입양 세포 전송: 기증자 쥐 비장 세포를 숙주 쥐에 도입 후 FACS를 통한 성공 평가
출처: 뮤니에 실베인1,2,3,퍼셰 티보1,2,3,소피 노볼트4,레이첼 골럽1,2,3
1 림프포포에이시스, 면역학학과, 파스퇴르 연구소, 파리, 프랑스
2 INSERM U1223, 파리, 프랑스
3 유니버시테 파리 디드로, 소르본 파리 시테, 셀룰레 파스퇴르, 파리, 프랑…
1. 준비
- 시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
- 먼저 세제로 모든 해부 도구를 살균한 다음 70%의 에탄올로 완전히 건조시하십시오.
- 2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 50mL준비한다.
2. 해부
- 이산화탄소 전달 시스템을 사용하여 저산소증으로 마우스를 안락사시합니다. supine 위치에 있는 해부 판에 안락사 마우스를 고정하고 가위와 집게를 사용하여 세로 복강경을 수행합니다.
- 집게를 사용하여 복부의 오른쪽에 있는 창자와 위를 이동하여 위장과 비장을 노출시합니다. 비장은 위장에 부착됩니다.
- 집게를 사용하여 조심스럽게 위에서 비장을 분리하고 HBSS 2 % FCS의 5 mL가 들어있는 페트리 접시에 놓습니다.
3. 면역 세포 격리
- 페트리 접시 위에 40 μm 세포 여과기에 비장을 놓습니다. 비장을 플런저로 분쇄하여 해리합니다.
- HBSS 2% FCS의 1mL로 플런서와 스트레이너를 헹구어 부착된 세포를 복구합니다.
- 해리된 비장과 유체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기.
- 페트리 접시를 HBSS 2% FCS 5밀리리터로 세척하고 액체를 15mL 튜브로 옮겨냅니다.
- 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하는 상퍼를 폐기하십시오.
- 펠릿을 다시 중단하고 적혈구를 분해하기 위해 2mL의 칼륨 암모늄 염화물 파이펫을 위아래로 재놓습니다.
- 2 분 동안 기다렸다가 HBSS 2 % FCS를 재부유 된 펠릿에 추가하여 최대 14 mL의 부피를 얻습니다.
- 10°C에서 7분 동안 370 x g로 튜브를 다시 원심 분리합니다. 상체를 버리고 위아래로 파이펫을 하여 HBSS 2 % FCS의 5 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
- 트라이판 블루 염색 분석기를 사용하여 세포를 계산하고 HBSS 2 % FCS의 적절한 부피를 사용하여 최종 세포 농도를 107 세포 / mL로 조정합니다.
4. 입양 이전
- 5mL 수집 튜브에서 얻어진 세포 현탁액 2mL를 전송합니다.
- 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리한 다음 상체를 폐기합니다.
- PBS의 2mL에서 펠릿을 다시 중단하고 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브원심분리기.
- PBS의 200 μL에서 상수 및 재중단 펠릿을 폐기하십시오.
- 29G 바늘로 0.5 mL 주사기를 사용하여 200 μL의 세포 현탁액을 실험 마우스에 정맥내로 주입하여 레트로 궤도 혈액 부비동에 주입한다.
- 대조군으로서, 인산염 완충식염의 200 μL와 같은 혈액 부비동에 두 번째 마우스를 주입한다.
5. 세포 수확 및 염색
- 입양 전세 후 4일 후, 마우스를 안락사시키고 비장을 제거한다.
- 섹션 3에 설명된 대로 비장구를 수확하십시오.
- 각 마우스에서 세포 현탁액 100μL을 "제어"와 "전송"이라고 표시된 두 개의 FACS 튜브로 옮기습니다.
- 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리한 다음 초월제를 폐기합니다.
- 표 1에나열된 희석제에서 4개의 항체를 포함하는 혼합물을 준비한다.
| 항 체 | 플루오로크롬 | 희석 |
| CD45.1 | BV711 | 1/200 |
| CD45.2 | APCCy7 | 1/400 |
| CD4 | BV786 | 1/1600 |
| CD3 | BV421 | 1/200 |
표 1: 항체 혼합 조성. 농축 항체 형광 접합체 및 HBSS를 사용하여 4개의 항체 칵테일 준비.
- 각 튜브에 믹스 의 100 μL을 추가 한 다음 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 배양합니다.
- HBSS 2% FCS의 1mL을 추가한 다음 10°C에서 3분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리합니다.
