환경 Transcriptomics를 사용하여 해양 미생물 커뮤니티의 유전자 발현 분석

이 절차는 5개 및 3개의 마이크로미터 필터를 통한 사전 여과를 통해 물 샘플에서 해양 미생물 바이오매스를 획득한 다음 0.22마이크로미터 필터로 수집하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 0.22 마이크로미터 필터에 남아 있는 유기체에서 총 RNA를 추출합니다. 우리의 RNA는 선택적 효소 분해 및 빼기 혼성화에 의해 전체 RNA에서 제거되며, 농축 된 Mr.N은 polyA 테일링 및 시험관 내 전사를 통해 선형으로 증폭됩니다.

그런 다음 증폭된 안티센스 RNA는 무작위 헥사머를 사용하여 이중 가닥 CD NA로 변환됩니다. 결과 CD NA는 복제 및 시퀀싱 또는 직접 파이로 시퀀싱될 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 조지아 대학교 해양과학부 마리안 모란 박사 연구실의 레이첼 퍼스키입니다.

오늘은 환경 시료에서 유전자 발현을 관찰하는 절차를 보여드리겠습니다. 환경 메타 전사체학을 사용합니다. Scott Gifford가 RNA 채취를 위해 환경 시료를 처리하는 방법을 보여줍니다.

샘플에서 RNA를 추출하는 방법과 Johanna RIN을 보여드리겠습니다. AON은 RNA 제거를 시연할 것입니다. 그런 다음 Maria Kosta는 RNA 증폭 및 CD NA 합성 단계를 거칩니다.

시작하겠습니다. 환경 RNA 수집을 시작하기 위해 튜브의 한쪽 끝을 샘플링을 위해 원하는 깊이의 물에 배치하고 반대쪽 끝을 튜브의 두 끝 사이에 펌프를 배치하는 대용량 3마이크로미터 필터에 연결하여 필터 라인 시스템을 설정합니다. 그런 다음 3마이크로미터 필터는 0.22마이크로미터 필터 타워에 연결되고 유출은 0.22마이크로미터 타워에서 눈금이 매겨진 화물로 향합니다.

시스템을 통해 몇 리터의 물을 흘려보내 헹굽니다. 완료되면 펌프가 작동하는 동안 물에서 튜브를 제거하여 라인에 남아 있는 물을 제거합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 필터 타워에 0.22마이크로미터 필터를 놓고 닫습니다.

라인의 끝을 다시 물에 넣고 펌프를 켭니다. 두 필터에서 공기를 제거하고 카보이로 여과된 물의 양을 모니터링합니다. 원하는 부피가 여과되면 물에서 라인을 제거하고 시스템에서 남은 물을 제거합니다.

필터가 건조되는 즉시 상단 필터 플레이트를 빠르게 제거하고 필터 용지를 접습니다. 필터를 소용돌이 팩에 넣고 액체 질소에서 눕니다. 실험을 시작하기 전에 RNA는 어디에나 있고 mRNA는 빠르게 분해되기 때문에 작업 표면 및 피펫을 포함하여 리보뉴클레아제가 없는 환경에서 작업하기 위한 표준 예방 조치를 따라야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

이를 염두에 두고 이 절차에 사용된 모든 재료를 취급할 때는 깨끗한 장갑을 착용해야 합니다. 그리고 샘플은 가능한 한 짧은 시간에 처리되어야 합니다. 0.22 마이크로미터 필터에서 총 RNA 추출을 시작하기 위해 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 베타 메토 에탄올이 첨가된 8ml의 RLT 버퍼를 추가하여 비드 비드 튜브를 준비합니다.

그런 다음 이동식 동력 토양 추출 키트에서 1-2밀리리터의 RNA 비드를 추가합니다. 냉동실에서 얼어붙은 필터를 빠르게 꺼내 월드 팩에 보관하십시오. 망치로 부수십시오.

