Name: Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 배우세요 Xenopus laevis 난모세포에 핵 수입 기질을 미세주입하고 초박절 전자현미경으로 관찰하는 방법입니다. 이 기법은 핵세포질 수송 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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우리는 baculovirus의 AcMNPV를 제공하고 도움 토론 데이비드 Theilmann을 (태평양 아그리 - 식품 연구 센터, 섬머, 브리티시 컬럼비아) 감사드립니다. 이 작품은 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI), 보건 연구 (CIHR), 보건 연구 (MSFHR)의 마이클 스미스 재단의 캐나다 연구소, 그리고 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에서 부여로 지원이 .

1 부 : microinjection에 대한 Xenopus의 oocytes의 작성 <ol><li> 88 MM NaCl, 1 MM KCl, 0.82 MM : 칼슘 무료 수정 바쓰의 호수에서 collagenase 용액 (5 MG / ML collagenase 20 ML을 포함하는 50 ML 원뿔 관에 Xenopus laevis의 난소의 작은 조각 (2cm에 대해) 장소 MgSO 4, 10 MM Hepes, 산도 7.5). Collagenase는 oocytes를 둘러싸고 뿌리 세포를 제거하는 데 사용됩니다. </li><li> 쉐이크 플랫폼에서 튜브를 장소와 한 시간 동안 (100 RPM에서) 부드럽게 그것을 바위. 이번 collagenase 다른 많은에 따라 다릅니다. 따라서 일시간 후, oocytes의 작은 샘플을 가지고 해부 현미경으로 그들을 검사합니다. 제대로 드 folliculated oocytes 잘 서로 구분해야하고, 그것은 oocyte에 유리 바늘을 삽입하기 쉬운해야합니다. oocytes가 충분히 드 folliculated하지 않으면, 그들은 collagenase 솔루션에 남겨진 또 수시로 확인하고 있습니다. </li><li> (MBS : 88 MM NaCl, 1 MM KCl, 0.82 MM MgSO 4, 0.33 MM 칼슘 (NO 3) 2, 0.41 MM CaCl 2, 10 MM Hepes, 산도 7.5) 수정 바쓰의 생리와 oocytes 세 번 씻으십시오, 그들을 전송 MBS 플러스 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는 100 mm 직경 페트리 접시에. oocytes 지금 microinjected 준비하고 있습니다. microinjection은 또 하루에 수행되는 경우, 최대 일주일 4 ° C에서 oocytes를 저장합니다. </li><li> 해부 현미경을 사용하여 microinjection을위한 성숙 단계의 VI oocytes를 선택합니다. 이러한 oocytes는 검은 동물 북반구와 크림 색깔의 식물 반구 사이 좋은 대조와 큰 있습니다. </li><li> microwell 접시 (Nunc, 10 μl 잘 볼륨)로 성숙 단계 VI의 oocytes을 전송합니다. 이것은 oocytes의 undisrupted 흡입을 허용하도록 끝에 절단되어 피펫 팁와 200 μl pipettor을 사용하여 신중하게 이루어져야합니다. </li></ol> 2 부 : Xenopus의 oocytes의 Microinjection <ol><li> microinjection의 시각화에 투입, 1 % bromphenol 파란색의 작은 금액을 추가하여 microinjected 수 가져오기 기판을 준비합니다. 예를 들어, 우리는 기판의 10 μl로 bromphenol 청색 1 μl를 추가합니다. </li><li> 100 mm 직경 페트리 접시에 Parafilm의 작은 스트립를 삽입하고, Parafilm 스트립에 주입하는 솔루션의 5 μl 드롭을 분배. </li><li> 주입하는 솔루션으로 이전에 보정 주사 바늘 (주사 + Matic 풀러와 6.6 - μl micropipette 드루먼드를 당기는 얻은) 입력합니다. 