화합물 투여 III
출처: 케이 스튜어트, RVT, RLATG, CMAR; 발레리 A. 슈뢰더, RVT, RLATG. 노틀담 대학교, IN
실험실 마우스와 쥐에서 화합물 관리를 위한 많은 일반적으로 사용 되는 경로. 그러나, 특정 프로토콜 은 상인, 비강 내 및 두개 내 주사를 포함하여…
1. 인트레이더말 관리
- 대부분의 상인 주사는 수성 기반 화합물. 주사 부위에서 조직 괴사를 피하기 위해 중성 pH를 갖기 위해 생리적으로 완충되어야 한다.
- 바늘 크기 범위는 25-30 게이지이며 가능한 가장 작습니다.
- 주사 부위당 투여량 범위는 50-100 μL입니다. 과도한 부피를 주입하면 주사 부위에 괴사또는 압력으로 인해 화합물이 누출될 수 있다.
- 빈상인 공간에 바늘을 정확하게 배치하려면 쥐와 쥐를 마취할 필요가 있습니다. 흡입 마취는 급속한 유도 및 회복을 허용합니다; 그러나, 주 사용 마취는 지역의 준비를 위한 충분한 시간을 제공하고 주입을 능력을 발휘하는 장점이 있습니다. 1
- 탈필 크림을 사용하거나 부위를 면도하여 주사 부위에서 머리카락을 제거하십시오.
- 잔류 제분 크림이나 헤어 이물질을 철저히 제거하십시오.
- 요오드 용액, 클로르헤시딘 용액 또는 알코올과 같은 국소 살균제를 적용하십시오.
- 관리 절차
- 엄지와 검지 손가락 사이에 팽팽한 피부를 스트레칭합니다. 이것은 바늘을 배치 할 때 피부에 안정성을 제공합니다.
- 바늘을 피부에 베를 놓습니다.
- 표피와 진피 사이에 피부에 바늘을 부드럽게 삽입합니다. 바늘을 배꼽 너머로 전진시다.
- 물질을 천천히 주입하십시오. 화합물의 주입은 피부에 출혈, 또는 작은 물집을 만들 것입니다.
- 바늘을 철회하기 전에 피부가 스트레칭하고 조정할 수 있도록 주입 후 일시 중지합니다.
- 예방 조치
- 플런저를 다시 당기는 것은 필요하지 않습니다.
- 바늘이 피하 공간에 삽입되면 출혈이 형성되지 않습니다. 너무 깊이 주입 피하 주사 결과.
- 화합물이 주입 부위에서 누출될 수 있으므로 부위를 블로팅하거나 닦지 마십시오.
- 여러 주사를 수행 할 때, 블렙이 겹치지 않도록 그들을 공간.
그림 1. 쥐에서 상인 주사.
2. 비강 내 관리
- 설비
- 정확한 볼륨을 제공하기 위해 보정할 수 있는 마이크로파이프팅 유닛 파이펫을 사용합니다.
- 일회용 파이펫 팁은 교차 오염을 방지하기 위해 사용되어야 합니다. 결핵 주사기, 무딘 바늘 및 유연한 튜브도 투약에 사용할 수 있습니다.
- 쥐에 대한 총 사출 부량은 40-100 μL을 초과해서는 안되며 6-10 μL 방울로 주어져야합니다. 마우스의 경우 최대 총 부피는 24 μL이며 3-4 μL 방울로 제공됩니다.
- 의식적인 동물의 행정
- 의식동물의 수동 구속은 피펫 팁이나 무딘 바늘이 화합물을 전달하기에 충분히 가까이 배치될 수 있도록 머리가 상대적으로 움직이지 않도록 해야 하지만, 비강을 찌르거나 레이스화하는 것만큼 가깝지 않다.
- 동물을 억제하고 수직 위치에 고정합니다.
- 비강 개구부에 액체 화합물의 작은 방울을 놓습니다. 동물은 물방울을 흡입해야합니다.
