2.11: 물 샘플에서 분변 박테리아 여과 분리

1. 물 샘플 수집 및 처리

1. 시험수원(예: 분수, 수영장, 저수지, 물 분배 시스템, 원시 또는 처리된 하수)에서 1-L 수질 샘플을 수집하고 미생물 분석을 위해 얼음으로 운반합니다.
2. 자동 분해, UV 방사선(2분) 또는 에탄올 화염 점화에 대한 노출에 의해 사용하기 전에 멤브레인 여과 매니폴드 어셈블리를 살균하거나 살균한다.
3. 모든 부품을 냉각하면 진공 펌프와 표백제가 들어있는 진공 여과 폐기물 플라스크에 매니폴드를 적절하게 연결하십시오.
4. 에탄올-화염은 한 쌍의 포셉을 살균하고 그들과 함께 포장에서 멸균된 격자 멤브레인 필터를 제거합니다. 직경 47mm의 직경은 0.45 μm 크기의 모공 크기가 전형적으로 사용됩니다. 그러나, 대체 직경 및 모공 크기는 모공 크기가 표적 미생물(들)을 충분히 함정에 빠뜨릴 수 있고, 필터 영역의 70% 이상이 모공 공간으로 구성된경우 사용될 수 있다.
5. 필터를 매니폴드의 멤브레인 여과 영역의 중앙에 놓고 멸균 필터 깔때기를 장치에 적용하여 제자리에 고정시킵니다.
6. 원하는 양의 테스트워터(예: 100mL)를 측정하고 깔때기에 추가합니다(깔때기에서 100mL 라인 마크가 표시됩니다).
7. 필터를 통해 테스트 샘플을 그리기 위해 부분 진공 [34 ~ 51 kPa (킬로파스칼)의 압력 차동]을 적용합니다. 박테리아 및 부패 유기물을 포함한 총 정지 된 고체 물질은 필터보다 큰 0.45 μm의 기공 크기가 필터에 갇혀 있습니다. 소량의 유기물 및 염과 같은 바이러스 및 용존 고체를 포함한 작은 입자는 멤브레인을 통과하고 표백제가 들어있는 폐기물 용기 진공 플라스크로 전달됩니다.
8. 필터를 통해 시료의 완전한 통과에 따라, 멸균물의 2~3mL 부피로 깔때기의 내부를 헹구는 다.
9. 진공을 전원을 끄고 최종 헹구면 매니폴드에서 깔때기를 제거합니다.
10. 에탄올-화염 살균 포셉을 사용하면 즉시 장치에서 멤브레인 필터를 제거하고 표적 미생물에 대한 적절한 성장 아가로즈 배지에 즉시 배치합니다(표1은 각각에 대한 권장 성장 배지 및 배양 조건을 나열합니다).
11. 상기 멤브레인 필터를 롤형 모션으로 아가로즈 표면에 적용하여 성장 배지와 멤브레인의 완전한 접촉을 보장하고 기포의 함정을 피한다.
12. 사용된 여과 깔때기를 각 시료의 처리 사이에 멸균 장치로 교체하고, 교차 오염을 방지하기 위해 스테인레스 스틸 매니폴드를 살균한다.

2. 식민지 열거

1. 인큐베이션 기간에 따라, 열거하기 위해 인큐베이터에서 성장 판을 제거한다.
2. 이상적으로, 시원하고 백색 광원을 사용하여 저전력 배율하에서 식민지 수를 수행하십시오.
3. 총 대장균
   1. 총 대장균 콜로니는 일반적으로 금속 표면 광택과 색상의 어두운 빨간색에 분홍색입니다. 광택 자체는 부분적으로 또는 완전히 식민지를 커버 할 수 있습니다. 비정형 총 대장균 식민지 형태학은 광택없이 어두운 빨간색, 점막, 또는 핵수 있습니다.
   2. 분홍색, 파란색, 흰색 또는 광택이 부족하면서 무색 식민지는 비 대장균으로 간주됩니다.
4. 대변 대장균
   1. 배설물 대장균 식민지는 파란색의 다양한 음영으로 나타납니다.
   2. 비균 대장균 콜로니는 회색에서 크림색으로 변합니다.
5. 대변 엔토코커스
   1. 배설물 엔토코치 콜로니가 분홍색에서 진한 빨간색까지 다양합니다.