이 경우, microinjector는 열망 모드에 설정됩니다. 주사 바늘을 보정하기 위해서는 바늘 50 NL의 볼륨에 해당하는 모든 0.5 mm를 도트 표시합니다. </li><li> 세포질 주입 들어, 약 45도 각도에서 동물 반구에 아주 가까이, 식물 북반구에서 oocyte에 바늘의 끝부분을 삽입합니다. microinject에 microinjector 설정을 켜고, 그리고 수입 기​​판 50 NL 각 oocyte를 microinject. 바늘에 점 표시가 주입되어 기판의 크기를 모니터링하는 데 사용됩니다. </li><li> MBS 가득한 작은 (35 - mm 직경) 페트리 접시에 주입 oocytes를 전송하고, NPCs와 관련된 수입 기​​판의 관찰을 허용하는 등 (시간 포인트가 너무 선택됩니다 시간의 원하는 금액을 실온에서 품어, 이러한 문제가 발생합니다 단백질과 적극적으로 NPC쪽으로 이송 아르 사용할 수있는 최신 바이러스 예방 프로그램으로 10 ~ 30 분,이 시간은 또한) 주사의 사이트와 단백질 / 바이러스의 크기에 따라 달라집니다. </li><li> 배양이 완료되면, MBS의 2 % 글루 타 알데히드를 포함하는 4 - ML 유리관에 oocytes를 전송하고, 4 밤새 수정 ° C. </li></ol> 파트 3 : Xenopus의 oocytes의 해부 <ol><li> 다음날, MBS와 oocytes에게 3 회 씻는다. </li><li> 낮은 소금 버퍼 (1 ㎜ KCl, 0.5 MM MgCl 2, 10 MM HEPES, pH를 7.5 LSB) 가득한 작은 페트리 접시에 oocytes를 전송합니다. 해부 현미경을 사용하고 핀셋을 해부하고, 각 oocyte에서 식물 장대를 제거합니다. 다른 쌍 식물 기둥을 제거하기 위해 가위처럼 사용할되는 동안 그것은 핀셋 한 쌍의와 해부되는 oocyte를 안정화하는 데 유용합니다. 이 시점에서 그것은 cytosol에서 파란색 가미의 존재에 의해 microinjection의 성공 여부를 평가하는 것이 가능합니다. 프로토콜은 성공적으로 microinjected 있던 oocytes 지속됩니다. 또한, 샘플은 EM에 대비하려면이 절개의 단계는 트리밍과 샘플을 sectioning 때 핵을 찾을 수가 훨씬 더 쉬워집니다. </li><li> 실온에서 한 시간 만이라도 LSB의 2 % 글루 타 알데히드와 함께 다시 해부 oocytes을 수정. </li><li> 고정 후, LSB와 해부 oocytes 세 번 씻으십시오. </li></ol> 4 부 : 삽입 및 EM을 희석 - Sectioning위한 속이고 Oocytes의 작성 <ol><li> 우울증의 슬라이드를 해부 oocytes을 전송합니다. POS로 액체로 많은 기음(그래서 그들이 건조하지 않도록) 시블하고 신속하게이 2% 낮은 용융 아가로 오스와 해부 oocytes을 커버. 아가로 오스가 여전히 부드럽고 있지만, 서로 oocytes를 구분하기 위해 피펫 팁을 사용하고 각 oocyte가 아래로 얼굴 아니면되도록합니다 (옆으로). </li><li> 아가로 오스는 약 10 분 동안 응고하도록 허용합니다. 아가로 오스는 굳은되면, 작은 조각 하나를 해부 oocyte를 포함하는 각에 아가로 오스를 잘라 면도날을 사용합니다. </li><li> 4 ML 유리관에있는 아가로 오스 - 임베디드 oocytes를 삽입하고, 실온에서 한 시간 만이라도 1퍼센트 LSB에서 오소 4를 이후 수정. </li><li> 샘플에게 LSB에 세 번 씻으십시오. 필요한 경우, ° C 하룻밤 4 샘플을 저장하고 다음날 프로토콜을 계속합니다. </li><li> 순차적으로 (20 분 각 50, 70, 및 90 % 에탄올) 알코올의 오름차순 일련의 샘플을 탈수. 이것은 15 분 각각에 대해 100 %의 에탄올에 두 변경을합니다. 마지막 15 분 100 %의 아세톤과 샘플을 탈수. </li><li> 적어도 6 시간 동안 2시 1분 두 시간 동안 Epon와 아세톤의 혼합, 그리고 마지막으로 순수 Epon으로하여 침투 다음 한 시간 만이라도 1:1 Epon의 혼합물 (Fluka) 및 아세톤과 샘플을 침투. </li><li> 평면 포함 금형에 넣어 샘플 신선한 순수 Epon으로 가득. oocytes 같은 방식으로 지향하는 가까이 사출 사이트로 핵의 측면 -이 경우에는 해부되었습니다 oocytes의 측면은 - 먼저 sectioned 것입니다. 