이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

안녕하세요, 저는 뉴욕 시에 위치한 Weill Cornell Medical College 생리학 및 생물물리학과의 Ola Anderson 박사입니다. 제 이름은 Olson이며, Olive Anderson 교수님 연구실의 계산 생물 의학 전공 학생입니다.

저는 Anderson 연구실의 리서치 테크니션인 Shail Collingwood입니다. 오늘은 바이오레이어 평면을 형성하는 방법, Biolayer Punch 전극을 사용하여 작은 막을 분리하는 방법, 단일 채널 활성을 기록하고 그 결과를 분석하는 방법, 그리고 이를 통해 Gramicidin 채널을 지질 이중층 특성의 프로브로 활용하는 방법을 보여드리겠습니다. 이전 비디오에서는 이러한 실험을 위한 준비 과정을 설명해 드렸습니다.

우리는 사용한 챔버를 준비하는 방법과 채널 활성을 기록할 작은 막 층을 분리하는 데 사용하는 Bilayer punch 전극을 준비하는 방법을 보여드렸습니다. 이제 Bilayer를 펀칭해 보겠습니다. Bilayer 실험 설정을 시작하려면, 온도가 평형화된 전해질 용액 2.5 mL를 미리 도색된 챔버의 각 구획에 넣으십시오. 우리가 보통 사용하는 용액은 1 M sodium chloride에 10 mM을 더한 것입니다.

pH 7로 버퍼링한 후, 테플론의 구멍이 시야 중심에 오고 밝게 조명되도록 현미경과 광원을 조절하십시오. 유리 마이크로 피펫을 마이크로 전극 홀더에 삽입하십시오. 타이곤 튜브를 사용하여 홀더에 시린지를 연결하십시오.

흡입을 통해 전극 홀더의 피펫을 채웁니다. 기포가 생기면 전극 홀더의 실버 펠렛과 피펫 팁 사이의 전기적 연결이 끊어질 수 있으므로 주의하십시오. 나사에 소량의 바세린을 바른 후, 마이크로 전극 홀더에 장착합니다.

바셀린은 기밀 씰을 만드는 데 도움이 됩니다. 전극 홀더를 패러데이 케이지(Faraday cage) 내의 패치 클램프 헤드 스테이지에 연결하십시오. 마이크로피펫 팁을 테플론 격벽의 구멍 바로 뒤 중앙에 위치시키십시오.

말아 올린 은 전극을 전면 챔버에 넣습니다. 모델링 클레이로 전극을 고정한 후 전압 명령 회로에 연결합니다. 마지막으로 전극의 균형을 맞춥니다.

전면의 전극과 마이크로 전극 홀더 내의 전극이 서로 약간 다른 반전지 전위(half cell potential)를 가질 수 있으므로 이 과정은 매우 중요합니다. 반전지 전위는 은 금속과 전극, 그리고 염화은 코팅에 인접한 전해질 용액 사이의 전위차를 의미합니다. 패치 클램프에서 두 구획 사이에 흐르는 전류가 -200 pA에서 +200 pA 사이에서 변동하도록 수동 오프셋을 조정하여 전극의 균형을 맞추십시오.

오프셋 전위는 시간에 따라 변하므로, 지질 이중층 막을 형성하는 실험 전 과정 동안 정기적으로 전극의 균형을 맞추어야 합니다. 동반 영상에 설명된 대로 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 fch 용액으로 세척하십시오. 세척된 피펫을 지질 코팅 용액에 담그고 용액이 피펫 내부로 약 1mm 정도 올라오게 하십시오.

피펫 팁을 테플론 격벽의 구멍 바로 앞에 배치하고, 지질 용액 방울을 구멍 위에 조심스럽게 도포합니다. 성공적으로 수행되면, 구멍 전체에 걸쳐 밝은 색의 지질 기포가 형성되며, 테플론 격벽에 부착된 토러스(Taurus) 또는 도넛 모양의 지질 구조가 나타납니다. 막이 얇아질 때까지 기다리며, 이는 막 양단에 100 to 200 millivolt 전위를 가하여 촉진할 수 있습니다.

