환경 Transcriptomics를 사용하여 해양 미생물 커뮤니티의 유전자 발현 분석

본 절차는 5µm 및 3µm 필터로의 사전 여과를 통해 수중 샘플에서 해양 미생물 바이오매스를 획득한 후, 0.22µm 필터로 수집하는 것으로 시작합니다. 이후 0.22µm 필터에 잔류한 생물체로부터 총 RNA를 추출합니다. 선택적 효소 분해 및 감쇄 하이브리드화를 통해 총 RNA에서 rRNA를 제거하며, 농축된 Mr.N은 polyA tailing 및 인비트로(in vitro) 전사를 통해 선형으로 증폭됩니다.

증폭된 antisense RNA는 random hexamer를 사용하여 이중 가닥 cDNA로 전환됩니다. 생성된 cDNA는 클로닝 및 시퀀싱을 거치거나 직접 pyro sequencing을 수행할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 조지아 대학교 해양과학과 Marianne Moran 박사님 연구실의 Rachel Persky입니다.

오늘은 환경 샘플의 유전자 발현을 관찰하는 절차를 보여드리겠습니다. 환경 메타전사체학(meta transcriptomics)을 이용하는 방법입니다. Scott Gifford가 RNA 수집을 위해 환경 샘플을 처리하는 방법을 설명해 드릴 것입니다.

샘플에서 RNA를 추출하고 Johanna RIN을 측정하는 방법을 보여드리겠습니다. AON이 RNA 제거 과정을 시연할 것입니다. 이어서 Maria Kosta가 RNA 증폭 및 cDNA 합성 단계를 설명하겠습니다.

이제 시작해 보겠습니다. 환경 RNA 수집을 시작하기 위해, 튜브의 한쪽 끝을 샘플링하려는 원하는 깊이의 물속에 넣고, 반대쪽 끝은 3 µm 대용량 필터에 연결하며, 펌프를 두 튜브 끝 사이에 배치하여 필터 라인 시스템을 구성합니다. 그다음 3 µm 필터를 0.22 µm 필터 타워에 연결하고, 0.22 µm 타워에서 나오는 유출수를 메스실린더(graduated cargo)로 유도합니다.

시스템을 헹구기 위해 수 리터의 물을 흘려보냅니다. 완료되면, 펌프가 작동하는 동안 튜브를 물에서 꺼내 라인에 남아 있는 물을 모두 배출합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 0.22 micrometer 필터를 필터 타워에 장착하고 닫습니다.

라인의 끝부분을 다시 물속에 넣고 펌프를 켭니다. 두 필터에서 공기가 모두 빠져나가도록 하고, 카보이의 표시를 통해 여과된 물의 양을 모니터링합니다. 원하는 부피만큼 여과가 완료되면, 라인을 물에서 꺼내고 시스템에 남아 있는 물을 모두 배출합니다.

필터가 마르는 즉시 상단 필터 플레이트를 빠르게 제거하고 거름종이를 접습니다. 필터를 훠얼 팩(whirl pack)에 넣고 액체 질소로 급속 냉동합니다. 실험을 시작하기 전에, RNA는 어디에나 존재하며 mRNA는 빠르게 분해되므로 작업 표면과 피펫을 포함하여 리보뉴클레아제-프리(ribonuclease free) 환경에서 작업하기 위한 표준 예방 조치를 반드시 준수해야 한다는 점에 유의하십시오.

이를 염두에 두고, 본 절차에 사용되는 모든 재료를 취급할 때는 깨끗한 장갑을 착용해야 합니다. 또한 샘플은 가능한 한 짧은 시간 내에 처리해야 합니다. 0.22 µm 필터에서 총 RNA 추출을 시작하기 위해, 50 mL 원심 분리관(conical tube)에 beta-mercaptoethanol이 첨가된 RLT 버퍼 8 mL를 넣어 비드 비팅 튜브를 준비합니다.

그 다음, mobile power soil extraction kit의 RNA beads 1~2 mL를 첨가합니다. 냉동실에서 냉동된 필터를 빠르게 꺼내어 world pack에 넣은 상태를 유지합니다. 말렛(mallet)을 사용하여 이를 부숩니다.

