Name: 전기 생리학 실험을위한 인공 Bilayers의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 평면 지질 이중막을 준비하여 이온 채널의 단일 채널 전기생리학 측정을 수행하는 방법을. 테플론 격막, 전극 세척, 유리 미세 전극 제작 기법을 포함한 완전한 실험 프로토콜을 확인하세요.

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방문하십시오 <a href="http://springerprotocols.com/index.vm">스프링거 프로토콜</a> 인공 bilayers을 준비하고 막 탄성을 탐색을위한 그램이시딘 채널을 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은합니다.

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

전기 생리학 실험을위한 인공 bilayers의 준비

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

평면 지질 bilayers, 또한 불리는 인공 지질 bilayers, 당신이 공부할 수 있도록 이온 실시하는 잘 정의된 환경에서 채널을. 이 bilayers 그러한 막 활성 펩티드, 지질 이중층 속성에 변화가 이중층 - 스패닝 채널의 기능을 변경하는 방법에 대한 이온 채널이나 수사의 reconstitution의 특성 등 여러 연구에 사용될 수 있습니다. 여기, 우리는 평면 이중층을 형성하는 방법과 이중층의 작은 패치를 분리하는 방법, 그리고 두 번째 비디오도 지질 이중층 탄성 성질의 변화를 확인하기 위해 그램이시딘 채널을 사용하는 절차를 보여 표시됩니다. 우리는 또한 이중층 챔버를 준비하는 데 필요한 각 단계의 전극 및 이중층은 단일 채널 측정에 적합한 것을 테스트를 보여줍니다.

평면 지질 bilayers, 또한 불리는 인공 지질 bilayers, 당신이 공부할 수 있도록 이온 실시하는 잘 정의된 환경에서 채널을. 여기, 우리는 이중층 챔버를 준비하는 데 필요한 각 단계의 전극 및 이중층은 단일 채널 측정에 적합한 것을 테스트를 보여줍니다.

전기 생리학 실험을위한 인공 Bilayers의 준비

인공 지질 이중층이라고도 불리는 평면 지질 이중층을 이용하면 잘 정의된 환경에서 이온 전도성 채널을 연구할 수 있습니다. 이러한 이중층은...