3. 식민지 검증

1. 총 대장균
   1. 존재 부재 검증을 위해 멸균 접종 루프를 사용하여 전체 멤브레인을 면봉하십시오. 식민지의 경우, 적어도 5개의 전형적인 비정형 형태학을 확인하는 것이 바람직하다.
   2. 선택한 식민지를 더럼 튜브가 있는 월계수 트립토세 국물을 함유한 유리 용기로 옮기다. 접종된 튜브를 35±0.5°C에서 48h로 배양한다. 가스 생산과 함께 성장을 나타내는 탁도의 존재는 대장균으로 식민지를 확인합니다.
2. 대변 대장균
   1. 더럼 튜브를 함유한 멸균 EC 배지를 함유한 유리 용기에 무균으로 무균으로 파란색의 콜로니를 옮기. 접종된 튜브를 44.5 ± 0.2°C에서 24시간 동안 배양한다. 가스 생산과 함께 성장을 나타내는 탁도의 존재는 배설물 대장균으로 식민지를 확인합니다.
3. 대변 엔토코커스
   1. 뇌 심장 주입 Agar (BHIA)에 무균적으로 격리배설장 내구 균형성을 나타내는 스트라이크 콜로니, 24~48시간 동안 35± 0.5°C에서 배양한다.
   2. BHIA의 고립된 식민지에서 두 개의 미리 세척된 유리 슬라이드로 성장을 이전합니다.
   3. 미끄럼에 준비된 얼룩에 과산화수소 3% 2~3방울을 추가합니다. 거품의 급속한 외관은 "카탈라아제 양성" 결과를 나타내며, 분리는 배설물 연쇄상 구균 박테리아가 아닙니다.
   4. "카탈라아제 네거티브"(관찰된 거품 없음)로 테스트를 격리하기 위해 그램 얼룩을 수행합니다. 대변 장구균은 그램 양성, ovoid, 쌍 또는 짧은 사슬에 주로 나타납니다.

표 1. 환경 샘플에서 배설물 세균 지표 검출을 위한 일반적으로 사용되는 배양 성장 매체
¹ 물 및 폐수 검사표준방법(미국 공중보건 연합 및 미국 수자원 공사 협회, 22일판, 2012)

멤브레인 여과 및 수집된 박테리아의 후속 배양은 수원의 품질과 청결도를 평가하는 데 유용한 기술입니다.

농업, 레크리에이션 또는 가정 환경에서 사용하도록 예정된 수질은 수인성 질병의 발병 가능성으로 인해 매우 중요합니다. 물이 동물이나 인간의 배설물로 오염되면 병원성 기생충, 박테리아 또는 바이러스가 섭취 시 새로운 숙주로 퍼질 수 있습니다. 따라서 이러한 질병을 유발하는 유기체에 대한 수원을 모니터링하는 것은 공중 보건을 보장하는 데 매우 중요합니다.

수원에 존재할 수 있는 분변-구강 병원체의 수와 다양성으로 인해 각각에 대해 독립적이고 정기적으로 분석하는 것은 비현실적입니다. 대신, 수질에 대한 일반적인 미생물 분석은 대장균군 지표 박테리아를 사용합니다. 이 과정에 대한 자세한 내용은 지표 유기체에 대한 이 컬렉션의 비디오를 참조하십시오.

이 비디오는 환경 용수 샘플에 대한 멤브레인 여과 과정을 설명하고, 총 대장균군, 분변성 대장균군 및 분변성 장구균을 포함한 여러 유형의 분변 지표 박테리아를 배양하는 방법을 보여주고, 분변 오염의 존재를 확인하는 방법을 설명합니다.

멤브레인 여과 기술은 음압을 사용하여 물 샘플을 필터 전체로 끌어들이고 박테리아를 가둡니다. 필터는 최소 평균 공극 크기가 0.45μm인 특수 멤브레인으로, 일반적으로 약 1μm 크기의 박테리아를 포획할 수 있습니다. 여과 후, 멤브레인을 아가로스 성장 배지에 적용하고 표적 미생물을 배양하기에 적합한 조건에서 배양합니다.