준비된 50ml 원뿔형 튜브에 부서진 필터를 넣고 튜브 뚜껑을 퍼퓸 또는 실험실 테이프 와류로 10분 동안 밀봉합니다. 그런 다음 50 밀리리터 튜브를 5, 000 RPM에서 1 분 동안 원심 분리하십시오. 실온에서 용해물을 최대한 많이 제거하고 15ml 튜브에 옮긴 후 다시 5분 동안 원심분리합니다.

5에, 000 시간 G, 상등액은 새로운 50 밀리리터 관으로 그 때 옮겨지고 100%ethanol의 1개의 양은 용해물에 추가됩니다. 10밀리리터 주사기를 사용하여 18-21 게이지 바늘을 통해 용해물을 끌어올려 약 5회 정도 다시 배출합니다. 후속 추출 단계에서는 제조업체의 지침에 따라 KaiGen R 및 easy mini kit를 사용하여 진공 매니폴드 또는 반복 원심분리를 통해 제공된 컬럼에 용해물을 도포합니다.

전체 RNA 스펙트럼을 측광으로 정량화합니다. 총 RNA 수율을 측정한 후 제조업체의 지침에 따라 Ambien turbo DNA free 키트를 사용하여 DNA 오염을 제거합니다. 이제 RNA 추출이 완료되었으니, 첫 번째와 두 번째 RRNA 제거 단계를 수행할 Johanna에게 전체 RNA를 넘겨주겠습니다.

고마워요 레이첼. RRNA 제거를 시작하려면 멸균 RNA가 없는 0.5 밀리리터 튜브에서 사용하기 전에 mRNA를 반응 완충액의 10배만 부드럽게 혼합하고 간단히 원심분리하고, 10배 반응 완충액 RNA 억제제, 총 RNA 샘플 및 종결인자 엑소뉴클레아제를 적절한 부피로 결합합니다. 진원지 프로토콜에 따라 가열된 뚜껑 또는 수조가 있는 열순환기에서 섭씨 30도에서 60분 동안 반응을 배양합니다.

다음으로, 총 부피 200 마이크로 리터에 먼저 RNA 자유수를 첨가 한 다음 mRNA 원심 분리기에 1 부피의 페놀 클로로포름 용액을 첨가하여 페놀 에탄올 침전으로 반응을 종료합니다. 수성 상을 수집 한 다음 100 % 에탄올과 공격으로 침전시킵니다. 이것은 잠재적인 정지 지점입니다.

RNA는 다운스트림 응용 분야에서 샘플을 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 첫 번째 mRNA 농축이 완료되면 제조업체의 지침에 따라 Ambien 미생물 농축 및 미생물 익스프레스 키트를 사용하여 샘플에서 잔류 RRNA를 제거할 것입니다. 진핵생물 RRNA의 제거를 용이하게 하기 위해 Microbe Enrich Kit를 사용할 것입니다.

모든 볼륨은 제조업체의 지침을 읽고 결정됩니다. 피펫을 시작하려면 300마이크로리터의 결합 완충액을 1.5ml 튜브에 넣습니다. 최대 30마이크로리터 부피와 와류에 총 5-100마이크로그램의 RNA를 추가합니다.

결합 완충액에 RNA 5마이크로그램에 대한 2마이크로리터의 포획 올리고 믹스를 부드럽게 추가하고 튜브를 부드럽게 두드립니다. 혼합물을 간단히 회전시킵니다. 혼합물을 섭씨 70도에서 10분 동안 변성시킨 후 혼합물을 섭씨 37도에서 1시간 동안 무릎을 꿇습니다.

이 배양 중에 올리고 매그 비드를 뉴클레아제가 없는 물에서 한 번, 결합 완충액에서 한 번 세척하고 세척 사이에 마그네틱 스탠드에 비드를 캡처하여 준비합니다. 구슬을 얼음에 보관하고 실온으로 데우십시오. 사용하기 5분 전에 열 블록에서 세척 용액을 섭씨 37도로 가열하십시오.

