Name: 환경 Transcriptomics를 사용하여 해양 미생물 커뮤니티의 유전자 발현 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: 배우세요 환경 mRNA에서 cDNA를 합성하여 해양 미생물의 유전자 발현을 분석하는 방법입니다. rRNA 제거, mRNA 증폭, 시퀀싱을 통해 해양 생태계의 분자적 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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기금은 고든 무어와 베티 재단 보조금 및 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 MCB - 0702125에 의해 제공되었다.

<ol><li>Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).</li>
<li>Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).</li>
<li>Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).</li>
<li>Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).</li>
<li>Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).</li>
<li>Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).</li>
</ol>

천연 미생물 커뮤니티에 의해 유전자 발현의 조사 미생물의 생태 역할과 기능을 탐구하는 수단으로 최근 몇 년 동안 일반되었다. 해양 미생물의 감지, 부량, 그리고 특성화와 함께 사용, 유전자 발현의 분석은 자연 미생물 지역 사회에 기능 phylogeny를 연결하는 데 사용할 수 있습니다. 기능성 유전자 발현을 대상으로 많은 기술은 특정 프로브 또는 알려진 일련의 유전자위한 프라이머 세트에 의존하고 있습니다. 대조적으로, 환경 transcriptomics 기존 시퀀스 데이터에 의해 적극적으로 표현되고 그 유전자에 대한 설정을 부과하는 제약없이 유전자 발현을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 환경에서 mRNA 수영장 분석 그러므로 핵심 활동과 그들을 중재 생물 사이의 발견 연결의 가장 효과적인 방법 중 하나를 제공할 수 있습니다. 환경 transcriptomics의 초기 응용 프로그램은 자연 생태계의 3 세균성 mRNA 수영장의 조성과 역학의 첫번째 전망 중 하...

<table><tbody><tr><td>PowerSoil 비드 튜브</td><td>키트</td><td>MoBio</td><td>12866-25-PBT</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini 키트</td><td>키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>키트</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>mRNA-ONLY 원핵생물 mRNA 분리 키트</td><td>키트</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MOP51010/MOP51024</td><td></td></tr><tr><td>MICROB&lt;em&gt;Express&lt;/em&gt; 박테리아 mRNA 농축 키트</td><td>키트</td><td>Ambion</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>MICROB&lt;em&gt;Enrich&lt;/em&gt; 키트</td><td>키트</td><td>Ambion</td><td>AM1901</td><td></td></tr><tr><td>MessageAmp II-박테리아 RNA 증폭 키트</td><td>키트</td><td>Ambion</td><td>AM1790</td><td></td></tr><tr><td>Universal RiboClone cDNA 합성 시스템</td><td>키트</td><td>Promega Corp.</td><td>C4360</td><td></td></tr><tr><td>Wizard DNA 정제 시스템</td><td>키트</td><td>Promega Corp.</td><td>A7280</td><td></td></tr></tbody></table>

환경 transcriptomics를 사용하여 해양 미생물 커뮤니티의 유전자 발현 분석

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

metagenomics 유사, 환경 transcriptomics (metatranscriptomics) 검색 및 커뮤니티 표현이 될 일을 유전자의 사전 지식없이도 미생물의 조립에서 시퀀스 환경 mRNAs합니다. 그러므로 그것은 사회의 유전자 발현에 가장 불편 관점을 제공합니다<em&gt; 현장에서</em&gt;. prokaryotic mRNAs은 일반적으로 비교적 간단 진핵세포 메시지의 고립을 폴리 (A) 꼬리가 부족 때문에 환경 transcriptomics 프로토콜은 기술적으로 어렵습니다<sup&gt; 1</sup&gt; 때문에 mRNAs의 비교적 짧은 반 삶의<sup&gt; 2</sup&gt;. 또한, mRNAs 훨씬 덜 풍부한 총 RNA 추출물에 rRNAs보다되며, 따라서 rRNA 배경은 종종 mRNA 신호를 압도. 그러나, 이러한 어려움의 일부를 극복을위한 기술은 최근에 개발되었습니다. 리버스 녹음과 환경 mRNAs를 증폭하기 위해 무작위 primers를 사용하여 복제 라이브러리를 작성하여 환경 transcriptomes 분석을위한 절차는 최근에 두 개의 서로 다른 자연 환경에서 성공적으로 설명했지만, 결과는 cDNA 합성을 시작하는 데 사용되는 임의 primers의 선택에 의해 편향된되었습니다<sup&gt; 3</sup&gt;. mRNA의 선형 증폭의 진보는 증폭 단계에서 무작위로 primers의 필요성을 사전에 제거하다 그것이 가능한 샘플의 수집과 처리 시간을 감소시키고 RNA 저하를 최소화 적은 시작 자료를 사용할 수 있도록<sup&gt; 4</sup&gt;.<em&gt; 체외에서</em확장 mRNA에 대한&gt; 전송 방법은 mRNA를 polyadenylating 및 성적 증명서의 3 월말에 T7 프로 모터를 통합하는 방식입니다. 증폭된 RNA (아르나)는 pyrosequencing하여 다음 임의 hexamers를 사용하여 cDNA를 두 번 좌초로 변환하고 직접 합성 수 있습니다<sup&gt; 5</sup&gt;. 역 알로하에서이 메서드의 첫 번째 사용은 미생물 사회의 유전자 발현을 특성화에 대한 유틸리티를 시연<sup&gt; 6</sup&gt;.