이 단계는 선택된 기판의 수입을 시각화의 기회를 최적화합니다. </li><li> 마지막으로, 60 이틀 ° C.에 대한 Epon을 중합 </li><li> 샘플을 시각화하기 위해 블록이 ultramicrotome를 사용하여 다듬은 후 sectioned 있습니다. 섹션은 표준 절차를 사용하여 스테인드 EM의 격자,에 전송하고, 전송 전자 현미경으로 시각. 그것이 표준 EM 절차이므로 우리는 프로토콜의이 부분을 표시하지 않습니다됩니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 : 프로토콜이 성공적 않은 경우 다음 핵 봉투 (NE)와 NPCs는 EM micrographs에 명확하게 표시해야합니다. 기판 주입 및 주입과 고정 사이의 시간의 양에 따라, 기판은 NPC에서 또는 NPC의 핵 얼굴, NPC의 세포질 얼굴을 볼 수 있습니다. 그림 1은 4 시간 동안 ° C 4 incubated baculovirus AcMNPV의 capsids로 주입되어 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 단면 NE, 그리고 퍼가기 얇은 섹션에 대한 처리를 보여줍니다 EM은 설명했다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. NPC의 세포질 얼굴 capsid 도킹은 흰색 화살표로 표시됩니다. 반대로, 그림 2는 네 시간 동안 실온에서 incubated 마우스의 파르 보 바이러스의 할인 바이러스 (MVM)으로 주사되어있는 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 단면 NE를 보여줍니다, 그리고 삽입 및 EM과 같이 설명 얇은 섹션을 처리했습니다. 이 기법을 사용, 우리는 MVM은 NE (코헨과 Panté, 2005)의 혼란을 유도 것으로 나타났습니다. 괄호는 NE에 휴식을 나타냅니다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. NE와 관련된 Putative MVM의 capsids는 흰색 화살표로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="그림 1" width="600" height="459" /> 그림 1 : 4 incubated, baculovirus AC MNPV의 capsids로 주입되어 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 NE의 단면의 전자 현미경 ° 네 시간 동안 C, 그리고에 대한 처리 퍼가기과 얇은 부분 EM은 설명했다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. Capsids은 흰색 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 : 100 NM. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="그림 2" width="600" height="264" /> 그림 2 : 네 시간 동안 실온에서 incubated 마우스의 파르 보 바이러스의 할인 바이러스 (MVM)으로 주사되어있는 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 NE의 단면의 전자 현미경과 삽입 및 EM과 같이 설명 얇은 섹션을 처리했습니다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. 괄호는 NE에 휴식을 나타냅니다. NE와 관련된 Putative MVM의 capsids는 흰색 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 : 100 NM.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