- 전체 볼륨이 주어질 때까지 nares를 번갈아 가며 추가 볼륨을 관리합니다.
- 더 큰 볼륨을 투여 할 때 구속 하는 동안 가슴을 수축 하지 않는 것이 중요 하다. 가슴 압박은 동물이 기관지와 폐에 액체를 그리기 위해 충분히 심호흡을 하는 능력을 방해합니다.
그림 2. 의식마우스에서 비강 내 투여.
- 무의식적인 동물의 행정
- 흡입 마취제를 사용하면 화합물의 접근 및 전달 중에 고정 된 동물을 허용합니다. 이것은 동물이 투약 장비를 물고, 머리의 경련으로 인한 화합물의 손실, 동물의 비강 조직, 눈 또는 얼굴 피부에 부상을 입을 가능성을 제거합니다. 동물은 또한 흡입 하 고 투여 시 nares에서 화합물을 스프레이 가능성이 적습니다.
- 동물을 척추 위치에 놓습니다. 헤드의 위치는 나레에 솔루션의 배치에 영향을 미칩니다. CNS 전달에 이상적인 위치는 동물 척추와 함께 있음을 입증되었습니다. 이것은 더 나은 흡수를 허용합니다. 2
- 화합물의 절반을 비강 개구부의 한쪽으로 직접 투여하고 흡입으로 타이밍을 맞춰 다. 그런 다음 동물을 뒤집습니다.
- 위와 같이, 다른 비강 개구부로 부피의 나머지 절반을 관리한다.
그림 3. 무의식성 마우스에서 비강 내 투여.
3. 신생아 쥐와 쥐의 두개 내 투여
- 마우스 또는 쥐는 두개 내 주사를 위해 마취되어야 합니다.
| 마우스 | 쥐 | ||
| 나이(일) | 니들 게이지(g) | 나이(일) | 니들 게이지(g) |
| 0-7 | 29-30 | 0-5 | 27-29 |
| 7-14 | 27 | 5-10 | 25-27 |
| 14-28 | 25 | 10-14 | 25 |
| 나이(일) | 바늘 길이(mm) | 나이(일) | 바늘 길이(mm) |
| 0-7 | 2 | 0-4 | 2-3 |
| 7-14 | 3 | 4-7 | 3 |
| 14-21 | 4 | 7-10 | 4 |
| 21-28 | 5 | 10-14 | 5 |
| 나이(일) | 부피(μL) | 나이(일) | 부피(μL) |
| 0-5 | <20 | 1-3 | <20 |
| 6-20 | <60 | 4-10 | <60 |
| 20-28 | <100 | 11-14 | <100 |
표 1. 바늘 게이지, 바늘 길이 및 쥐와 쥐의 나이에 따라 두개 내 투여의 최대 볼륨. 4
- 설비
- 표 1에따라 올바른 바늘 게이지 및 최대 투여 량을 결정합니다.
- 동물을 마취하기 전에 바늘 가드를 준비하십시오.
참고 : 바늘의 주입 깊이는 바늘 캡으로 생성 되는 가드의 사용을 통해 제어 됩니다.- 가드를 만들려면 바늘이 바늘 캡에 대해 측정되고 캡에 마크가 놓아 절단 위치를 나타냅니다. 캡을 바늘에 교체 할 때 바늘의 2 ~ 5mm가 노출되도록 절단해야합니다.
- 노출된 바늘의 길이는 피부와 두개골을 관통하고 뇌의 원하는 깊이에 도달할 만큼 길어야 합니다.
- 마우스와 쥐에 필요한 바늘 길이는 표 1에나열됩니다.
- 새끼의 저체온증을 방지하기 위해 가열 원이 필요합니다. 낮은 전기 난방 패드, 순환 하는 물 담요, 또는 재사용 가능한 화학 반응 열 파우치 : 여러 가지 유형이 있습니다.