분쇄된 필터를 준비된 50 milliliter 원추형 튜브에 넣고 파라필름이나 실험실용 테이프로 튜브 뚜껑을 밀봉한 후 10분 동안 볼텍싱합니다. 그다음 50 milliliter 튜브를 5,000 RPM에서 1분 동안 원심분리합니다. 실온에서 용해물을 가능한 한 많이 제거하여 15 milliliter 튜브로 옮긴 후, 다시 5분 동안 원심분리합니다.

5,000 ×g에서 원심분리한 후, 상층액을 새로운 50 mL 튜브로 옮기고 용해물에 1배 부피의 100% ethanol을 첨가합니다. 10 mL 주사기와 18~21 gauge 바늘을 사용하여 용해물을 빨아들였다가 다시 내보내는 과정을 약 5회 반복합니다. 이후 추출 단계에서는 제조사의 지침에 따라 KaiGen R and easy mini kit를 사용하며, 진공 매니폴드 또는 반복적인 원심분리를 이용하여 용해물을 제공된 컬럼에 적용합니다.

분광광도계로 총 RNA 양을 정량합니다. 총 RNA 수율을 결정한 후, 제조사의 지침에 따라 Ambien turbo DNA free kit를 사용하여 DNA 오염 물질을 제거합니다. RNA 추출이 완료되었으므로, 총 RNA를 Johanna에게 전달하여 1차 및 2차 rRNA 제거 단계를 수행하도록 하겠습니다.

감사합니다, Rachel. rRNA 제거를 시작하려면, 사용 전 멸균된 RNA-free 0.5 mL 튜브에서 10x 반응 버퍼를 가볍게 섞은 후 짧게 원심 분리하십시오. 10x 반응 버퍼, RNA 억제제, 총 RNA 샘플 및 terminator exonuclease를 적절한 부피로 혼합합니다. Epicentre 프로토콜에 따라, 가열 덮개가 있는 써모사이클러 또는 항온수조에서 30 °C로 60분 동안 반응액을 배양하십시오.

다음으로, 먼저 RNAse free water를 추가하여 총 부피를 200 µL로 맞춘 후, mRNA 원심분리관에 1:1 페놀 클로로포름 용액을 1부피 추가하여 페놀 에탄올 침전법으로 반응을 종결시킵니다. 수층을 회수하고 100% 에탄올과 염으로 침전시킵니다. 이 단계에서 보관이 가능합니다.

RNA는 후속 응용 단계에서 샘플을 사용할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 1차 mRNA 농축을 완료한 후, 제조사의 지침에 따라 Ambien microbe enrich 및 microbe express 키트를 사용하여 샘플에서 잔류 rRNA를 제거합니다. 진핵생물 rRNA의 제거를 용이하게 하기 위해 microbe enrich 키트를 사용합니다.

모든 부피는 제조사의 지침서를 참조하여 결정합니다. 먼저, 1.5 milliliter 튜브에 binding buffer 300 microliters를 피펫으로 분주합니다. 최대 30 microliters 부피에 총 5~100 micrograms의 total RNA를 첨가하고 볼텍싱합니다.

결합 버퍼(binding buffer)에 5 µg RNA용 캡처 올리고 믹스(capture oligo mix) 2 µL를 조심스럽게 첨가하고 튜브를 가볍게 두드립니다. 혼합물을 짧게 원심 분리합니다. 혼합물을 70 °C에서 10분 동안 변성시킨 후, 37 °C에서 1시간 동안 어닐링(annealing)합니다.

이 배양 단계 동안, oligo mag beads를 nuclease free water로 한 번, binding buffer로 한 번 세척하고, 세척 단계 사이에 마그네틱 스탠드를 사용하여 beads를 포집함으로써 준비합니다. beads를 얼음 위에 보관하다가 실온으로 가온합니다. 사용 5분 전에 wash solution을 히트 블록에서 37 °C로 가열합니다.