안녕하세요, 저는 뉴욕시 Weill Cornell Medical College 생리학 및 생물물리학과 교수 Olaf Anderson입니다. 안녕하세요, 저는 Olaf Anderson 교수님 연구실의 MD PhD 과정 학생 Ruchi Kaur입니다. 안녕하세요, 제 이름은 John Kim입니다.저는 연구 기술자입니다. 오늘은 평면 지질 이중층에서의 단일 채널 실험 준비 방법을 보여드리겠습니다. 챔버 준비 방법과 Bilayer Punch 전극 준비 방법을 안내해 드리겠습니다.측정을 수행할 막의 좁은 영역을 분리하여 사용해 왔습니다. 이제 시작하겠습니다. 본 실험의 전기생리학적 설정은 기계적 진동을 최소화하기 위한 공기 부양식 방진대, 전기적 노이즈, 소음 및 진동을 차단하기 위한 패러데이 케이지(Faraday cage), 그리고 스탠드로 구성됩니다.이중층 챔버의 경우, 온도 조절을 위해 이중층 챔버가 배치되는 순환식 워터 재킷과 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지를 장착하기 위한 마이크로 매니퓰레이터를 사용합니다. 패치 클램프 증폭기의 출력을 500 hertz에서 추가로 필터링하기 위해 전자 필터 유닛이 사용됩니다. 전류 전이를 시각화하기 위해, 패치 클램프 증폭기와 전자 필터 모두의 출력 전류 신호를 표시하는 오실로스코프를 사용합니다.마지막으로, 패치 클램프 신호를 디지털화하는 데이터 획득 시스템이 설치된 컴퓨터가 필요합니다. 20 kilohertz의 샘플링 속도에서 데이터 기록 및 분석을 위해 자체 개발한 소프트웨어를 사용합니다. 모든 장비는 시작 20분 전에 켜둡니다.다음으로, 실험이 수행될 챔버를 준비하겠습니다. 챔버는 약 100 microns 두께의 얇은 Teflon 시트로 제작되어 전해질 용액으로 채워진 격막(septum)에 의해 두 개의 구역으로 나뉩니다. 우리는 격막의 구멍을 가로질러 이중층(bilayer)을 형성하며, 이 구멍은 전해질 용액 간의 연결 통로 역할을 합니다.구멍의 지름은 1~1.5 mm여야 합니다. 바셀린을 밀봉제로 사용하여 테플론 챔버 전반부에 유리창을 배치하고, 금속 지지대 하나와 후반부 챔버의 구멍 4개에 스테인리스 스틸 나사를 끼웁니다. 바셀린을 밀봉제로 사용하여 원형 테플론 격벽이 조립된 챔버의 두 반쪽 사이에 끼워지도록 배치합니다.격벽의 구멍이 중앙에 위치하도록 하십시오. 전해질 구획이 수밀 상태를 유지하고 전기적으로 절연되도록 격벽의 양면에 바셀린을 도포하십시오. 챔버의 앞부분 절반과 전면 금속 브레이스를 통해 나사를 계속 끼우십시오.모든 구성 요소가 단단히 고정되도록 조립품을 조이되, 챔버를 세척하고 페트롤리움 젤리를 제거할 수 있도록 너무 세게 조이지는 마십시오. 파스퇴르 피펫의 끝을 가열하여 매끄럽게 다듬고 직각으로 구부립니다. 피펫 끝을 매끄럽게 연마하면 유리나 테플론에 긁힘이 발생하는 것을 방지할 수 있습니다.다음으로, 클로로포름과 메탄올을 2:1 비율로 혼합한 용액 또는 fch 용액으로 챔버를 세척합니다. 피펫을 사용하여 테플론과 유리에 번지지 않도록 주의하며 fch 용액으로 과량의 페트롤리움 젤리를 제거합니다. fch 용액은 최소 10배 부피를 사용하십시오.이 과정이 완료되면, 챔버에 마그네틱 Stir bar를 넣습니다. 그런 다음 95% ethanol로 챔버를 세척합니다. 마지막으로 증류수, UE water 또는 그에 상응하는 고순수 물로 세척합니다.이전과 마찬가지로, 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 액체를 흡입합니다. 마지막으로, ethanol과 물로 세척 과정을 반복합니다. 그 다음 물, ethanol 및 fol 순으로 세척합니다.이제 챔버의 후방 구획에 전기적 연결을 제공할 유리 전극 마이크로 피펫을 제작하겠습니다. Sutter Instruments사의 P 97 flaming brown 마이크로 피펫 풀러(puller)를 사용하여, 각각 짧고 날카로운 테이퍼를 가진 두 개의 마이크로 피펫이 되도록 유리 모세관을 뽑아냅니다. 외경 0.8 millimeters, 내경 0.5 millimeters의 붕규산 유리로 제작된 모세관을 사용합니다. 모세관을 풀러에 배치하고 고정하여 필라멘트를 뽑아낼 준비를 합니다.기존에 성공한 사례가 없으므로 전극은 백금으로 제작해야 합니다. 