물 샘플에서 분변 박테리아 여과 분리

1. 물 샘플 수집 및 처리

1. 시험수원(예: 분수, 수영장, 저수지, 물 분배 시스템, 원시 또는 처리된 하수)에서 1-L 수질 샘플을 수집하고 미생물 분석을 위해 얼음으로 운반합니다.
2. 자동 분해, UV 방사선(2분) 또는 에탄올 화염 점화에 대한 노출에 의해 사용하기 전에 멤브레인 여과 매니폴드 어셈블리를 살균하거나 살균한다.
3. 모든 부품을 냉각하면 진공 펌프와 표백제가 들어있는 진공 여과 폐기물 플라스크에 매니폴드를 적절하게 연결하십시오.
4. 에탄올-화염은 한 쌍의 포셉을 살균하고 그들과 함께 포장에서 멸균된 격자 멤브레인 필터를 제거합니다. 직경 47mm의 직경은 0.45 μm 크기의 모공 크기가 전형적으로 사용됩니다. 그러나, 대체 직경 및 모공 크기는 모공 크기가 표적 미생물(들)을 충분히 함정에 빠뜨릴 수 있고, 필터 영역의 70% 이상이 모공 공간으로 구성된경우 사용될 수 있다.
5. 필터를 매니폴드의 멤브레인 여과 영역의 중앙에 놓고 멸균 필터 깔때기를 장치에 적용하여 제자리에 고정시킵니다.
6. 원하는 양의 테스트워터(예: 100mL)를 측정하고 깔때기에 추가합니다(깔때기에서 100mL 라인 마크가 표시됩니다).
7. 필터를 통해 테스트 샘플을 그리기 위해 부분 진공 [34 ~ 51 kPa (킬로파스칼)의 압력 차동]을 적용합니다. 박테리아 및 부패 유기물을 포함한 총 정지 된 고체 물질은 필터보다 큰 0.45 μm의 기공 크기가 필터에 갇혀 있습니다. 소량의 유기물 및 염과 같은 바이러스 및 용존 고체를 포함한 작은 입자는 멤브레인을 통과하고 표백제가 들어있는 폐기물 용기 진공 플라스크로 전달됩니다.
8. 필터를 통해 시료의 완전한 통과에 따라, 멸균물의 2~3mL 부피로 깔때기의 내부를 헹구는 다.
9. 진공을 전원을 끄고 최종 헹구면 매니폴드에서 깔때기를 제거합니다.
10. 에탄올-화염 살균 포셉을 사용하면 즉시 장치에서 멤브레인 필터를 제거하고 표적 미생물에 대한 적절한 성장 아가로즈 배지에 즉시 배치합니다(표1은 각각에 대한 권장 성장 배지 및 배양 조건을 나열합니다).
11. 상기 멤브레인 필터를 롤형 모션으로 아가로즈 표면에 적용하여 성장 배지와 멤브레인의 완전한 접촉을 보장하고 기포의 함정을 피한다.
12. 사용된 여과 깔때기를 각 시료의 처리 사이에 멸균 장치로 교체하고, 교차 오염을 방지하기 위해 스테인레스 스틸 매니폴드를 살균한다.

2. 식민지 열거

1. 인큐베이션 기간에 따라, 열거하기 위해 인큐베이터에서 성장 판을 제거한다.
2. 이상적으로, 시원하고 백색 광원을 사용하여 저전력 배율하에서 식민지 수를 수행하십시오.
3. 총 대장균
   1. 총 대장균 콜로니는 일반적으로 금속 표면 광택과 색상의 어두운 빨간색에 분홍색입니다. 광택 자체는 부분적으로 또는 완전히 식민지를 커버 할 수 있습니다. 비정형 총 대장균 식민지 형태학은 광택없이 어두운 빨간색, 점막, 또는 핵수 있습니다.
   2. 분홍색, 파란색, 흰색 또는 광택이 부족하면서 무색 식민지는 비 대장균으로 간주됩니다.
4. 대변 대장균
   1. 배설물 대장균 식민지는 파란색의 다양한 음영으로 나타납니다.
   2. 비균 대장균 콜로니는 회색에서 크림색으로 변합니다.
5. 대변 엔토코커스
   1. 배설물 엔토코치 콜로니가 분홍색에서 진한 빨간색까지 다양합니다.

3. 식민지 검증

1. 총 대장균
   1. 존재 부재 검증을 위해 멸균 접종 루프를 사용하여 전체 멤브레인을 면봉하십시오. 식민지의 경우, 적어도 5개의 전형적인 비정형 형태학을 확인하는 것이 바람직하다.
   2. 선택한 식민지를 더럼 튜브가 있는 월계수 트립토세 국물을 함유한 유리 용기로 옮기다. 접종된 튜브를 35±0.5°C에서 48h로 배양한다. 가스 생산과 함께 성장을 나타내는 탁도의 존재는 대장균으로 식민지를 확인합니다.
2. 대변 대장균
   1. 더럼 튜브를 함유한 멸균 EC 배지를 함유한 유리 용기에 무균으로 무균으로 파란색의 콜로니를 옮기. 접종된 튜브를 44.5 ± 0.2°C에서 24시간 동안 배양한다. 가스 생산과 함께 성장을 나타내는 탁도의 존재는 배설물 대장균으로 식민지를 확인합니다.
3. 대변 엔토코커스
   1. 뇌 심장 주입 Agar (BHIA)에 무균적으로 격리배설장 내구 균형성을 나타내는 스트라이크 콜로니, 24~48시간 동안 35± 0.5°C에서 배양한다.
   2. BHIA의 고립된 식민지에서 두 개의 미리 세척된 유리 슬라이드로 성장을 이전합니다.
   3. 미끄럼에 준비된 얼룩에 과산화수소 3% 2~3방울을 추가합니다. 거품의 급속한 외관은 "카탈라아제 양성" 결과를 나타내며, 분리는 배설물 연쇄상 구균 박테리아가 아닙니다.
   4. "카탈라아제 네거티브"(관찰된 거품 없음)로 테스트를 격리하기 위해 그램 얼룩을 수행합니다. 대변 장구균은 그램 양성, ovoid, 쌍 또는 짧은 사슬에 주로 나타납니다.

대변 세균 지표	추천 미디어 (인큐베이션 온도, 시간) 1
총 대장균	레 엔도 아가르 (35 ± 5 °C, 24 h) M-엔도 미디엄 (35 ± 5 °C, 24 h)
대변 대장균	m-FC 미디엄 (44.5 ± 0.2°C, 24h)
대변 엔토코커스	m 엔테로코커스 마가르 (35 ± 0.5 °C, 48 h)

표 1. 환경 샘플에서 배설물 세균 지표 검출을 위한 일반적으로 사용되는 배양 성장 매체
¹ 물 및 폐수 검사표준방법(미국 공중보건 연합 및 미국 수자원 공사 협회, 22일판, 2012)