얇은 sectioning EM과 함께 Xenopus의 oocytes의 Microinjection은 nucleocytoplasmic 전송을 연구를위한 매우 효과적인 도구입니다. 이 시스템은 같은 세포질 섬유와 핵 바구니 (Panté 2006에서 검토)로 NPC의 구조 구성 요소와 핵 수입 기​​판의 예를 들어 상호 작용에 대해, NPC를 통해 수입의 서로 다른 단계를 매핑하는 데 사용되었습니다. 또한 원자력 복제 바이러스의 핵 수입 (; 레이브 외, 2003;. 코헨과 Panté 2005 Panté와 칸, 2002) 연구에 사용되고 있습니다. 여기에 표시된 세포질 microinjection 기법 중 하나는 변형 핵 수출 기판 (Panté 외., 1997)의 핵 microinjection입니다. 핵 주사를 수행하려면, oocytes는 동물 채를가 얼굴 있도록 지향, microwell 접시에 배치, 4 ° C 하룻밤에 incubate...

xenopus laevis의 oocytes의 microinjection

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

얇은 sectioning 전자 현미경 (EM) 다음 Xenopus laevis의 oocytes의 Microinjection은 nucleocytoplasmic 전송을 공부하고있는 훌륭한 시스템입니다. 때문에 대형 핵 및 핵 기공 단지 (NPCs)의 높은 밀도, 핵 수송 Xenopus oocyte의 시각에서 쉽게하실 수 있습니다. 원자력 수출입의 메커니즘에 많은 통찰력이 시스템의 사용 (Panté 2006 년 검토)를 통해 얻은되었습니다. 또한, 우리는 호스트 핵의 복제 여러 바이러스의 핵 수입 경로를 해부하다에 Xenopus의 oocytes의 microinjection을 사용했습니다. 여기서 우리는 핵 수입 기판과 Xenopus의 oocytes의 세포질 microinjection을 보여줍니다. 우리는 또한에 의해 시각화를위한 주입 oocytes의 준비를 보여 얇은 sectioning 해부, 탈수, 그리고 에폭시 수지에 포함 oocytes의 포함 포함 EM​​합니다. 마지막으로, 우리는 baculovirus Autographa californica의 nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) 또는 마우스 (MVM)의 파르 보 바이러스의 할인 바이러스의 capsid와 microinjected, 그리고 기술의 잠재적인 응용 프로그램을 논의했습니다 oocytes에 대한 대표적인 결과를 제공합니다.

여기의 세포질 microinjection을 보여주<em&gt; Xenopus laevis</em핵 수입 기​​판뿐만 아니라 박막 sectioning 전자 현미경에 의해 시각화를위한 주입 oocytes의 준비&gt; oocytes.

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

*Xenopus laevis* 난모세포에 대한 미세주입 후 박절 전자현미경(EM) 분석은 핵-세포질...을 연구하기 위한 우수한 시스템입니다.