텅스텐 필라멘트를 이용한 전극 극성 피펫 추출 후, 다음 단계들은 백금 필라멘트가 장착된 마이크로 포지(micro forge)에서 진행합니다. 마이크로 포지를 사용하기 전에 필라멘트가 유리로 잘 코팅되어 있는지 확인해야 합니다.연질 소다 석회 유리 또는 경질 붕규산 유리를 사용할 수 있습니다. 유리가 부드럽게 흐르고 필라멘트를 얇고 균일하게 덮을 수 있도록 마이크로 포지의 열을 조절해야 합니다. 이제 마이크로 피펫을 마이크로 포지에 장착하고 팁을 부러뜨리십시오.상대적으로 낮은 열을 가해 필라멘트의 유리 코팅을 부드럽게 연화시킵니다. 그런 다음 마이크로 피펫 팁을 필라멘트의 유리 코팅 쪽으로 조심스럽게 이동시켜 두 부분이 서로 녹아 붙게 한 뒤, 필라멘트의 가열을 중단합니다. 그러면 필라멘트가 수축하면서 피펫 끝이 절단됩니다. 이제 직경 약 30 microns의 날카롭고 균일한 개구부가 형성됩니다.다시 마이크로 포지를 사용하여 마이크로 피펫의 끝에서 3~4 mm 지점에 직각 굴곡을 만들고, 피펫을 필라멘트에서 수백 µm 위에 배치한 다음 가열 장치를 켜서 필라멘트가 붉게 변하도록 합니다. 열팽창으로 인해 필라멘트가 이동하게 됩니다. 이때 피펫을 필라멘트 위로 천천히 내리면 필라멘트가 구부러집니다.필라멘트의 가열 정도로 굽힘 정도를 조절합니다. 굽힘 각도가 약 80도가 되면, 피펫을 빠르게 위쪽과 앞쪽으로 이동시킵니다. 이 과정에는 어느 정도의 협응력이 필요합니다.동일한 설정을 사용하여 90도 굴곡을 만들어야 합니다. 마이크로 피펫 팁을 화염 연마하여 필라멘트가 유리에 코팅된 상태를 유지하십시오. 이제 벤젠에 녹인 10% tri octal silene 용액으로 피펫 팁을 실란화(siloized)합니다.이렇게 하면 피펫 표면이 소수성으로 변하여 멤브레인과 잘 상호작용하게 됩니다. 모세관 현상을 통해 용액이 피펫 내부로 몇 밀리미터 정도 빨려 올라가게 하십시오. 마이크로 포지(micro forge)를 이용해 낮은 열로 이를 증발시키면 과정이 완료됩니다.이제 은 전극을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다. 직경 약 1mm인 5cm 길이의 은선을 준비하십시오. 이를 내경 2~3mm의 코일 형태로 3~4회 맙니다.나머지 부분을 꼬임(helix)과 직각이 되도록 구부려 꼬리 부분으로 둡니다. 꼬리 부분과 은선의 인접한 5~10 millimeters 영역을 용융된 염화은으로 코팅합니다. 이제 이층 형성 용액을 준비합니다.본 실험에서는 decane에 용해된 인지질 phosphatidylcholine을 사용하였습니다. 해당 지질은 지질과 chloroform의 150 µL 혼합액 형태로 유리 튜브에 담겨 -40 °C에서 보관되었습니다. 냉동고에서 유리 튜브를 꺼내 실온에 둔 후, 건조 질소 분사 하에서 chloroform을 증발시킵니다.화학 흄후드 내에서 50 µL의 end decane을 넣고 볼텍싱합니다. 이층막 형성 용액과 이층막을 형성할 구멍 주변의 테플론 사이의 접촉을 원활하게 하기 위해, 구멍 주변의 테플론 격벽을 다시 도포합니다. 먼저, 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 fch로 세척합니다.그런 다음 세척된 피펫을 2.5% phospholipid/n-decane 용액에 담가 지질이 피펫 위로 약 1mm 정도 올라오게 합니다. 테플론 격벽의 구멍 위에 지질 한 방울을 떨어뜨려 막을 형성합니다. 지질을 약 10~15분 동안 건조시킨 후 이 과정을 반복합니다.안녕하세요.지금까지 단일 채널 실험을 위한 지질 이중층 준비 방법을 살펴보았습니다. 이어지는 영상에서는 막의 작은 패치를 분리하는 방법, 단일 채널 활성을 기록하는 방법, 저분자 화합물로 활성을 조절하는 방법, 그리고 그 결과를 분석하는 방법을 보여드리겠습니다. 이것으로 마치겠습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 지질 bilyer의 위쪽 전단지에 버렸네 형성을 조절하고 TIRF 현미경을 사용하여 버렸네 형성을 시각화하는 것으로 알려진 세포 부착 단백질을 고정하는 방법을 보여줍니다.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