- 슈퍼네티츠를 버리고 200μL의 HBSS 2% FCS에서 펠릿을 다시 중단한다.
- 다시 중단된 셀을 새 레이블이 지정된 FACS 튜브로 전송합니다.
- FACS 프로토콜에 도시된 바와 같이 유동 세포측정을 사용하여 CD45.2 양성 림프구의 존재를 평가합니다.
6. 데이터 분석
- "FlowJo"소프트웨어를 열고 각 튜브의 파일을"모든 샘플"창에서 드래그합니다.
- "전송된"파일을 두 번 클릭하여 Y 축및 측면 분산"FSC-A"를X 축에 미리 분산시키는 점 플롯에 해당 샘플에서 기록된 셀을 표시합니다.
- "다각형"을클릭하고 림프구를 선택하는 게이팅 전략을 만든 다음 세포 표면 마커 (CD45.1, CD45.2)를 사용하여 기증자 및 호스트 세포를 구별한 다음 CD45.2+ 셀 모집단 (CD3, CD4)을 특성화합니다.
- "컨트롤마우스"파일로 분석 단계를 반복합니다.
- 셀 채우기를 시각화하려면"레이아웃 편집기"를 클릭합니다.
- "전송된 셀"과"전송된 CD4 셀""전송된 "채우기"에서"전송"및"컨트롤"파일을"레이아웃 편집기 탭"으로드래그합니다.
- CD45.2+ 셀 및 CD4 림프구를 나타내는 도트 플롯이 나타납니다.
- CD45.2 전송된 셀은"전송된 마우스"도트 플롯에만 나타납니다.
양자 세포 전달(Adoptive cell transfer)은 관심 세포를 유기체에 도입하는 방법입니다. 특정 부류의 면역 세포의 작용을 포함하여 다양한 생물학적 메커니즘을 연구하는 강력한 기술입니다. 또한, 입양 이식은 골수 이식이 필요한 질환이나 환자 자신의 T 세포를 추출하여 암 세포를 인식하고 파괴하도록 변형한 다음 종양과 싸우기 위해 신체로 되돌릴 수 있는 암 치료와 같은 수많은 질환에 대한 유망한 새로운 치료법입니다.
실험실에서는 동물 모델을 사용하여 입양 이식을 연구하는 경우가 많습니다. 예를 들어, CD45.1 Rag gamma-c knockout 마우스는 조혈모세포가 림프구로 정상적으로 분화되는 데 필수적인 많은 사이토카인에 대한 기본 수용체가 부족합니다. 그 결과, 녹아웃 마우스는 림프구 발달이 손상되었으며 자연살해(NK) 세포, T 세포 또는 B 세포가 없습니다.
입양 이식은 비장과 같은 고농도의 면역 세포를 포함하는 기증자 마우스 조직을 먼저 수확하여 누락된 면역 세포를 이러한 손상된 마우스에 도입하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 조직을 해리하고 면역 세포를 포함한 다양한 비장 세포를 분리합니다. 다음으로, 원치 않는 적혈구 또는 적혈구는 염화암모늄 칼륨 용해 완충액을 첨가하여 용해할 수 있으며, 나머지 백혈구 또는 비장 세포는 원심분리를 사용하여 세포 파편에서 분리됩니다.
마지막으로, 정제된 비장세포를 면역이 저하된 마우스에 주입하여 이러한 세포의 기능에 대한 자세한 연구를 용이하게 합니다. 며칠 후, 양자 면역 세포 전달의 성공 여부는 먼저 기증자 조직과 동일한 방식으로 숙주 비장 세포를 분리하고 준비함으로써 확인할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 세포는 FACS를 사용하여 확인 및 분류할 수 있도록 기증자 면역 세포 마커에 대해 표지된 항체를 사용하여 염색됩니다.
먼저 실험실 장갑과 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 다음으로, 집게와 해부 가위를 먼저 세제로 씻은 다음 70% 에탄올로 씻은 다음 깨끗한 종이 타월로 말리십시오. 50ml 튜브에 1ml의 FCS와 49ml의 HBSS를 결합하여 50ml의 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)과 2% Fetal Calf Serum(FCS)을 준비합니다. 용액을 약 10회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
비장 B 림프구 분리를 위한 JoVE 비디오 프로토콜 FACS 기술에서 입증된 바와 같이 안락사된 마우스를 해부하고 비장을 제거합니다. 면역 세포를 분리하려면 먼저 페트리 접시의 40마이크로미터 세포 여과기에 비장을 놓습니다. 플런저로 비장을 부수어 접시로 분리하십시오. 플런저와 스트레이너를 HBSS 2% FCS 1ml로 헹궈 부착된 세포를 회수합니다. 그런 다음 페트리 접시에서 해리된 비장과 액체를 50ml 원심분리 튜브에 피펫으로 넣습니다. 5ml의 HBSS 2% FCS로 페트리 접시를 세척하고 액체를 15ml 튜브로 옮깁니다.