우리는 환경 mRNA로부터 cDNA 생성하는 방법을 제시한다. 일반적으로, 총 RNA는 먼저 환경에서 수집, rRNA는 선택, 제거 mRNA가 선택적으로 증폭되고 농축 mRNA 수영장에서 합성된 cDNA가 합성됩니다. 복구된 시퀀스는 표현 유전자를 식별하는 표준 생물 정보학 기술을 사용하여 주석하실 수 있습니다.

환경 Transcriptomics를 사용하여 해양 미생물 커뮤니티의 유전자 발현 분석

메타게노믹스와 유사하게, 환경 전사체학(메타전사체학)은 미생물 군집으로부터 환경 mRNA를 회수하고 서열을 분석하여...

이 절차는 5 µm 및 3 µm 필터를 통한 사전 여과 후 0.22 µm 필터에 포집하여 해수 샘플로부터 해양 미생물 바이오매스를 획득하는 것으로 시작합니다. 그다음 0.22 µm 필터에 잔류한 생물체로부터 총 RNA를 추출합니다. 선택적 효소 분해 및 감산 하이브리드화(subtractive hybridization)를 통해 총 RNA에서 rRNA를 제거하고, polyA tailing과 인비트로(in vitro) 전사를 통해 농축된 Mr.N을 선형적으로 증폭합니다.증폭된 antisense RNA는 이후 random hexamer를 사용하여 이중 가닥 cDNA로 전환됩니다. 이렇게 생성된 cDNA는 클로닝 및 시퀀싱을 하거나 직접 pyro sequencing을 수행할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 조지아 대학교 해양과학과의 Marianne Moran 박사님 연구실의 Rachel Persky입니다.오늘은 환경 샘플의 유전자 발현을 분석하는 절차를 보여드리겠습니다. 환경 메타전사체학(environmental meta transcriptomics)을 이용하는 방법입니다. Scott Gifford가 RNA 수집을 위해 환경 샘플을 처리하는 방법을 시연하겠습니다.샘플과 Johanna RIN에서 RNA를 추출하는 방법을 보여드리겠습니다. AON이 RNA 제거 과정을 시연할 것입니다. 이어서 Maria Kosta가 RNA 증폭 및 cDNA 합성 단계를 설명하겠습니다.그럼 시작하겠습니다. 환경 RNA 수집을 시작하기 위해, 튜브의 한쪽 끝을 샘플링하고자 하는 수심의 물속에 넣고 반대쪽 끝을 고용량 3 µm 필터에 연결하며, 펌프를 두 튜브 끝 사이에 배치하여 필터 라인 시스템을 구축합니다. 그 다음 3 µm 필터를 0.22 µm 필터 타워에 연결하고, 0.22 µm 타워에서 나오는 유출수는 눈금 실린더로 향하게 합니다.시스템을 세척하기 위해 수 리터의 물을 통과시킵니다. 세척이 끝나면 펌프를 가동하는 상태에서 튜브를 물에서 제거하여 라인에 남아 있는 물을 모두 배출하십시오. 다음으로, 핀셋을 사용하여 0.22 micrometer 필터를 필터 타워에 장착하고 닫습니다.라인의 끝부분을 다시 물속에 넣고 펌프를 켭니다. 두 필터 모두에서 공기가 완전히 빠져나가도록 하고, 카보이에 표시된 여과된 물의 부피를 모니터링합니다. 원하는 부피만큼 여과가 완료되면, 라인을 물에서 제거하고 시스템에 남아 있는 물을 배출합니다.필터가 마르는 즉

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

계절 hypoxic 피요르드의 수직 깊이 연속으로부터 격리 환경 게놈 DNA와 fosmid 라이브러리의 구축이 설명되어 있습니다. 그 결과 클론 라이브러리는 384 잘 접시에 들어서 자동 식민지 따기 시스템의 응용 프로그램에서 스트림 시퀀싱 및 기능 검사를 위해 보관됩니다.

