qPCR을 사용하여 환경 미생물 및 바이러스 정량화

1. 샘플 수집

1. 오거 나 삽을 사용하여 토양을 결정된 깊이로 수집합니다. 뿌리 부류에서 토양을 수집하는 경우, 뿌리에서 초과 토양을 타격하고 수집 배럴에 원하는 토양을 긁어, 식물 뿌리 주위에 7mm 이내에 토양을 수집합니다.
2. 멸균 된 날진 병을 디핑 스틱에 넣습니다. 스틱의 끝을 잡고 병을 잠그고 물을 수집합니다. 병을 얼음으로 시원한 곳에 넣습니다.
3. 샘플을 실험실로 옮기.

2. 핵산 추출

1. 수집된 샘플에서 미생물을 분리하고 DNA 및/또는 RNA를 추출하려면 지역 사회 핵산 추출에 대한 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.

3. 역전사

1. 분석되는 유전 물질이 RNA인 경우 PCR로 진행하기 전에 역전사를 통해 상호 보완적인 DNA(cDNA)를 생성하는 데 사용해야 합니다. 자세한 내용은 RT-PCR의 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.

4. qPCR 설정

1. -20°C에 저장된 시약을 검색하고 얼음이나 깨끗한 후드 내부의 실온에서 해동하십시오. 이 예에서 사용되는 시약은 qPCR 반응 혼합(사용된 qPCR 기계에 의존; DNA 폴리머라아제 포함), 전방 및 역프라이머 및 TaqMan 프로브를 포함한다. 프라이머 및 프로브 서열은 열거되는 유기체에 특정한 서열로 설계되었습니다. 관심 있는 순서를 찾으려면 현재 문헌을 참조하십시오. 이 예에서는 로슈 라이트 사이클러 480 프로브 믹스 시약 시스템이 사용됩니다. 후추 온화한 걸레 바이러스는 물 견본에 내각화될 것입니다. ^1,2 프라이머 및 프로브 시퀀스에 대한 표 1을 참조하십시오.
2. 실온에서 추출된 (c) DNA를 샘플과 양성 대조군 DNA(세균 플라스미드로 복제한 유기체 특이적 서열로 구성된).
3. 96웰 qPCR 플레이트와 유사한 96셀 테이블 템플릿을 준비합니다. 각 셀에 플레이트에 로드되는 반응으로 레이블을 지정합니다. 삼중항제의 각 샘플 및 표준에 대한 반응뿐만 아니라 DNA 반응과 같은 양성 제어 및 부정적인 제어를 포함한다.
4. 제조업체의 지침과 문헌에 따라 반응 중 일정한 시약을 모두 포함하는 반응 "마스터 믹스"에 필요한 시약 볼륨을 계산합니다. 모든 샘플과 컨트롤에 대한 트리플리케이트 반응에 충분한 마스터 믹스를 준비하고, 파이펫팅 오류를 고려하여 추가 10%를 준비합니다. 샘플 마스터 믹스 레시피의 경우 표 2를참조하십시오.
5. 모든 시약이 완전히 해동되면 깨끗한 후드 내부에서 작업하면 계산된 양의 계산된 양을 1.5mL 저결합 미세 분리 튜브에 추가하여 마스터 믹스를 만듭니다. 소용돌이와 짧게 작은 심근을 추가하기 전에 각 시약을 최소화합니다. 오염을 방지하고 정확한 농도를 보장하기 위해 각 시약 사이에 파이펫 팁을 변경합니다. 모든 시약이 추가 된 후, 소용돌이와 동질성을 보장하기 위해 마스터 믹스와 미니 원심 분리튜브.
6. Aliquot 는 96웰 PCR 플레이트에서 지정된 각 에 마스터 믹스의 적절한 볼륨을 잘 지정합니다.
7. 지정된 우물에 (c) DNA 샘플, 양성 제어 플라스미드 및 음수 조절(분자 등급 물)의 적절한 부피를 추가합니다.
8. 모든 샘플과 컨트롤이 추가되면 밀봉 호일로 플레이트를 밀봉하십시오. 밀봉 도구를 사용하여 호일 아래에서 공기를 밀어 내고 거품을 방지하십시오. 호일의 가장자리를 조심스럽게 찢습니다.
9. 원심 분리기 는 원심분리기에서 밀봉된 96웰 플레이트를 플레이트 홀더로 하여 각 우물의 바닥에 혼합물을 수집합니다. 카운터웨이트 플레이트를 사용하여 원심분리기가 회전하는 동안 제대로 균형을 이루도록 해야 합니다. 최대 1000rpm의 펄스 원심분리기를 한 다음 원심분리기를 브레이크 없이 천천히 멈춥시게 합니다.

5. qPCR 작동

1. 밀봉 된 96 웰 플레이트를 qPCR 기계에 넣습니다. 컴퓨터가 시작할 준비가 되었는지 확인합니다.
2. qPCR 기계 지침을 따라 소프트웨어에서 필요한 모든 정보를 올바르게 입력한 다음 qPCR 컴퓨터를 실행하도록 설정합니다.
3. 기계가 실행을 완료한 후, 소프트웨어는 양수 제어의 알려진 농도를 사용하여 각 반응에서 cDNA의 양을 계산할 수 있습니다. 원래 샘플에서 바이러스의 양은 DNA 샘플을 얻기 위해 수행 희석, 여과, 농도, 증폭 및/또는 추출 공정에 기초하여 계산될 수 있다.

시약	시퀀스 (5' → 3')	부피(μL/웰)	최종 Conc.
포워드 프라이머	GAGTGGTTGACCTTAACGTTTGA	2.25	900 nM
역프라이머	TTGTCGGTTGCAATGCAAAAAGT	2.25	900 nM
탐침	FAM-CCTACCGAAGCAAATG-BHQ1	1.0	200 nM

표 1. 고추 온화한 걸레 바이러스를 검출하기위한 샘플 프라이머 및 프로브 시퀀스.

시약	부피(μL/웰)	우물 수	마스터 믹스 볼륨 (μL)
LC 480 믹스	12.5	26	325
분자 H2O	4.5		117
포워드 프라이머	2.25		58.5
역프라이머	2.25		58.5
탐침	1.0		26
합계	22.5		585

표 2. 개별 반응 및 마스터 믹스에 대한 시약 볼륨.