섭씨 10도에서 7분 동안 370회 g으로 튜브를 원심분리한 다음 펠릿을 방해하지 않도록 튜브를 조심스럽게 회수합니다. 이제 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거하고 액체를 적절한 폐기물 용기에 버리십시오. 그런 다음 2ml의 염화암모늄 염화칼륨 용해 완충액을 원심분리 튜브와 피펫에 위아래로 추가하여 펠릿을 재현탁하고 적혈구를 용해합니다. 2분 동안 기다린 다음 HBSS 2% FCS를 재현탁된 펠릿에 첨가하여 총 14ml의 값을 얻습니다. 원심분리를 반복합니다. 튜브를 조심스럽게 회수하고 상층액을 버리십시오. 그런 다음 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 5ml HBSS 2% FCS에 재현탁합니다. 다음으로, 현탁 상태의 세포를 세어 봅니다. 5마이크로리터의 세포 현탁액에 5마이크로리터의 트리판 블루를 첨가하고 피펫팅으로 잘 섞습니다. 그런 다음 커버 유리와 Malassez 슬라이드 사이에 5마이크로리터의 희석된 세포 현탁액을 부드럽게 떨어뜨립니다. 현미경을 40X 배율로 설정하고 세포 수를 계산합니다. 적절한 부피의 HBSS 2% FCS를 첨가하여 세포 농도를 10에서 밀리리터당 7개의 세포로 조정합니다.
채택 이식을 시작하려면 2ml의 세포 현탁액을 5ml 수집 튜브로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 10도에서 7분 동안 370회 g으로 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 다음으로, 펠릿을 인산염 완충 식염수 2ml에 재현탁시키고 튜브를 섭씨 10도에서 7분 동안 370배 g으로 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 그런 다음 펠릿을 200마이크로리터의 인산염 완충 식염수에 재현탁합니다. 29게이지 바늘이 달린 0.5ml 주사기를 사용하여 200마이크로리터의 세포 현탁액을 실험용 쥐에 주입하고 후안와혈액동에 정맥 주사합니다.
입양 이식 후 4일 후에 쥐를 안락사시키고 비장을 제거합니다. 그런 다음 섹션 3에 설명된 대로 면역 세포를 수확합니다. 다음으로, 각 마우스에서 100마이크로리터의 세포 현탁액을 control 및 transferred라고 표시된 두 개의 FACS 튜브로 옮깁니다. 섭씨 10도에서 7분 동안 370회 g으로 튜브를 원심분리한 다음 상등액을 버립니다. 이제, 표 1에 나열된 희석액에서 4개의 항체를 포함하는 혼합물을 준비합니다. 각 튜브에 100마이크로리터의 혼합물을 첨가한 다음 어두운 곳에서 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 튜브에 HBSS 2% FCS 1ml를 첨가한 다음 섭씨 10도에서 3분 동안 370배 g으로 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 폐기한 다음 펠릿을 200마이크로리터의 HBSS 2% FCS에 재현탁합니다. 재현탁된 세포를 새로 표지된 FACS 튜브로 옮깁니다. 이제 FACS 프로토콜에 표시된 대로 유세포 분석을 사용하여 CD45의 존재를 평가합니다. 2 양성 림프구.
이제 CD45에서 분리된 CD45.2 림프구의 존재를 확인할 것입니다. 1 숙주 비장. 시작하려면 FlowJo 아이콘을 두 번 클릭하고 모든 샘플 창에서 각 튜브의 파일을 드래그합니다. 그런 다음 전송된 파일을 두 번 클릭하여 해당 샘플에서 기록된 셀을 x축에 전방 산란 FSCA를 표시하고 y축에 측면 산란 SSCA를 표시하는 점도표에 표시합니다. polygon을 클릭하여 림프구 집단에 동그라미를 칩니다. 새 하위 모집단 식별 창이 나타납니다. 확인을 클릭합니다. 이제 y축을 FSC-W로 설정하고 x축을 FSC-A로 설정합니다. 이전에 설명한 대로 polygon 도구를 사용하여 단일 세포 모집단을 선택합니다.
