박테리아 콜로니에서 군집 DNA 추출

1. 세균 성 지역 사회 DNA 추출

1. 절차를 시작하려면 체질 토양 100 g의 무게를 측정합니다. 폴리 프로필렌 용기에 이것을 추가하고, 토양 매트릭스에서 박테리아의 방출을 촉진하기 위해 EDTA로 개정 된 트리스 버퍼로 구성된 추출 버퍼 100 mL을 추가 한 다음 손으로 흔들어.
2. 다음으로, 유리 구슬 의 100 g의 무게, 믹싱 용기에 추가합니다. 15분 동안 비드 구타 장치 또는 기계식 손목 동작 셰이커를 사용하여 샘플을 5분 동안 양수합니다. 10mL 20% 나트륨 도데딜 황산염 또는 SDS를 혼합물에 넣고 1분 동안 교반합니다. 60 -65°C의 고온에서 60분 동안 배양한다.
3. 별도의 50mL 튜브, 원심분리기 는 6,000 x g에서 10분 동안 샘플을 동등하게 분배합니다. 상체를 튜브에서 단일 멸균 용기로 옮기습니다. 다음으로, 추출 버퍼의 신선한 부피를 사용하여, 이전에 설명한 바와 같이 토양 펠릿에 추출을 반복한다.
4. 다음으로, 가공된 상체의 총 부피, 약 200mL, 깨끗한 50mL 튜브에 30% 폴리에틸렌 글리콜 과 1.6M 염화나트륨의 용액으로 반부적으로 채워진 깨끗한 50mL 튜브를 첨가한다. 병을 손으로 여러 번 반전시켜 혼합하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 원심분리기 샘플은 DNA를 펠릿하는 데 20분 동안 10,000 x g로 샘플링합니다.
5. 원심분리기 튜브에서 상체를 조심스럽게 제거하고 부분적으로 정제된 핵산 펠릿을 남깁니다. 20mL의 TE 버퍼와 7.5M 칼륨 아세테이트 용액의 1.5mL를 추가하여 펠릿을 다시 한 번 재보펜합니다. 서스펜션을 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 단백질과 다당류를 침전시키기 위해 4°C에서 30분 동안 16,000 x g의 원심분리기.
6. 다음으로, 샘플에 RNAAe와 단백질Ae K를 추가하고 손으로 부드럽게 섞어 잠시 앉습니다. 페놀:클로로폼:이소아밀 알코올(25:24:1의 비율 혼합물)을 추출할 현탁액에 첨가하고 손으로 부드럽게 섞는다. 원심 분리기 는 13,000 x g에서 10 분 동안 준비합니다. 원심분리기에서 용기를 조심스럽게 제거하고 두 층을 주목한다.
7. 바닥, 무거운 층은 페놀: 클로로폼:이소아밀 알코올 및 추출된 파편으로 구성되며, 상부 층은 수성이며 DNA를 함유하고 있다. 수성 상을 멸균 용기에 넣고 동등한 부피를 추가하고 DNA 강수량을 시작하기 위해 부드럽게 반전하십시오. 실온에서 서스펜션을 2시간 동안 배양합니다. 30 분 동안 16,000 x g에서 원심 분리에 의해 정제 된 DNA를 펠렛. 펠릿 DNA가 혈관의 바닥에 보이지 않을 수도 있고 보이지 않을 수 있기 때문에 상체를 조심스럽게 제거한 다음 TE 버퍼의 1mL에서 다시 중단한다.
8. 분광계 또는 DNA/RNA 정량화 형광형계를 사용하여 샘플에서 추출한 DNA 수준을 측정합니다. DNA의 양은 260 nm 판독에서 추정됩니다. 1.0의 흡광도 판독은 mL 당 DNA의 50 μg에 해당합니다. 농도가 너무 높으면 정확한 판독값을 위해 서스펜션 1에서 10 또는 분자 등급 물을 사용하여 1 에서 100으로 희석하십시오.
9. DNA의 순도는 280 nm에서 280 nm에 260 nm에서 판독값의 비율에서 추정됩니다. 값이 1.7 > 비교적 순수한 DNA를 나타냅니다. 최대 이론값은 2.0입니다.