세척된 올리고 매그 비드에 RNA capture oligo mix를 첨가하고 튜브를 부드럽게 혼합한 다음 회전시킵니다. 믹스를 섭씨 37도에서 15분 동안 잠시 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 약 3분 동안 기다렸다가 상등액이 포함된 mRNA를 흡인한 다음 얼음 위의 수집 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 100마이크로리터의 사전 예열된 세척 용액을 포획된 비드에 추가합니다. 그리고 부드럽게 와류는 구슬을 붙잡고 상등액 바보를 복구합니다. 얼음 위의 수집 튜브에 Mr.NA 있는 이 상등액.

잔류 원핵생물인 RRNA를 제거하는 데 사용할 ambi microbe Express Kit를 사용하여 원핵생물 RRNA를 제거할 준비를 하는 동안 얼음 위에 수집 튜브를 놓습니다. 바이오분석기 또는 익스페리온을 사용하여 RRNA 오염 및 MR을 확인합니다. NA 품질. 이것은 잠재적인 정지 지점입니다.

RNA는 섭씨 영하 80도에서 저장할 수 있습니다. RRNA가 제거되면 제조업체의 지침에 따라 Ambien 메시지 AMP two bacteria kit를 사용하여 mRNA를 증폭합니다. 이제 순수한 mRNA 샘플이 생겼으니 Maria에게 실험을 넘기고 Maria는 mRNA 증폭 및 CDNA 합성을 안내해 드리겠습니다.

고마워요, 한나. mRNA 증폭을 시작하기 전에 온라인으로 Ambien 메시지 AMP 두 박테리아 키트 마스터 믹스의 각 구성 요소의 부피를 계산하고 최대 1000나노그램의 총 RNA를 멸균 RNA free 마이크로 퍼지 튜브에 배치하여 템플릿 RNA의 폴리아데닐화를 시작합니다. 첫 번째 버퍼에 6.5마이크로리터의 시료를 사용하고 RNA 자유수를 사용하지 않고 시험관 내 전사를 통해 RNA를 합성합니다.

균일한 온도 때문에 혼성화 오븐 또는 인큐베이터를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 튜브 내부에 응결이 형성되지 않는 것이 매우 중요하기 때문에 14시간 in vitro transcription reaction incubation을 강력히 권장합니다. 가장 높은 A RNA 수율을 위해 RNA 수율을 최대화하기 위해 40마이크로리터의 최종 반응 부피에서 IBT를 수행하고 약 10마이크로리터의 쿼트에서 섭씨 음의 80도에서 A RNA를 저장합니다.

RNA가 증폭되면 상보적 또는 CDNA를 합성할 차례입니다. Promega 범용 리봇 클론. CDNA 합성 시스템 키트는 NA에서 CD NA를 합성하는 데 사용됩니다. 이 키트는 NA에서 CD NA로 2마이크로그램을 변환하는 지침을 제공합니다. NA당 6-10마이크로그램을 입력하고 그에 따라 반응을 확장하는 것이 좋습니다.

에탄올 침전 또는 promega wizard DNA 클린업 시스템을 사용하여 CD NA를 세척합니다. 제조업체의 지침에 따르면, 섭씨 음의 80도에서 샘플을 보관하십시오 이중 가닥 CDNA는이 시점에서 10 리터의 바닷물에서 직접 시퀀싱 할 수 있으며, 약 10 마이크로 그램의 환경 RNA를 추출하고 증폭 된 MR의 변환을 통해 20 배로 증폭했습니다. NA 내지 이중 가닥 CDNA는 환경 전사체의 염기서열분석 및 분석을 위해 충분한 양의 물질을 생성하였다. 방금 환경 메타 전사체학을 사용하여 해양 미생물 군집의 유전자 발현을 평가하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 mRNA는 빠르게 분해되고 RNA는 어디에나 있다는 것을 항상 기억하십시오. 따라서 늑골 핵이 없는 환경에서 작업하기 위한 표준 예방 조치를 취하고 가능한 한 빨리 샘플을 처리하십시오. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.