- 구속
- 마우스와 쥐 새끼 10 나이 의 일 또는 더 젊은이 절차에 대 한 마취를 필요로 하지 않습니다. 머리 바로 뒤에 그들을 잡고 어깨에 약간의 압력을 넣어 피부 caudally 당겨 수동으로 그들을 억제.
- 이소플루란 흡입으로 10 일 이상 새끼를 마취합니다. 유도 챔버를 정밀 기화기 또는 이소플루란으로 담근 면공을 가진 벨 항아리에 부착하십시오. 강아지가 고정되면 마취는 약 40 초 동안 효과적이며 주입에 충분한 시간을 제공합니다.
- 사출 기술
- 주사기에 물질을 넣고 캡/바늘 가이드를 바늘 위에 놓습니다.
- 신생아 마우스 또는 쥐당 최대 부피로 권장되는 주사 부피는 100 μL이며, 짜는 쥐또는 더 오래된 마우스의 경우 최대 300 μL입니다.
- 신생아의 대뇌 피질에 주입하려면, 눈 뒤에 바늘 5mm를 삽입, 두개골의 중간선에서 약 3mm.
- 짜는 마우스 주입 부위는 눈과 귀 사이의 약 절반 정도이며 중간선 바로 바 떨어져 있습니다.
그림 4. 마우스 새끼의 두개 내 투여.
때때로, 다른 실험적 접근 방식은 설치류에서 덜 일반적으로 사용되는 복합 투여 경로의 사용을 필요로 합니다. 피내(intradermal), 비강내(intranasal), 두개내(intracranial)는 오늘날 생물의학 연구자들이 실험실에서 사용하는 세 가지 대체 경로입니다.
이름에서 알 수 있듯이 피내(intradermal)는 진피의 바깥층으로 화합물을 전달합니다. 비강 내(intranasal)는 동물의 콧구멍에 용액을 삽입하는 것입니다. 그리고 두개내(intracranial)는 바늘을 설치류의 뇌에 직접 삽입하는 것을 포함합니다.
이러한 절차를 성공적으로 수행하려면 전문 교육이 필수적입니다. 여기에서는 먼저 이러한 각 방법에 대한 고려 사항을 설명한 다음 동물의 안전과 실험의 성공을 보장하면서 절차를 배우는 데 도움이 되는 기술을 보여줍니다.
이러한 경로가 일반적으로 사용되는 시기와 이러한 전문 관리 기술을 수행하기 시작하기 전에 염두에 두어야 할 사항에 대한 논의부터 시작하겠습니다.
피내 주사는 표피와 진피 사이의 공간으로 물품을 전달하는 데 사용됩니다.이 경로는 일반적으로 염증, 피부 혈류 진단 또는 항원에 대한 알레르기 반응을 평가하기 위해 예약되어 있습니다. 다른 경로와 마찬가지로 피내 용액도 멸균 기술을 사용하여 준비해야 합니다. 그리고 주사 부위의 조직 괴사를 피하기 위해 중성 pH를 갖도록 생리학적으로 완충되어야 합니다. 이 주입에는 25-30 게이지 바늘이 있는 허브가 없는 시스템이 자주 사용됩니다. 이 시스템은 주입 부위 당 50-100 마이크로 리터 범위의 투여량을 보존하는 데 도움이됩니다. 과도하게 주입하면 압력으로 인해 괴사 또는 원치 않는 화합물 누출이 발생할 수 있습니다.
비강 내 경로는 종종 백신 접종 또는 충혈 완화 스프레이의 현지 전달과 전신 및 CNS 전달을 위해 선택됩니다. 비강을 둘러싸고 있는 점막에는 혈관과 신경이 풍부하게 공급되어 있어 전신에 빠르게 흡수되고 중추신경계에 대한 직접적인 표적화가 가능합니다. 이것은 최소한의 교육과 기술, 간단한 장비 (보정 된 마이크로 피펫 및 일부 일회용 팁)가 필요한 비 침습적 방법입니다. 쥐에 대한 투여량은 6-10 마이크로 리터 방울로 제공되는 40-100 마이크로 리터를 초과해서는 안됩니다. 그리고 마우스의 경우 최대 총 부피는 3-4 마이크로 리터 방울로 제공되는 24 마이크로 리터입니다.