이 기술은 식수, 수영장 또는 호수 및 저수지와 같은 탁도가 낮은 공급원에 가장 이상적입니다. 입자상 물질 함량이 높은 물은 필터를 오염시키거나 막혀 처리할 수 있는 양을 제한할 수 있습니다. 또한, 멤브레인 여과는 많은 수의 배경 박테리아를 포함하는 수원 또는 미처리 하수와 같은 비대장균군 박테리아를 포함하는 수원에 대해 실용적이지 않으며, 이는 배양 및 배양 시 표적 대장균군을 열거하는 어려움을 증가시킬 수 있기 때문입니다.

박테리아 샘플이 필터에 갇히면 성장판으로 옮겨 물 샘플에 존재하는 지표 박테리아의 유형을 결정할 수 있습니다. 다양한 매체 유형의 도금은 다양한 박테리아 유형을 선택하고 신속한 식별을 가능하게 할 수 있습니다.

배양 특이적 플레이트에서 성장한 후, 액체 배지로 콜로니를 선택하고 더럼 튜브를 사용하여 가스를 포집하는 등의 기술을 사용하여 지표 박테리아 식별을 추가로 확인할 수 있으며, 이는 분변성 대장균군 또는 총 대장균군이 있는 경우에만 생성되어야 합니다. 또한, 의심되는 분변성 장내구균은 그람 염색 양성 결과와 과산화수소-카탈라아제 검사 음성으로 확인할 수 있습니다.

이제 물 샘플의 멤브레인 여과 원리에 대해 잘 알았으므로 이 절차가 어떻게 수행되는지 살펴보겠습니다.

절차를 시작하려면 먼저 관심 있는 테스트 수원에서 물 샘플을 수집합니다. 샘플이 멸균 1-L 병에 수집되었는지 확인합니다. 채취가 완료되면 샘플을 얼음 위에 올려 놓고 미생물 분석을 위해 실험실로 운반합니다.

분석을 시작하려면 먼저 멤브레인 여과 매니폴드를 멸균합니다. 다음으로, 매니폴드를 진공 펌프와 표백제가 포함된 여과 폐플라스크에 연결합니다.

에탄올은 겸자를 화염 살균하고 포장에서 멸균 격자 멤브레인을 제거합니다. 매니폴드의 멤브레인 여과 영역 중앙에 필터를 놓고 멸균 필터 깔때기를 장치에 적용한 다음 제자리에 고정합니다.

깔때기에 원하는 양의 테스트 물을 측정합니다. 필터를 통해 테스트 샘플을 추출하기 위해 부분 진공을 적용합니다. 박테리아 및 기타 유기물을 포함한 0.45μm 이상의 부유 고체 물질은 필터 내부 또는 내부에 갇히고 더 작은 입자, 바이러스 및 용해된 고형물은 표백제가 포함된 폐 플라스크로 통과합니다.

샘플이 필터를 통과한 후 깔때기 내부를 멸균수 25mL로 3회 헹구어 필터를 통과하도록 합니다. 최종 헹굼이 완료되면 진공 청소기를 분리하고 매니폴드에서 깔때기를 제거합니다.

다음으로, 에탄올 겸자를 화염 살균하고 즉시 장치에서 멤브레인 필터를 제거합니다. 롤링 동작을 사용하여 대상 미생물에 적합한 성장판에 올려 놓아 표면과 완전히 접촉하고 기포가 갇히는 것을 방지합니다.

각 추가 샘플을 처리하려면 스테인리스 스틸 매니폴드를 소독하고 멸균 깔때기를 사용하여 교차 오염을 방지합니다. 마지막으로, 적절한 배양 기간 동안 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.

배양 기간이 끝나면 계수를 위해 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 가능하면 시원한 백색 광원을 사용하여 저전력 배율에서 콜로니 계수를 수행합니다. 총 대장균군을 측정하려면 분홍색에서 짙은 빨간색으로 나타나고 군체를 전체 또는 부분적으로 덮고 있는 금속 표면 광택이 있는 군체를 식별하고 계산합니다. 비정형 총 대장균군 군집은 짙은 빨간색, 점액성 또는 광택 없이 핵이 있는 것처럼 보일 수 있습니다.