유리 마이크로 피펫 팁을 Taurus에 넣고 몇 분 동안 그대로 두어 피펫과 이중층 사이의 밀봉 상태를 개선합니다. 이제 유리 마이크로 피펫을 사용하여 막 패치를 분리할 준비가 되었습니다. 이제 막에 gramin을 도핑하십시오.

이 gramin 용액은 1 µM 스톡을 1~10 nM로 희석하여 조제하였습니다. 보통 DMSO에 희석액 1~10 µL를 멤브레인의 양면에 각각 첨가하여 최종 농도가 pM 범위가 되도록 합니다. 마그네틱 스터러를 사용하여 용액을 약 2분간 교반하고, 다시 10분을 기다린 후 새로운 소형 멤브레인을 형성하여 단일 채널 활성을 기록합니다.

이 정도의 대기 시간은 그라민(gramin)이 막에 통합되기에 충분한 시간입니다. 전압을 가하여 채널 활성을 확인하십시오. 일반적으로 초당 약 1회의 채널 이벤트가 발생하는 것이 적절합니다.

채널은 막 전류의 불연속적인 상승 및 하강 변화로 나타납니다. 이제 실제 실험을 시작할 준비가 되었습니다. 먼저, 대조군 전류 트레이스를 기록하십시오.

앞서 시연한 대로 전극의 균형을 맞추고, 동반 영상에 설명된 대로 작은 막 또는 패치를 형성하십시오. +200 mV를 인가하고 단일 채널 활성을 기록하십시오. 100에서 200회의 단일 채널 전류 전이를 수집해야 합니다.

이 단계를 -200 mV에서 반복합니다. 피펫 팁을 통해 전해질을 배출하여 패치를 파괴합니다. 나일론 나사를 사용하여 전극의 균형을 다시 맞춘 후, 피펫을 후방 챔버로 후퇴시키고 과잉 지질을 불어낸 다음 새로운 패치를 형성합니다.

다른 전위에서 기록이 필요한 경우 이 단계들을 반복할 수 있습니다. 이제 지질 이중층 수정제를 사용하여 실험적 전류 트레이스를 기록할 준비가 되었습니다. 이 경우에는 막의 양쪽에 항우울제인 fluoxetine을 첨가합니다.

플루옥세틴(fluoxetine) 스톡 용액은 DMSO에서 25 millimolar로 희석해야 합니다. 챔버 내 농도가 50 micromolar가 되도록 이 용액 5 µL를 첨가하십시오. DMSO는 이중층 특성에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 용액 내 DMSO의 양을 25 µL, 1% 또는 150 millimolar 이하로 제한하는 것이 중요합니다.

5분 동안 교반하고, 수정제가 수용액과 막 사이에서 평형을 이룰 때까지 10분 동안 기다립니다. 이제 수정제가 존재하는 상태에서 앞서 설명한 대로 채널 활성을 기록합니다. 이 단계들을 반복하여 수정제 농도를 높여가며 채널 활성을 기록합니다.

채널 수명과 생성률을 정량화함으로써 이중층의 변화에 대해 많은 정보를 얻을 수 있습니다. 이러한 분석을 수행하려면 채널의 형성과 소멸을 감지해야 합니다. 본 과정에서는 컴퓨터가 1차 도함수를 계산하여 전류의 급격한 변화를 결정하고 이를 채널 이벤트로 표시하는 전이 기반 알고리즘을 사용합니다.

전이 전후의 채널 수명을 결정하기 위해 이벤트들은 시계열로 저장됩니다. 전류 레벨 또한 저장되어 실험이 진행되는 동안 채널 진폭을 결정하는 데 도움을 줍니다. 컴퓨터는 전류 전이 진폭 히스토그램을 생성하며, 이를 통해 전류 전이의 획득 과정을 추적할 수 있습니다.