이 절차에는 마취가 필요하지 않지만 의식이 있는 동물의 비강 내 투여에 비해 몇 가지 장점이 있습니다 1) 콧구멍에 화합물을 적절하게 배치하여 정확한 투여를 보장합니다 2) 동물이 투여 장비를 물 가능성을 제거합니다 3) 동물의 코 조직, 눈, 또는 머리의 경련으로 인한 얼굴 피부, 4) 동물은 투여시 콧방귀에서 화합물을 코로 골고 살포 할 가능성이 적습니다.
성체 마우스와 쥐의 두개내 주사는 "Essentials of Neuroscience" 컬렉션의 비디오에 설명되어 있는 입체 장비를 사용합니다. 이 장비는 적절한 위치와 올바른 주입 깊이를 보장합니다. 여기에서는 두개골이 직접 주입할 수 있을 만큼 얇고 너무 약해서 입체 장치를 지지할 수 없는 신생아 마우스와 쥐의 두개내 전달에 초점을 맞출 것입니다. 이 기술의 주요 목적은 CNS 약리학적 제제를 CNS에 직접 전달하고 전신 경로를 통해 발생하는 영향을 방지하는 것입니다. 바늘 게이지, 투여 길이 및 양은 새끼의 종과 나이에 따라 결정됩니다. 동물의 나이가 증가함에 따라 게이지 수가 감소하고 필요한 바늘 길이가 증가하며 최대 권장 투여량도 증가합니다.
이 배경 정보를 염두에 두고 이러한 주입 방법의 절차를 살펴보겠습니다. 첫 번째는 피내 투여 기법입니다. 이 절차는 마취된 동물에서 수행되어야 합니다. 이 컬렉션의 다른 비디오를 검토하여 마취 유도 및 유지 관리 절차를 이해하십시오.
동물이 마취되면 전기 면도기나 제모 크림을 사용하여 주사 부위를 면도합니다. 물에 적신 거즈로 해당 부위에 남아 있는 모발을 완전히 제거합니다. 그런 다음 다른 거즈 패드를 사용하여 면도한 부위에 국소 소독액을 바릅니다. 투여를 위해서는 먼저 주사 부위의 피부를 엄지와 검지 손가락 사이로 펴서 안정시킵니다.
이제 바늘을 피부에 비스듬하게 놓고 베벨 바로 너머로 부드럽게 삽입하여 구멍이 표피와 진피층 사이에 오도록 합니다. 그런 다음 천천히 주입하고 피부에 기포가 생기는 점에 유의하십시오. 바늘을 너무 깊게 삽입하면 기포가 형성되지 않습니다. 주입 후에는 피부가 늘어나고 조정될 수 있도록 잠시 멈춘 다음 바늘을 천천히 빼냅니다. 조직을 끌어당겨 주사 부위에 외상을 입힐 수 있으므로 언제든지 플런저를 뒤로 당기지 마십시오. 또한 주입 부위를 닦거나 더럽히면 주입 물질이 누출될 수 있으므로 사용하지 마십시오. 여러 번 주입을 수행할 때는 블렙이 서로 겹치지 않도록 충분히 넓은 간격을 두어야 합니다.
다음으로, 의식이 있는 동물과 마취된 동물의 비강 투여 절차에 대해 알아보겠습니다.
깨어 있는 동물의 경우, 목덜미 피부의 목덜미를 긁어 제지한 다음 머리를 움직이지 않은 상태로 동물을 수직 자세로 잡습니다. 가슴을 조이면 동물이 액체를 폐로 끌어들이기 위해 충분히 깊이 숨을 들이쉬는 능력을 방해할 수 있으므로 가슴을 조이지 않도록 주의하십시오. 마이크로피펫을 사용하여 비강 입구에 작은 액체 한 방울을 떨어뜨려 용액의 일부를 투여합니다. 동물은 비말을 흡입합니다. 이 과정을 반복하여 투여할 전체 볼륨이 제공될 때까지 두 개의 비강 구멍을 번갈아 가며 수행합니다. 상기하라 - 총 투여량은 마우스와 쥐에서 각각 24 μl 및 100 μl을 초과해서는 안 된다.