막 단백질 기능은 세포막의 지질 성분에 의해 규제됩니다. 이 비디오 - 문서 변경 막 속성의 기자로 이중층 패치 전극뿐만 아니라 사용하는 방법으로 그램이시딘 채널을 사용하여 패치를 형성하는 방법 세부 사항.

이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

지질 세포막에 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널의 완전한 재구성에 대한 절차를 설명합니다. 재구성 채널은 생화학 적 분석, 전기 녹음, 리간​​드 스크리닝 및 전자 결정학 연구에 적합합니다. 이러한 방법은 다른 막 단백질의 구조 및 기능 연구에 일반적으로 응용 프로그램이있을 수 있습니다.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

세균 mechanosensitive 채널은 생체 분자 장치에서 mechanoelectrical 트랜스 듀서로 사용할 수 있습니다. 물방울 인터페이스 이중층 (DIB의), 이러한 장치에 휴대 영감 빌딩 블록, 통합 및 mechanosensitive 채널을 자극하는 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 여기서 우리는, DIB의 형성 기계적인 자극에서 mechanosensitive 채널의 연구를 허용하는 새로운 마이크로 피펫 기반 방법을 보여줍니다.

다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

우리는 보유, 수송 지질 이중층 형성 시스템을 보여준다. 냉동 막 전구체는 상온 상태로 전환하면 지질 이중층 막을 80 % 성공률 1 시간 내에 형성 될 수있다. 이 시스템은 이온 채널과 관련된 힘드는 과정과 전문​​ 지식을 줄일 수 있습니다.

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

여기, 선물이 연락처 거품 bilayer 메서드를 사용 하 여 지질 bilayers의 대형을 위한 프로토콜. 물 거품 물-오일 인터페이스에는 단층은 형성 하는 그것에 의하여, 유기 용 매에 불어 진다. 두 펫은 bilayer를 형성 하기 위하여 거품을 도킹 하려면 조작 됩니다.

패치-Clampers에 대 한 연락처 거품 Bilayers 지질 Bilayer 실험

소프트, 낮은-전력, 바이오 memristors 활용 유사한 성분, 구조, 그리고 바이오 시 냅 스의 메커니즘을 전환 합니다. 여기는 조립 하 고 바이오 memristors 특성화 프로토콜에서 얻은 기름에서 물방울 사이 형성 하는 지질 bilayers 절연. Alamethicin 전압 활성화 펩 티 드의 memristive 이온 전도성 막에 걸쳐 발생합니다.

어셈블리 및 바이오 Memristors 이온 채널 실수로 지질 세포 막의 구성의 특성

이 프로토콜은 높은 용융 온도와 지질에 대한 지질 단층 조립 및 방울 인터페이스 이중 층 형성을 촉진하기 위해 피드백 온도 제어 가열 시스템의 사용을 자세히 설명, 멤브레인의 온도 중심변화를 특성화하는 커패시턴스 측정.

온도 제어 어셈블리 및 방울 인터페이스 Bilayer의 특성화

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

그라마시딘 A-도핑된 액상 계면 이중층을 조립, 전기자극, 분석하는 실험 프로토콜이 제시됩니다. 지질-단백질 구조-기능 관계는 막 면적, 이온 플럭스, 단일 채널 전도도 변화를 측정하고, 이러한 반응을 전기 시냅스에서 영감을 받은 막 모델에서 이온 전도의 가소성 유사 변화와 연관하여 정량화합니다.

액상 인터페이스 이중층을 이용한 지질-단백질 막 구조-기능 특성 분석

배우세요 평면 지질 이중막을 준비하여 이온 채널의 단일 채널 전기생리학 측정을 수행하는 방법을. 테플론 격막, 전극 세척, 유리 미세 전극 제작 기법을 포함한 완전한 실험 프로토콜을 확인하세요.

전기 생리학 실험을위한 인공 Bilayers의 준비

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