또한 이를 통해 실험의 품질을 평가할 수 있습니다. 현재의 전이 진폭이 넓게 분산되어 있다면 문제가 있는 것입니다. 히스토그램이 조밀하게 형성되어 있다면 실험이 잘 진행되고 있는 것입니다.

200회 이상의 전이 이벤트가 누적되면, 주 피크 내 전이들의 평균 전류와 표준 편차를 계산하십시오. 전류 전이 진폭 히스토그램에 나타난 전이 횟수를 관찰 시간으로 나누어 채널의 출현율을 간단히 추정할 수 있습니다. 이때 채널이 나타날 때 한 번, 사라질 때 한 번으로 히스토그램에 두 번 계산되므로 반드시 2로 나누어야 함을 기억하십시오.

채널 수명 분포를 얻기 위해 전이 이벤트의 시계열을 분석합니다. 어느 시점에서든 전도성 채널이 하나 이하로 존재하는 전류 트레이스에서 수명을 결정하는 방법은 간단합니다. 이 경우, 컴퓨터는 각 전이가 채널의 생성인지 소멸인지를 감지하며, 소멸 이벤트는 오직 직전에 발생한 생성 이벤트에만 대응될 수 있습니다.

두 전이 사이의 시간이 채널 수명입니다. 채널 전이가 너무 가깝게 일어나 구분할 수 없는 경우에는 생성과 소멸을 수동으로 지정해야 합니다. 동시에 전도되는 채널이 두 개 이상인 경우에는 어떤 채널의 소멸이 어떤 채널의 생성과 연결되는지 알 수 없으므로 지정 과정이 더 복잡해집니다.

이러한 이유로 채널 활성도를 낮게 유지하는 것이 바람직합니다. 난수 생성기를 사용하여 출현(appearance)을 소멸(disappearance)에 할당함으로써 할당 문제를 해결할 수 있습니다. 이렇게 하면 일련의 채널 수명(channel lifetimes)을 얻게 됩니다.

이는 수명 히스토그램으로 변환되며, 다시 생존 곡선으로 변환됩니다. 비선형 최소 제곱 곡선 피팅을 사용하여 생존 곡선에 단일 지수 분포를 맞춤으로써 평균 수명을 결정하며, 이때 거대 막이 파열되지 않는 실험을 수행합니다. 이중층 수정제를 첨가하면 채널 형성 속도에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다. 거대 막이 파열되는 경우에는 이러한 비교가 타당하지 않으며, 막 단백질의 기능은 세포막 지질 조성에 의해 조절됩니다.

이러한 조절은 특정 지질-단백질 상호작용과 지질 이중층 및 막 단백질 사이의 보다 일반적인 상호작용의 결합으로 인해 발생합니다. 이러한 상호작용은 약리학 연구에서 특히 중요합니다. 현재 시장에 출시된 많은 의약품은 지질 이중층의 특성을 변화시킬 수 있는 양친매성 물질이며, 이는 결과적으로 막 단백질 기능의 변화로 이어질 수 있기 때문입니다.

Gramin 채널은 양친매성 물질이 지질 이중층 특성을 변화시킬 수 있는지 보고하는 분자 힘 트랜스듀서로 사용될 수 있습니다. 수정제 농도에 따른 수명 및 생성률의 변화를 도식화하면 이중층 특성의 변화에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.

빈도가 증가했다는 것은 이중층이 Gram 부위와 이량체화를 수용하기 위해 더 쉽게 변형됨을 의미합니다. 수명이 증가했다는 것은 채널 형성과 관련된 이중층 변형의 에너지 비용이 낮아졌음을 의미합니다. 수정제는 막 탄성을 높이거나 곡률에 영향을 주어 빈도와 수명을 증가시킬 수 있습니다.

지금까지 크로모 채널을 사용하여 저분자 화합물이 탄성 이중층 특성을 변화시키는지 확인하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 모든 내용을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.