숙해졌으므로 실험실에서 이것이 어떻게 수행되는지 살펴보겠습니다.
관심 샘플을 수집한 후; 동결 건조, 균질화 및 오염 제거는 이 시리즈의 다른 비디오에서 보여줍니다.
모든 샘플이 준비되면 추출할 각 샘플에 대해 하나의 셀을 조립하고 블랭크를 위해 하나의 추가 셀을 조립합니다. 이렇게하려면 엔드 캡을 세포체에 나사로 고정하십시오. 솔벤트로 헹궈낸 핀셋을 사용하여 각 핀셋 위에 연소된 유리 섬유 필터를 놓습니다. 플런저로 필터를 천천히 부드럽게 누릅니다.
각 샘플에 대해 번호로 세포체를 라벨링하고 공백에 별도로 라벨을 붙입니다.? 연소된 계량 통을 실험실 저울에 놓고 용기를 쥔다. 주걱을 용매로 헹군 다음 이를 사용하여 5-10g의 샘플을 계량 통에 옮기고 질량을 기록합니다.
계량 통의 모든 물질을 해당 셀로 옮깁니다. 그 위에 다른 유리 섬유 필터를 놓고 샘플 상단에 도달할 때까지 부드럽게 탬핑합니다.
규조토나 모래와 같은 분산제를 거의 가득 찰 때까지 첨가하고 세포체 실에 파편이 들어가지 않도록 주의하십시오. 셀 상단을 다른 엔드 캡으로 덮습니다. 각 샘플과 블랭크에 대해 이 단계를 반복합니다.
각 수집 바이알에 해당 샘플 셀 또는 블랭크 번호를 표시하고 바이알 캡으로 캡을 씌웁니다. 각 셀을 상단 ASE 트레이의 번호가 매겨진 슬롯에 놓습니다. ASE의 키패드를 사용하여 추출 방법에 대한 매개변수를 설정하여 100에서 추출합니다. C?및 1,200psi. 10분의 정적 홀드로 각 샘플을 3회 추출하고 정적 홀드 사이에서 총 부피의 50%로 세포체를 플러시합니다.
다음으로, 용매 병에 모든 샘플을 추출할 수 있을 만큼 충분히 포함되어 있는지 확인합니다. 실행을 시작하기 전에 악기 라인을 3번 헹굽니다. 마지막으로 시작을 누릅니다.
ASE에서 바이알을 꺼냅니다. 이제 바이오마커를 추출했으므로 분석 전에 정제해야 합니다.
가속 용매 추출은 다양한 응용 분야에 활용할 수 있는 다목적 기술이며, 그 중 일부는 여기에서 다루고 있습니다.
가속 용매 추출은 식품을 포함한 다른 유형의 샘플에도 사용할 수 있습니다. 살충제 오염 테스트를 위한 잔류물 분석은 과일이나 채소와 같은 식품의 안전성과 품질을 확인하기 위해 규제 및 산업 시설에서 자주 수행됩니다. ASE는 식품 샘플에서 유기염소계 살충제를 추출하고 농산물에 존재하는 잔류물의 유형 또는 수준을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 이 정보를 사용하여 농산물이 사람 또는 동물의 소비에 적합한지 여부를 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 딜드린은 제품에 따라 식품에서 0에서 0.1ppm 이내에서 발견되어야 합니다.
식품 영양 성분도 ASE를 사용하여 추출할 수 있습니다. 예를 들어, 중량 측정 지방 함량이 높을 수 있는 초콜릿과 같은 제품을 추출할 수 있습니다. 석유 에테르와 함께 ASE를 용매로 사용하면 초콜릿 샘플에서 지방을 분리하고 정량 분석을 통해 알려진 초콜릿 양당 정확한 지방 함량 백분율을 결정할 수 있습니다. 규제 기관은 이 정보를 사용하여 초콜릿 제조업체의 주장을 검증하거나 정확한 식품 라벨을 만들기 위한 정보를 얻을 수 있습니다.
방금 가속 용매 추출(ASE)을 사용한 지질 바이오마커 추출에 대한 JoVE의 소개를 시청했습니다. 추가 처리 및 분석 방법은 후속 비디오에서 찾을 수 있습니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
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Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.