마취된 쥐와 쥐의 경우 동물을 등쪽 누운 자세로 놓습니다. 이 위치는 화합물의 더 나은 흡수를 허용하기 때문에 CNS 전달에 이상적입니다. 동물의 머리를 회전시키고 화합물의 절반을 코 입구의 한쪽에 직접 투여하고 흡입으로 타이밍을 맞춥니다. 그런 다음 동물의 머리를 회전시켜 다음 투여를 위한 위치로 이동합니다. 2회 정도 숨을 쉰 후 남은 부피를 두 번째 코 구멍에 투여합니다. 투여가 완료되면 동물을 우리로 되돌려 보냅니다.
다음으로 신생아 마우스와 쥐에 대한 두개내 투여 절차를 검토해 보겠습니다. 절차를 시작하기 전에 새끼와 댐이 있는 케이지를 낮게 설정된 전기 가열 패드에 놓습니다. 케이지의 일부가 가열 패드에서 떨어져 있는지 확인하십시오. 이것은 저체온증을 예방하고 동시에 원하는 경우 댐이 열에서 멀어질 수 있도록하기위한 것입니다. 그런 다음 동물의 나이에 적합한 바늘 게이지를 선택합니다. 바늘 게이지를 기억하십시오. 두개내 주사 중 바늘의 깊이를 조절하는 데 사용되는 바늘 길이; 그리고 행정의 양... 모두 동물의 나이와 종에 따라 다릅니다.
길이는 가드를 사용하여 조정됩니다. 이 가드를 준비하려면 캡에 올바른 바늘을 측정하고 표시를 하십시오. 다음으로, 캡에 두 번째 표시를 하여 절단할 위치를 나타냅니다. 두 표시 사이의 거리는 원하는 바늘 길이입니다. 그런 다음 면도날로 뚜껑을 자릅니다. 가위를 사용하면 캡이 부서지고 깨끗한 수준으로 절단되지 않으므로 사용하지 마십시오. 이것이 바로 "바늘 보호대"입니다. 가드를 만드는 데 사용된 바늘은 더 이상 멸균되지 않으므로 폐기하고 대신 새 바늘을 가드에 삽입하고 올바른 길이가 노출되었는지 확인하십시오. 다음으로 적절한 주사기에 부착 된 다른 바늘을 사용하여 주입 물질을 추출합니다. 이를 위해 다른 바늘이 사용되는데, 마개에 삽입하면 이러한 미세 바늘이 상당히 무뎌지기 때문에 두개내 투여에 이상적이지 않습니다. 그런 다음 채워진 주사기를 가드와 함께 바늘에 놓습니다. 이제 시스템이 주입할 준비가 되었습니다.
생후 10일이 넘은 새끼의 경우 흡입 마취를 실시합니다. 생후 10일 미만의 새끼는 마취할 필요가 없습니다. 주사를 수행하려면 먼저 눈 뒤쪽 5mm, 두개골 정중선에서 약 3mm 떨어진 부위를 찾습니다. 그런 다음 바늘 가드가 허용하는 깊이까지 바늘을 삽입합니다. 그런 다음 뇌에 대한 외상을 피하기 위해 천천히 꾸준히 주입하십시오. 뇌 조직의 손상을 방지하기 위해 즉시 그리고 세심한 주의를 기울여 바늘을 제거하십시오. 마지막으로, 동물을 댐과 함께 다시 넣어 적절하게 회복할 수 있도록 합니다.
이제 이러한 흔하지 않은 투여 경로를 활용하는 실험실에서 수행되고 있는 몇 가지 실험을 검토해 보겠습니다.