Opus Lavu 난모세포에 대한 미세주입 후 박절 전자현미경 관찰은 핵-세포질 수송을 연구하는 데 매우 탁월한 시스템입니다. 본 실험에서는 콜라게나아제(collagenase)를 사용하여 난모세포의 난포층을 제거하고, 6단계 난모세포를 선택하여 멀티웰 디쉬에 배치합니다. 그 다음, 기질이 핵 내로 진입할 수 있도록 난모세포를 상온에서 배양한 후, 핵 수입 기질을 미세주입합니다.세포를 고정하고 박리합니다. 박리된 세포를 저융점 아가로스(low melting agarose)에 매립하고, 사산화오스뮴(osmium tetroxide)으로 다시 고정한 후 탈수하여 에폭시 수지에 매립합니다. 에폭시 수지에 매립된 시료를 울트라 마이크로톰(ultra microtome)으로 절편화하고, 해당 절편을 구리 EM 시료 그리드 위에 올립니다.염색 후, 절편을 투과 전자 현미경으로 관찰합니다. 안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 동물학과의 Nellie Pane 박사 연구실 소속 Sarah Cohen입니다. 저는 같은 Pane 연구실의 Shelly Ow입니다.오늘은 Xenopus laevis 세포의 미세주입 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 바이러스와 같은 화물의 핵 수입을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.실험을 시작하려면, 약 2cm 크기의 Xenopus laevis 난소를 20mL의 콜라게나제 용액이 담긴 50mL 원추형 튜브에 넣습니다. 콜라게나제는 난모세포를 둘러싸고 있는 난포 세포를 제거합니다. 그 다음, 튜브를 쉐이커 플랫폼에 놓고 100RPM으로 30분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 이 시간은 콜라게나제의 로트(lot)별로 다를 수 있습니다.1시간 후, 세포의 소량을 샘플로 채취하여 해부 현미경으로 관찰하십시오. 탈엽(defoliation)이 적절하게 이루어진 세포는 서로 잘 분리되어 있어야 합니다. 유리 니들을 세포에 삽입하여 부드럽게 들어가는지 확인하십시오.세포의 탈엽이 충분히 이루어지지 않은 경우, 콜라게나제 용액에 그대로 두고 5분마다 다시 확인하십시오. 세포의 조절 해제가 충분히 이루어지면, 수정된 bar 식염수로 3회 세척한 후 1% Penicillin streptomycin이 포함된 MBS가 담긴 100 mm 페트리 접시로 옮깁니다. 해부 현미경을 사용하여 미세주입을 위한 성숙한 6단계 세포를 선택하십시오.이 난모세포들은 크기가 크며, 검은색의 동물극과 크림색의 식물극 사이의 대비가 뚜렷합니다. 성숙한 6단계 난모세포들을 멀티웰 디쉬로 옮깁니다. 이를 위해, 난모세포가 손상되지 않고 흡입될 수 있도록 끝부분을 자른 팁을 장착한 200 µL 피펫을 사용하여 난모세포를 멀티웰로 조심스럽게 옮깁니다.우리는 웰 용량이 10 µL인 마이크로웰 디쉬를 사용합니다. 이제 EO 부위에 마이크로인젝션을 수행할 준비가 되었습니다. 기질 10 µL에 1% brom phenol blue 1 µL를 첨가하여 마이크로인젝션용 기질을 준비합니다. brom phenol blue 염료는 마이크로인젝션 과정을 시각화하는 역할을 합니다.그런 다음 100 millimeter 직경의 페트리 접시에 파라필름 조각을 작게 잘라 놓은 뒤, 파라필름 위에 주입 용액 5 microliter 한 방울을 떨어뜨립니다. 다음으로, 6.6 microliter Drummond 마이크로 피펫을 매트 풀러(Matt Puller)로 당겨 주입용 바늘을 제작합니다. 바늘에 0.5 millimeters 간격으로 점을 찍어 주입 바늘을 보정하며, 이는 50 nanoliters의 부피에 해당합니다. 마이크로 인젝터를 흡입 모드로 설정하고, 세포질 주입을 위해 바늘에 주입 용액을 채웁니다.바늘 끝을 동물극에 매우 인접한 식물극 반구의 세포 내로 약 45도 각도로 삽입하십시오. 그다음 마이크로 인젝터 설정을 마이크로 인젝션으로 전환하고, 각 세포에 50 nanoliters의 유입 기질을 마이크로 인젝션하십시오. 주입이 완료되면 바늘에 표시된 점들을 확인하여 주입된 기질의 양을 모니터링하십시오.세포를 MBS가 채워진 35 millimeter 페트리 접시로 옮깁니다. 세포를 실온에서 원하는 시간 동안 배양합니다. 핵공 복합체(nuclear pore complexes, NPCs)와 관련된 기질의 유입을 관찰할 수 있는 시간대를 선택하십시오.NPC로 능동 수송되는 단백질 및 바이러스의 경우, 일반적으로 10분에서 30분 사이의 시간대를 사용합니다. 이러한 시간대는 주입 부위와 단백질 및 바이러스의 크기에 따라 달라집니다. 배양이 완료되면, MBS 내 2% glutaraldehyde가 포함된 4 mL 유리 바이알로 세포를 옮겨 4 °C에서 하룻밤 동안 고정합니다. 다음 날, MBS로 세포를 세 번 세척하면 세포 해부 준비가 완료됩니다.세포들을 저염 버퍼가 채워진 작은 페트리 접시로 옮깁니다. 해부 현미경과 해부용 핀셋을 사용하여 각 난모세포에서 식물극(vegetal pole)을 제거합니다. 