세척된 oligo mag beads에 RNA capture oligo mix를 추가하고 튜브를 부드럽게 섞은 후 원심 분리합니다. 혼합물을 37 °C에서 15분 동안 짧게 배양합니다. 튜브를 자석 스탠드에 놓고 약 3분간 기다린 후, mRNA가 포함된 상층액을 흡입하여 얼음 위에 놓인 수집 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 미리 가온된 세척액 100 µL를 포집된 비드에 첨가합니다. 포집된 비드를 가볍게 볼텍싱한 후 상층액을 회수합니다. mRNA가 포함된 이 상층액을 얼음 위에 놓인 수집 튜브에 옮깁니다.

ambi microbe express kit를 사용하여 원핵생물 rRNA를 제거할 준비를 하는 동안 수집 튜브를 얼음에 놓으십시오. 이 키트는 잔류 원핵생물 rRNA를 제거하는 데 사용됩니다. Bioanalyzer 또는 Experion을 사용하여 rRNA 오염 여부와 mRNA 품질을 확인하십시오. 여기서 과정을 중단하고 보관할 수 있습니다.

RNA는 -80°C에서 보관할 수 있습니다. rRNA를 제거한 후, 제조사의 지침에 따라 Ambien message AMP two bacteria kit를 사용하여 mRNA를 증폭하겠습니다. 이제 순수한 mRNA 샘플이 준비되었으므로, mRNA 증폭 및 cDNA 합성을 안내해 줄 Maria에게 실험을 넘기겠습니다.

감사합니다, Hannah. mRNA 증폭을 시작하기 전에 Ambien message AMP two bacteria kit 마스터 믹스의 각 성분 부피를 계산하십시오. 온라인으로 확인한 후, 최대 1000 nanograms의 총 RNA를 멸균된 RNA free micro fuge tube에 넣어 템플릿 RNA의 polyadenylation을 시작합니다. in vitro transcription을 통해 RNA를 합성하기 위해 첫 번째 버퍼에 6.5 microliters의 샘플을 사용하고 RNA free water는 넣지 마십시오.

균일한 온도를 유지하기 위해 하이브리드화 오븐이나 인큐베이터를 사용하는 것이 권장됩니다. 또한 튜브 내부에 응결물이 형성되지 않는 것이 매우 중요하므로, in vitro 전사 반응을 14시간 동안 인큐베이션할 것을 강력히 권장합니다. RNA 수율을 극대화하여 가장 높은 A RNA 수율을 얻으려면, IBT를 40 µL의 최종 반응 부피로 수행하고 A RNA를 약 10 µL씩 나누어 -80 °C에서 보관하십시오.

RNA 증폭이 완료되면, 상보적 DNA 또는 cDNA를 합성할 차례입니다. RNA로부터 cDNA를 합성하기 위해 Promega universal ribot Clone cDNA synthesis system kit를 사용합니다. 해당 키트에는 2 µg의 RNA를 cDNA로 전환하는 방법이 안내되어 있습니다. 당사는 6~10 µg의 RNA를 투입하고 이에 맞춰 반응 규모를 조절하는 것을 권장합니다.

에탄올 침전법 또는 Promega Wizard DNA cleanup 시스템을 사용하여 cDNA를 정제하십시오. 제조사의 지침에 따라 샘플을 -80 °C에서 보관하십시오. 이 시점에서 이중 가닥 cDNA를 직접 시퀀싱할 수 있습니다. 10 L의 해수로부터 약 10 µg의 환경 RNA를 추출하고 20배로 증폭하였으며, 증폭된 mRNA를 이중 가닥 cDNA로 전환하여 환경 전사체의 시퀀싱 및 분석에 충분한 양의 물질을 생성하였습니다. 지금까지 환경 메타전사체학을 이용하여 해양 미생물 군집의 유전자 발현을 평가하는 방법을 살펴보았습니다.

본 절차를 수행할 때 mRNA는 빠르게 분해되며 RNA는 어디에나 존재한다는 점을 항상 유념하십시오. 따라서 RNase-free 환경에서 작업하기 위한 표준 예방 조치를 취하고 샘플을 최대한 신속하게 처리하십시오. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.