Name: 망막의 수평 슬라이스 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 배우세요 망막 수평 슬라이스 기법으로 수상돌기 형태를 보존하는 신경과학 연구 방법을. 이 기술은 기존 수직 슬라이스법보다 뉴런 구조를 효과적으로 유지하여 망막 회로 기능 연구에 활용됩니다.

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우리는 DRS 감사합니다. 망막의 수평 슬라이스 준비 절차를 확립하기 위해 우리에게 귀중한 조언과 제안을 주셔서 리차드 H​​. Masland 및 Akimichi 가네코.

<ol><li> 한천 블록 (30 MG / ML, 즉 3%, 증류수로)를 준비합니다. 용해와 전자렌지를 최초의 유리 그릇에 그것을 부어. 4 O C.에 냉장고에 음식 보관 팁 : 한천 블록이 사전에 준비되어야합니다. </li><li> 준비 낮은 온도 용해 아가로 오스 겔 (중간 25 MG / ML, 즉 2.5 %). 그것을 디졸브, 전자렌지. 35 O C.에있는 온수 욕조에 보관 팁 : 아가로 오스 겔이 너무 섹시하지 보관. 너무는 뜨겁다면, 그것은 확정되는 데 시간이 오래 걸립니다, 그리고 젤은 망막을 죽일 수 있습니다 . </li><li> 동물, 명백히하다에게 안구를 안락사와 세안 컵으로 엽니다. 유리체 유머를 녹일 수, 열린 세안 컵이있다면 반드시, 매체 hyaluronidase 10 분 (0.07 MG / ML)에 절어있다. </li><li> 블록 (예, 마우스 망막에 대한 1cm가 X 1.5 cm)에 한천을 잘라 굳게 인스턴트 접착제에 의해 vibratome 무대에 첨부하여 보내드립니다. 한천 블록이 젖었 유지. </li><li> 기계에서 5 정도에서 칼날을 놓습니다. 부드럽게 약의 속도에 한천 블록의 상단 표면을 잘라. 50 μm의 / 초, 주파수. 50 Hz에서. 팁 : 한천 블록의 상단 표면이 완전히 부드럽고 평평한되었는지 확인하십시오. 몇 가지 상처는 (적어도 3 회) 한천 블록의 부드럽고 평평한 표면을 필요 수 있습니다. </li><li> hyaluronidase없는 매체로 세안 컵을 씻어. 안료 상피에서 망막을 분리하여 필터 종이에 photoreceptor 쪽을 놓으십시오. 단단히 필터 종이에 망막을 첨부하려면 필터 종이에 여러 번 망막을 진공. 팁 : 망막이 완전히 평면 필터 종이에 첨부되어 있는지 확인합니다. 이 필터 종이에 망막을 넣어 후, 망막 (Fig.2A)를 둘러싼 초과 필터 종이를 잘라. 초과 여과지는 종종 망막의 해당 계층에 갈의 칼날을 방지합니다. </li><li> 부드럽게 한천 블록에있는 여분의 매체를 쓸어 조심스럽게 한천 블록에 필터 종이에 망막을 놓으십시오. 단단히 한천 블록에 여과지를 삽입하려면 필터 용지의 가장자리에 즉시 접착제를 첨부해 주시기 바랍니다. 팁 : unexpectable 균열을 방지하려면, 한천 블록의 상단 표면에 가능한 전면으로 망막를 놓습니다. </li><li> 부드럽게 망막을 통해 낮은 온도 용해 아가로 오스 젤 잔. 1 분 기다린 후 부드럽게 아래로 냉각로에있는 매체를 부어. 아가로 오스 겔은 신속하게 확정됩니다. 팁 : 너무 뜨거운 아가로 오스 겔은 망막을 죽이면. </li><li> 한천 블록의 상단 표면 위의 여러 수백 μm의에 칼날 위치를 허용하고 부드럽게 경화 아가로 오스 겔의 상단을 잘라. </li><li> 블레이드 위치를 내려. 내부 핵 계층 (한천 블록의 상단 표면 위 200 사이 250 μm의 약)의 근위 분의 수준에서 망막을 잘라요. 팁 : 블레이드 너무 많아 속도는 심각한 망막 손상을 것입니다. 약. 50 μm의 / 초 (50 Hz에서)이 적합합니다. </li><li> amacrine 세포가 처형될 위기에 다운됩니다 확인할 수 있습니다. 조심스럽게 경화 아가로 오스 겔와 함께 망막의 슬라이스를 선택하고 챔버 또는 접시에 얼굴까지 그것을 놓으십시오. 팁 : 마우스 망막은 작은과 물결 모양이기 때문에, 그것이 적절한 계층에서 완벽한 수평 슬라이스를 얻을 어렵습니다. &quot;경사&quot;슬라이스는 망막의 상대 평면 슬라이스를 얻을 다른 방법 수 있습니다. 경사 슬라이스를 얻으려면, 필터 종이와 같은 Fig.2B 같이 한천 블록에있는 망막 사이에 또 다른 필터 종이를 넣어. 당신은 완벽한 수평 단면을 기대할 수는 없지만, amacrine 세포의 소마는 조각의 표면에 일부 지역은 항상있다. </li></ol>

