입양 세포 전송: 기증자 쥐 비장 세포를 숙주 쥐에 도입 후 FACS를 통한 성공 평가

1. 준비

1. 시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
2. 먼저 세제로 모든 해부 도구를 살균한 다음 70%의 에탄올로 완전히 건조시하십시오.
3. 2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 50mL준비한다.

2. 해부

1. 이산화탄소 전달 시스템을 사용하여 저산소증으로 마우스를 안락사시합니다. supine 위치에 있는 해부 판에 안락사 마우스를 고정하고 가위와 집게를 사용하여 세로 복강경을 수행합니다.
2. 집게를 사용하여 복부의 오른쪽에 있는 창자와 위를 이동하여 위장과 비장을 노출시합니다. 비장은 위장에 부착됩니다.
3. 집게를 사용하여 조심스럽게 위에서 비장을 분리하고 HBSS 2 % FCS의 5 mL가 들어있는 페트리 접시에 놓습니다.

3. 면역 세포 격리

1. 페트리 접시 위에 40 μm 세포 여과기에 비장을 놓습니다. 비장을 플런저로 분쇄하여 해리합니다.
2. HBSS 2% FCS의 1mL로 플런서와 스트레이너를 헹구어 부착된 세포를 복구합니다.
3. 해리된 비장과 유체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기.
4. 페트리 접시를 HBSS 2% FCS 5밀리리터로 세척하고 액체를 15mL 튜브로 옮겨냅니다.
5. 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하는 상퍼를 폐기하십시오.
6. 펠릿을 다시 중단하고 적혈구를 분해하기 위해 2mL의 칼륨 암모늄 염화물 파이펫을 위아래로 재놓습니다.
7. 2 분 동안 기다렸다가 HBSS 2 % FCS를 재부유 된 펠릿에 추가하여 최대 14 mL의 부피를 얻습니다.
8. 10°C에서 7분 동안 370 x g로 튜브를 다시 원심 분리합니다. 상체를 버리고 위아래로 파이펫을 하여 HBSS 2 % FCS의 5 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
9. 트라이판 블루 염색 분석기를 사용하여 세포를 계산하고 HBSS 2 % FCS의 적절한 부피를 사용하여 최종 세포 농도를 10⁷ 세포 / mL로 조정합니다.

4. 입양 이전

1. 5mL 수집 튜브에서 얻어진 세포 현탁액 2mL를 전송합니다.
2. 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리한 다음 상체를 폐기합니다.
3. PBS의 2mL에서 펠릿을 다시 중단하고 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브원심분리기.
4. PBS의 200 μL에서 상수 및 재중단 펠릿을 폐기하십시오.
5. 29G 바늘로 0.5 mL 주사기를 사용하여 200 μL의 세포 현탁액을 실험 마우스에 정맥내로 주입하여 레트로 궤도 혈액 부비동에 주입한다.
6. 대조군으로서, 인산염 완충식염의 200 μL와 같은 혈액 부비동에 두 번째 마우스를 주입한다.

5. 세포 수확 및 염색

1. 입양 전세 후 4일 후, 마우스를 안락사시키고 비장을 제거한다.
2. 섹션 3에 설명된 대로 비장구를 수확하십시오.
3. 각 마우스에서 세포 현탁액 100μL을 "제어"와 "전송"이라고 표시된 두 개의 FACS 튜브로 옮기습니다.
4. 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리한 다음 초월제를 폐기합니다.
5. 표 1에나열된 희석제에서 4개의 항체를 포함하는 혼합물을 준비한다.

항 체	플루오로크롬	희석
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
CD4	BV786	1/1600
CD3	BV421	1/200

표 1: 항체 혼합 조성. 농축 항체 형광 접합체 및 HBSS를 사용하여 4개의 항체 칵테일 준비.

6. 각 튜브에 믹스 의 100 μL을 추가 한 다음 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 배양합니다.
7. HBSS 2% FCS의 1mL을 추가한 다음 10°C에서 3분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리합니다.
8. 슈퍼네티츠를 버리고 200μL의 HBSS 2% FCS에서 펠릿을 다시 중단한다.
9. 다시 중단된 셀을 새 레이블이 지정된 FACS 튜브로 전송합니다.
10. FACS 프로토콜에 도시된 바와 같이 유동 세포측정을 사용하여 CD45.2 양성 림프구의 존재를 평가합니다.

6. 데이터 분석

1. "FlowJo"소프트웨어를 열고 각 튜브의 파일을"모든 샘플"창에서 드래그합니다.
2. "전송된"파일을 두 번 클릭하여 Y 축및 측면 분산"FSC-A"를X 축에 미리 분산시키는 점 플롯에 해당 샘플에서 기록된 셀을 표시합니다.
3. "다각형"을클릭하고 림프구를 선택하는 게이팅 전략을 만든 다음 세포 표면 마커 (CD45.1, CD45.2)를 사용하여 기증자 및 호스트 세포를 구별한 다음 CD45.2⁺ 셀 모집단 (CD3, CD4)을 특성화합니다.
4. "컨트롤마우스"파일로 분석 단계를 반복합니다.
5. 셀 채우기를 시각화하려면"레이아웃 편집기"를 클릭합니다.
6. "전송된 셀"과"전송된 CD4 셀""전송된 "채우기"에서"전송"및"컨트롤"파일을"레이아웃 편집기 탭"으로드래그합니다.
7. CD45.2⁺ 셀 및 CD4 림프구를 나타내는 도트 플롯이 나타납니다.
8. CD45.2 전송된 셀은"전송된 마우스"도트 플롯에만 나타납니다.