피내 주사는 종종 피부 염증 반응을 연구하는 데 사용됩니다. 이 실험에서 연구진은 이 방법을 사용하여 미리 감작된 쥐의 한쪽 귀에 알레르기 항원을 주입하고 반대쪽 귀에 중성 물질을 주입했습니다. 다음으로, 그들은 알레르겐 주입으로 인한 혈관 투과성의 변화를 조사하기 위해 동물의 순환계에 파란색 염료를 전달했습니다.
앞서 언급했듯이 비강 내 투여의 응용 프로그램 중 하나는 백신을 투여하는 것입니다. 여기에서 과학자들은 이 경로를 사용하여 유전적으로 변형된 약독화 생독감 백신을 야생형 및 형질전환 마우스에 전달하고 특정 유형의 T 세포 생산을 통한 점막 면역을 연구했습니다.
마지막으로, 이러한 생물 의학 연구는 인간 뇌종양 모델을 만들기 위해 두개내 투여를 사용하여 면역이 저하된 마우스에 암세포를 이식했습니다. 그런 다음 주입의 효능을 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 분석했습니다.
당신은 실험실 마우스와 쥐에서 화합물을 투여하는 특별한 방법 중 일부에 대한 JoVE의 비디오를 시청했습니다. 이제 이러한 절차가 도움이 되는 경우, 이러한 기술을 수행하기 전과 수행하는 동안 염두에 두어야 할 고려 사항, 투여가 동물의 건강과 수집할 실험 데이터에 미치는 영향을 최소화하기 위한 필수 절차 단계를 이해해야 합니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!
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Q1: When is intradermal injection used in rodent research?
Intradermal injection delivers compounds into the space between the epidermis and dermis layers. This route is typically used to assess inflammation, measure cutaneous blood flow, or evaluate allergenic reactions to antigens. The procedure requires anesthesia and specialized training to ensure accurate placement and minimize tissue damage at the injection site.
Q2: What are the key advantages of intranasal administration in laboratory animals?
Intranasal administration is non-invasive and requires minimal training and simple equipment like a calibrated micropipette. The nasal mucosa's rich blood vessel and nerve supply enables rapid systemic absorption and direct central nervous system targeting. This route is commonly used for vaccine delivery and local decongestant applications in rodents.
Q3: Why is anesthesia recommended for intranasal dosing in conscious rodents?
Anesthesia during intranasal administration ensures proper compound placement at the nares for accurate dosing, prevents animals from biting equipment, and eliminates head jerking that could injure nasal tissue or eyes. Anesthesia also reduces the likelihood of the animal snorting and spraying the compound from the nares upon administration.
Q4: What volume limits apply to intranasal administration in different rodent species?
For rats, intranasal administration should not exceed 50 microliters per administration. For mice, the maximum total volume is less than 20 microliters. These volume restrictions prevent complications and ensure compliance with institutional guidelines and IACUC-approved protocols for safe compound delivery.
Q5: How is needle depth controlled during neonatal intracranial injection?
A needle guard is created by measuring the correct needle against its cap, marking the desired length, and cutting the cap with a razor blade to produce a clean, level cut. This custom depth-control device is prepared aseptically and ensures the needle penetrates only to the validated depth appropriate for the target brain structure and animal age.
Q6: What preparation steps are essential before intradermal injection in rodents?
The injection site must be shaved using an electric razor or depilatory cream, then thoroughly cleaned with water-dampened gauze to remove lingering hair. A topical antiseptic solution is applied to the shaved area. The skin is stabilized by stretching it between thumb and index finger before needle insertion to ensure accurate bleb formation.
Q7: Why is a separate needle used to draw test articles for intracranial injection?
A separate needle is used to draw the test article because insertion into the stopper significantly dulls fine-gauge needles, which compromises injection quality. Using a fresh needle for intracranial administration preserves needle sharpness and ensures precise, trauma-free delivery directly into the neonatal rodent brain.