한 쌍의 핀셋으로 난모세포를 고정하는 동안 다른 한 쌍의 핀셋을 가위처럼 사용하여 식물극을 제거하는 것이 유용하며, 이 해부 단계는 전자 현미경 관찰을 위해 샘플을 트리밍하고 절편을 만들 때 핵을 훨씬 더 쉽게 찾을 수 있게 해줍니다.이 단계에서 세포질에 푸른색 색조가 나타나면 미세주입이 성공적으로 이루어진 것임을 나타내며, 미세주입이 성공하지 못한 세포들은 폐기합니다. 다음으로, LSB 내의 2% glutaraldehyde로 적출된 세포들을 실온에서 1시간 동안 다시 고정합니다. 고정 후, 적출된 세포들을 LSB로 세 번 세척합니다. 세포 세척이 완료되면, 주입된 난모세포를 임베딩 및 박절(thin sectioning)하기 위해 준비할 수 있습니다.분리된 난모세포를 오목 슬라이드로 옮기고 액체를 가능한 한 많이 흡입한 다음, 세포가 건조되지 않도록 신속하게 작업하십시오. agarose가 아직 부드러운 상태일 때 2% 저융점 agarose로 분리된 세포들을 덮습니다. 피펫 팁을 사용하여 세포들을 서로 분리하고, 각 세포가 옆으로 눕지 않고 위나 아래를 향하도록 정렬하십시오.Agros가 약 10분 동안 응고되도록 둡니다. Agros가 응고되면 면도날을 사용하여 해부된 cyte가 하나씩 포함된 작은 조각으로 aros를 자릅니다. 그런 다음 aros에 매립된 cytes를 4 mL 유리 바이알에 넣고, 로타리 믹서를 사용하여 실온에서 LSB 내 1% osmium tetroxide로 1시간 동안 고정합니다.1시간 동안 고정한 후, 필요한 경우 LSB로 시료를 3회 세척합니다. 시료를 4°C에서 하룻밤 동안 보관하고 다음 날 프로토콜을 계속 진행합니다. 50%, 70%, 90% 에탄올 순으로 각각 20분씩 시료를 단계적으로 탈수시킨 다음, 100% 에탄올에서 15분씩 2회 탈수시킵니다.마지막으로 샘플을 100% acetone으로 15분 동안 탈수합니다. 탈수 단계가 완료되면 epon, flua 및 acetone의 1:1 혼합액으로 샘플을 1시간 동안 침투시킨 후, epon과 acetone의 2:1 혼합액으로 2시간 동안 침투시키고, 마지막으로 순수 epon에 최소 6시간 동안 침투시킵니다. 최종 침투 단계가 완료되면 신선한 순수 epon이 채워진 평평한 임베딩 몰드에 샘플을 넣습니다.핵의 측면 중 주입 부위에 더 가까운 쪽이 절단되도록 세포를 배치합니다. 이 경우, 해부된 세포의 측면이 절단됩니다. 우선, 이 단계는 선택한 기질의 유입을 시각화할 가능성을 최적화합니다.세포가 적절하게 배향되면, 60 °C에서 이틀 동안 에폭시 수지를 중합합니다. 중합 단계 후, 울트라 마이크로톰을 사용하여 에폭시에 매입된 시료를 50 nm 두께로 절편합니다. 구리 EM 시료 그리드에 절편을 수집하고, 시료를 염색한 후 투과 전자 현미경으로 관찰합니다.프로토콜이 성공적으로 수행되었다면, 전자현미경 사진에서 핵막과 NPC가 명확하게 관찰되어야 합니다. 주입된 기질과 주입 후 고정까지의 시간 간격에 따라, 기질은 NPC의 세포질 면 또는 NPC의 핵 면에서 관찰될 것입니다. 이 대표적인 결과는 vao 바이러스의 캡시드가 주입된 zenap 세포의 인접한 세포질과 핵이 포함된 핵막 횡단면을 보여줍니다.A-C-M-N-P-V 화살촉은 NPC를 가리키며, NPC의 세포질 면에 도킹된 캡시드는 흰색 화살표로 표시되어 있습니다. 이와 대조적으로, 본 그림은 마우스 파르보바이러스가 주입된 zenap 난모세포의 핵막 단면과 인접한 세포질 및 핵을 보여줍니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 MVM이 핵막의 파괴를 유도한다는 것을 발견했습니다.대괄호는 핵막의 파열 부위를 나타냅니다. 화살표 머리는 NPC를 가리키며, 핵막과 연관된 추정 MVM 캡시드는 흰색 화살표로 표시되어 있습니다. 지금까지 xap levu cytes를 미세 주입하고 분리하는 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때, 콜라게나제(collagenase)의 로트(lot)마다 성능이 다를 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 콜라게나제를 신중하게 테스트하여 탈엽(defoliation)에 최적화된 시간을 결정하십시오. 또한, 탈엽 및 MBS 세척 단계 이후에 세포를 미세주입 전까지 4 °C에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다.마지막으로, glute all은 항상 얼음 위에 보관하고 osis가 마르지 않도록 주의하십시오. 모든 탈수 및 침투 단계 동안 샘플이 완전히 잠겨 있어야 합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis 미성숙 난모세포를 조작하는 방법, 난자에서 난자로의 체외 성숙 및 세포질 내 정자 주입을 설명합니다. 이 프로토콜은 일부 모계 단백질의 분해와 수정 시 관심 유전자의 과발현을 허용하므로 초기 배아 발달에서 특정 요인의 역할을 연구하는 데 가치가 있습니다.