<ol><li>Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+spatiotemporal+patterns+of+dendritic+Ca2%2B+signals+in+goldfish+retinal+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells.</a> Brain Res. , 64-73 (2004).</li>
<li>Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+currents+stabilize+the+membrane+potential+in+dendrites+of+mouse+amacrine+cells%3A+patch-clamp+recordings+and+single-cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell.</a> , 328-340 (2004).</li>
<li>MA, M. acN. eil, RH, M. asland <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. , 971-982 (1998).</li>
</ol>

모든 실험 프로토콜은 동물의 사용을위한 건강 지침 국립 연구소에 따라 실시되었다.

망막의 수평 슬라이스 준비의 여러 가지 중요한 장점이 있습니다. 첫째, 같은 amacrine 세포와 수평 세포와 같은 가로 dendrites를 확장하고 세포의 형태가 보존됩니다. 그것은 그것이 생리적 속성과 세포의 형태를 비교하는 것은 매우 중요하므로, 망막에 amacrine 세포의 20 종류 (맥닐 및 Masland, 1998) 이상이있다는 것을 보여왔다. 둘째, 전체 마운트 망막에 glial 세포의 endfeets의 광범위한 보험 amacrine 세포 패치 pipettes의 액세스를 방지합니다. 가로 조각에서 amacrine 세포의 소마는 조각의 표면에 노출됩니다. 이들은 조각의 표면에 위치하기 때문에 셋째, 화학 시약 쉽게 타겟 세포 및 dendrites에 도달할 수 있습니다. 워시 (Wash) - 및 세척 아웃 화학 물질의 신속하고 용이합니다. 넷째, 이러한 종래의 칼슘 이미징과 같은 형광 이온 이미징은 performable입니다. 전통적인 수직 조각 또는 전체 마운트 망막에서 이미지 자체에 대한 여...

<table><tbody><tr><td>한천(Agar)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1296</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 L(Agarose L)</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>317-01182</td><td>저온 융해 아가로스</td></tr><tr><td>히알루로니다제(Hyaluronidase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Type I-S, 300 U/mg</td></tr><tr><td>배지(Medium)</td><td></td><td></td><td>mM 단위: 102 NaCl, 3.1 KCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 23 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 10 glucose, pH 7.8로 유지, 또는 Ames&amp;rsquo; 용액 (Sigma)</td></tr><tr><td>전자레인지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>항온수조</td><td></td><td></td><td>35 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Vibratome 절편기</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>MF-막 필터(MF-Membrane filters)</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>여과지, 공극 크기 0.45 &amp;#181;m</td></tr><tr><td>해부 도구</td><td></td><td></td><td>포셉, 메스, 핀셋, 트위저 &lt;em&gt;등&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td>순간접착제</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;예:&lt;/em&gt; Alonalpha, Krazy Glu</td></tr><tr><td>50 mL 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr></tbody></table>