그런 다음 원으로 표시된 모집단을 두 번 클릭하여 선택한 셀에 대한 새 창을 만듭니다. 새 창에서 Y에서 CD45.2를 선택하고 X에서 CD45.1을 선택합니다. T 아이콘을 클릭하고 축을 사용자 정의하여 플롯을 확대합니다. 그런 다음 다각형을 클릭하여 CD45.2 양성 세포에 동그라미를 칩니다. Subpopulation Identification 창에서 cell population transferred cells의 이름을 지정하고 OK를 클릭합니다. 같은 창에서 사각형을 클릭하여 CD45.2 음수 셀을 선택합니다. subpopulation identification 창에서 cell population host cells의 이름을 지정하고 OK를 클릭합니다. 다음으로, CD45.2 circled population, transferred population을 두 번 클릭하여 선택한 세포에 대한 새 창을 만듭니다. 새 창에서 Y에서 CD3를 선택하고 X에서 CD4를 선택합니다.
그런 다음 다각형을 클릭하여 CD4 CD3 양성 세포에 동그라미를 그립니다. 이 subpopulation identification 창에서 세포 집단이 전달된 CD4 세포의 이름을 지정합니다. 그런 다음 제어 마우스 파일에 대해 이전 분석 단계를 반복합니다. 마지막으로 세포 집단을 시각화하려면 Layout Editor를 클릭합니다. 전송된 파일 및 제어 파일에서 전송된 셀과 전송된 CD4 셀 모집단을 레이아웃 편집기 탭으로 드래그합니다. CD45.2 양성 세포와 CD4 림프구를 나타내는 점도표가 나타납니다. CD45입니다. 2개의 전송된 셀은 전송된 마우스 점도표에만 나타나야 합니다.
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Q1: What is adoptive cell transfer and why is it used in research?
Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into an organism to study biological mechanisms or treat disease. It enables researchers to examine specific immune cell functions, study hematopoiesis, and test novel therapies like cancer treatments where patient T-cells are extracted, modified to recognize tumors, and returned to fight cancer. Animal models allow detailed investigation of transferred cell behavior and efficacy.
Q2: Why are CD45.1 Rag gamma-c knockout mice used in adoptive transfer studies?
CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental cytokine receptors essential for normal lymphocyte development, resulting in compromised immune systems without natural killer cells, T-cells, or B-cells. These immunocompromised mice serve as ideal recipients for adoptive transfer because they allow researchers to study how donor immune cells establish and function in a lymphocyte-deficient host.
Q3: How are splenocytes isolated and purified from donor tissue?
The spleen is dissociated using a cell strainer and plunger to release cells into suspension. Unwanted erythrocytes are lysed using ammonium chloride potassium lysing buffer, and centrifugation separates white blood cells from debris. The resulting purified splenocytes are counted using trypan blue and adjusted to the desired concentration before transfer into recipient mice.
Q4: What is the role of flow cytometry in confirming successful adoptive transfer?
Flow cytometry using fluorescence-activated cell sorting (FACS) confirms transfer success by detecting donor cells in the host spleen. Labeled antibodies against donor markers like CD45.2 distinguish transferred cells from host cells. The technique allows researchers to identify specific lymphocyte populations, such as CD4 T-cells, and verify their presence and distribution in recipient mice.
Q5: How is the cell suspension prepared before intravenous injection into recipient mice?
The cell suspension is centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline through two sequential wash steps. The final pellet is resuspended in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, 200 microliters of this purified cell suspension is injected intravenously into the retro-orbital blood sinus of the recipient mouse.
Q6: What does the FACS analysis reveal about transferred versus host lymphocytes?
FACS analysis distinguishes CD45.2 positive transferred cells from CD45.1 positive host cells using dot plots. Transferred cells appear only in the transferred mouse sample, not in control mice receiving phosphate buffered saline alone. Further analysis identifies specific transferred lymphocyte subsets, such as CD4 T-cells, demonstrating both successful engraftment and the phenotype of donor cells within the host.
Q7: What compatibility factors must be considered before performing adoptive cell transfer?
Host and donor compatibility is crucial to ensure cell adoption without rejection. In this protocol, CD45.2 donor splenocytes are transferred into CD45.1 Rag gamma-c recipient mice, allowing discrimination between donor and host cells. This genetic distinction enables researchers to track transferred cells and assess their integration, survival, and function within the immunocompromised host environment.