광택 없이 파란색, 흰색, 무색 또는 분홍색으로 나타나는 집락은 대장균군이 아닌 것으로 간주되며 총 대장균군 수에 포함되어서는 안 됩니다.

분변성 대장균군 군집은 다양한 파란색 음영으로 나타나며 이는 별도의 범주로 계산되어야 합니다. 비분변성 대장균군 군집은 일반적으로 회색에서 크림색이며 개별 범주에도 기록해야 합니다. 마지막으로, 분변성 장내구균 집락은 분홍색에서 짙은 빨간색까지 다양하며 별도로 계산해야 합니다.

총 대장균군 군집을 확인하려면 멸균 및 냉각된 접종 루프를 단일 관심 군체에 적용합니다. 선택한 콜로니를 라우릴 트립토스 육수와 더럼 튜브가 들어 있는 유리 용기로 옮깁니다. 다음으로, 배양물을 인큐베이터에 넣습니다. 더럼 튜브(Durham tube)에 의해 포착된 가스 생산과 함께 탁도의 존재는 이 군체가 총대장균군임을 입증합니다.

분변성 대장균군 검증을 위해 파란색 콜로니를 멸균 EC 배지와 Durham 튜브가 들어 있는 유리 용기로 무균 방식으로 옮깁니다. 접종된 튜브를 인큐베이터에 넣습니다. 배양 후, 가스 생산과 함께 탁한 접종은 군체가 분변성 대장균군임을 확인합니다.

분변성 장구균을 확인하기 위해, 올바른 형태를 가진 의심되는 집락을 Brain-Heart Infusion Agar 플레이트로 무균 방식으로 옮기고 배양합니다. 다음으로, PHIA의 고립된 군체에서 두 개의 멸균 유리 슬라이드로 성장을 옮깁니다.

유리 슬라이드 중 하나에 3% 과산화수소 2-3방울을 추가합니다. 빠른 가스 생성은 시트로박터(Citrobacter)와 같은 카탈라아제 양성 박테리아를 나타냅니다. 분변 장내구균 박테리아는 카탈라아제 음성입니다. 따라서 버블링이 관찰되지 않습니다. 버블링이 나타나지 않는 카탈라아제 음성 콜로니의 경우 그람 염색을 수행합니다. 분변성 장내구균으로서, 이들은 그람 양성으로 나타나야 하고, 모양이 난형이어야 하며, 대부분 쌍 또는 짧은 사슬로 그룹화되어야 합니다.

수원에서 이러한 지표 박테리아 중 하나라도 발견되면 오염이 있음을 나타냅니다. 한 달 동안 샘플의 5% 이상이 오염된 것으로 밝혀지면 해당 소스는 사람이 섭취하기에 적합하지 않은 것으로 간주될 수 있습니다.

멤브레인 여과는 여러 생물학적 응용 분야에서 일반적으로 사용되며 분변 지표 유기체는 다른 실험 절차로도 검출할 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램 중 일부는 여기에서 탐색됩니다.

멤브레인 여과는 물 샘플에서 바이러스를 포집하는 데에도 사용할 수 있습니다. 바이러스는 일반적으로 매우 낮은 수준으로 존재하기 때문에 분석을 위해 바이러스를 포획하기 위해 물 샘플을 농축해야 합니다. 그런 다음 포획된 바이러스를 필터에서 방출하고 세포 배양 감염성 분석 또는 PCR과 같은 기술을 사용하여 식별할 수 있습니다.

멤브레인 여과는 산업용 또는 실험실용 고순도 물 생산에도 사용됩니다. 많은 산업에서 운영 프로세스를 위해 고도로 정제된 물이 필요하며, 멤브레인 여과는 물에서 원치 않는 용해 금속 및 염을 포함한 오염 물질을 제거하는 역할을 할 수 있습니다. 또한 식수를 생산하기 위해 염수의 담수화에 사용할 수 있습니다.

멤브레인 여과를 통해 물 속의 지표 유기체를 식별하는 방법에 대한 JoVE의 소개를 시청했습니다. 이제 물 샘플을 멤브레인 여과하는 방법, 멤브레인에서 여러 유형의 분변 지표 박테리아를 배양하는 방법, 이를 지표 유기체로 확인하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!