대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

미생물 planktonic 커뮤니티에서 신진 대사 추출을위한 방법을 설명하고있다. 전체 지역 사회의 샘플링 특별히 준비 필터로 여과에 의해 이루어진다. lyophilization 후 수성 - 용해 metabolites가 추출됩니다. 이 접근법은 자연이나 실험적인 미생물 커뮤니티의 횡단 omics 조사에 환경 metabolomics의 적용을 허용합니다.

핵 자기 공명 분광학을 사용하여 환경 Metabolomics를위한 낮은 밀도 Planktonic 커뮤니티에서 Metabolites의 농도

미생물 군집을 특성화하는 것은 환경 미생물학의 오랜 목표였습니다. 차세대 염기서열분석 방법을 통해 이제 최소한의 비용과 노동력으로 전례 없는 깊이로 미생물 군집의 특성을 분석할 수 있습니다. 여기에서는 벤치탑 염기서열분석기를 사용하여 박테리아 16S 리보솜 RNA 유전자를 염기서열분석하는 접근 방식에 대해 자세히 설명합니다.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

여기에서는 외딴 해양 환경에서 유기 및 무기 영양소 가용성과 미생물 및 바이러스 군집의 풍부함 및 구조를 평가하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

이 원고는 DNA 마이크로어레이가 제공하는 최첨단 기술의 사용을 설명합니다. 마이크로어레이는 특정 조건에서 발생한 박테리아의 전사체 변화에 대한 개요를 제공합니다. 또한 편리한 사내 개발 소프트웨어 패키지를 사용하여 많은 양의 데이터를 쉽게 분석할 수 있다는 점을 강조합니다.

세균의 사체 분석 사례 연구에 대한 빠르고 안정적​​인 파이프 라인 : 세린에 의존하는 유전자 조절에<em&gt; 폐렴 구균</em

이 프로토콜은 바닷물에서 수집한 미생물 바이오매스에서 단백질과 DNA를 추출 및 농축한 후 탠덤 질량 분석 기반 단백질체 분석에 적합한 트립틱 펩타이드를 생성하기 위한 것입니다.

수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

우리는 감염 중 병원체 유전자 발현 프로파일링을 위해 빠르고 민감하며 재현성이 있는 프로토콜을 개발했습니다.

디지털 바 코딩 플랫폼을 사용에 감염 미생물의 유전자 발현 프로파일 링

실시간 PCR을 통해 해안 퇴적물의 박테리아 16S rRNA 유전자 및 전사체를 정량화하는 프로토콜이 제공됩니다. 이 방법론에는 DNA와 RNA의 공동 추출이 포함됩니다. DNA가 없는 RNA의 제조; 및 표준 곡선 구조를 포함한 RT-q-PCR을 통한 16S rRNA 유전자 및 전사체 정량화.

실시간 PCR에 의한 연안 퇴적물 및 정량 16S의 rRNA의 유전자 및 성적 증명서에서 동시 DNA-RNA 추출

여기에서는 물과 퇴적물 미생물 커뮤니티를 분석하여 인근 개울에 유압 파쇄가 미치는 영향을 조사하는 프로토콜을 제시합니다.

미생물 분자 서명을 사용하여 스트림에 유압 골절의 영향 평가

이 프로토콜은 남부 텍사스 해안 습지에서 주요 메탄 순환 유전자를 검출하고 공간 분포를 시각화하여 이러한 역동적인 생태계에서 메탄 조절과 메탄 조절이 환경에 미치는 영향에 대한 이해를 높입니다.

해안 습지에서 메탄 순환 미생물 역학 시각화

배우세요 환경 mRNA에서 cDNA를 합성하여 해양 미생물의 유전자 발현을 분석하는 방법입니다. rRNA 제거, mRNA 증폭, 시퀀싱을 통해 해양 생태계의 분자적 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

환경 Transcriptomics를 사용하여 해양 미생물 커뮤니티의 유전자 발현 분석

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