망막의 수평 슬라이스 준비

Horizontal Slice Preparation of the Retina

전통적으로 수직 슬라이스와 망막의 전체 마운트 준비는 망막 회로의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나, amacrine 세포로 망막 뉴런의 많은 세포의 형태가 심각하게 수직 조각에 손상 있어야되도록 가로 그들의 dendrites를 확장합니다. 전체 마운트 준비, 특히 패치 - 클램프 녹음을 위해 중간 계층에있는 망막 뉴런 인해 glial 세포 (뮬러 세포) 님의 endfeets의 광범위한 범위에 쉽게 액세스할 수 없습니다. 여기, 우리는 망막 손상 뉴런의 돌기 형태를 보존하는 방법을 깔끔히 소설을 설명합니다. 망막은 저온 용융 아가로 오스 겔에 포함된 이후 슬라이스는 vibratome 기계를 사용하여 망막의 내부 계층에서 수평으로 만들어졌습니다. 망막의 수평 슬라이스 준비에, 우리는 패치 - 클램프 녹음, 칼슘 이미징 기술, immunocytochemistry, RT - PCR 및 단일 세포를 사용하여, 그들의 형태와 비교하여 망막 뉴런의 기능을 공부했습니다.

전통적으로 수직 슬라이스와 망막의 전체 마운트 준비는 망막 회로의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 여기, 우리는 망막 손상 뉴런의 돌기 형태를 보존하는 방법을 깔끔히 소설을 설명합니다.

전통적으로 망막 회로의 기능을 연구하기 위해 망막의 수직 절편과 전층 표본(whole-mount preparation) 제작법이 사용되어 왔습니다. 하지만 많은 경우...

드디어 전설적인 결과물이 나왔으며, 이것은 사진 논문입니다.

horizontal-slice-preparation-of-the-retina

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

비 인간 영장류가 개발 및 노화에 대한 우리의 이해를위한 중요한 translational 수종이다. 영장류 망막의 해부 학적 조직은 인간의 정상 및 병리 학적 조건에 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

두뇌에 게이트웨이 : 프리 메이트 &#39;눈&#39;을 분석 해 봅시다

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

우리는 수생 호랑이 도롱뇽 (에서 얇은 망막 조각의 준비를...

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

우리는 쥐의 눈에서 망막 절편을 준비하고 망막 뉴런의 빛 반응을 기록하는 방법을 보여줄 것입니다. 전체 절차는 어두운 환경에서 수행됩니다.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

우리는 마우스 망막의 생체 외 슬라이스 준비를 사용하여 콘 광 수용체의 축삭 터미널에서 칼슘 역학을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 중요한 포유 동물 모델 시스템에서 콘 칼슘 신호의 포괄적 인 연구, 마우스를 할 수 있습니다.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

망막 조직을 이미징 전통적인 생 화 확 적인 방법에서 수집 될 수 없는 단일 셀 정보를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜 confocal 영상에 대 한 제 브라에서 망막 조각의 준비를 설명합니다. 형광 유전자 센서를 인코딩 또는 표시기 염료 별개 망막 세포 유형에 수많은 생물 학적 과정의 시각화를 허용.

Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

이 연구는 광수용체 세포체를 제거함으로써 면역조직화학, in situ hybridization 및 전기생리학 실험을 위해 더 빠른 항체 확산과 내부 망막 뉴런에 대한 패치 피펫 접근을 개선할 수 있는 대체 편평 장착 망막 제제를 제시합니다.

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

배우세요 망막 수평 슬라이스 기법으로 수상돌기 형태를 보존하는 신경과학 연구 방법을. 이 기술은 기존 수직 슬라이스법보다 뉴런 구조를 효과적으로 유지하여 망막 회로 기능 연구에 활용됩니다.

망막의 수평 슬라이스 준비

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