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

단백질 합성 조절은 주로 번역 시작 단계에서 발생하며, 결핍은 다양한 장애와 관련이 있습니다. 이들의 병인을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 여기에서 번역 시작 인자 eIF4G1의 돌연변이가 있는 상태에서 mos 전사체의 번역을 평가하는 Xenopus laevis 난모세포를 사용하는 프로토콜에 대해 설명했습니다.

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

여기에서는 운명 지도와 계통 추적자를 사용하여 Xenopus laevis 배아의 신장을 생성하는 개별 할구에 주입하는 프로토콜을 제시합니다.

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

단일 여포의 분리, 세포질 RNA 미세 주입, 주변 세포층 제거 및 Xenopus 난모세포의 단백질 발현을 위한 최적화된 절차에 대해 설명합니다. 또한 리간드 게이트 이온 채널을 사용한 전기생리학적 실험에서 빠른 용액 변화를 위한 간단한 방법이 제시됩니다.

Xenopus의 난 모세포 : 미세 주입을위한 최적화 방법, 여포 세포 레이어의 제거 및 전기 생리 실험에서 빠른 해결 방법 변경

이 기사에서는 이온 채널에서 구조적 재배치를 조사하기 위해 말레이 미드 염료 대신 형광 비정상적인 아미노산 (fUAA)이 사용되는 기존의 VCF (Voltage-Clamp Fluorometry)의 향상에 대해 설명합니다. 이 절차에는 Xenopus oocyte DNA 주입, RNA / fUAA 동시 주입, 동시 전류 및 형광 측정이 포함됩니다.

전압 클램프 형광 측정법<em&gt; Xenopus</em&gt; 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포

이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

여기서 우리는 Xenopus 난모세포에서 갭 접합 단백질을 발현하고 하이 사이드 전류 측정 모드에서 이중 난모세포 전압 클램프 기록을 위해 설계된 상용 증폭기를 사용하여 두 개의 apposed 난모세포 사이의 접합 전류를 기록하는 프로토콜을 제시합니다.

제노푸스 난모세포로부터의 갭 접합 전류 기록

배우세요 Xenopus laevis 난모세포에 핵 수입 기질을 미세주입하고 초박절 전자현미경으로 관찰하는 방법입니다. 이 기법은 핵세포질 수송 메커니즘 연구에 필수적입니다.

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

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