Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

이 절차는 morpho 및 in vitro 전사된 cap mRNA를 준비하는 것으로 시작됩니다. 마이크로 피펫은 모르포(morpho) 함유 용액을 사이펀(siphoning)하여 충전된 다음 마이크로미터 1 세포 단계를 사용하여 주입량을 보정합니다. 그런 다음 제브라피시 배아를 채취하여 난황 마이크로 주입을 위해 미세 주입 챔버에 배열합니다.

작업 용액은 세포 바로 아래의 난황에 주입되고 세포질 운동은 세포 마이크로 주입을 위한 용액을 운반하는 데 사용됩니다. 주사 후 용액을 세포 세포질에 주입합니다. 섭씨 28.5도의 E 3 배지에서 배아를 배양하고 후속 단계에서 관심 표현형에 대한 점수를 매깁니다.

안녕하세요, 저는 예일 대학교 의과 대학의 유전학과이자 Dr.Sasha의 아들이자 실험실의 Shiloh Yuen입니다. 오늘 우리는 제브라피시에서 mRNA 과발현 및 모르포 올리고 뉴클레오티드 유전자 녹다운 연구를 수행하기 위한 강력한 미세주입 기술을 시연할 것입니다. 우리는 낭포성 신장 질환에서 S 섬모의 역할을 연구하기 위해 실험실에서 이 절차를 활용합니다.

시작하겠습니다. 유전자 기능 연구를 위한 한 가지 강력한 접근 방식은 얼룩말 물고기 배아에 체외로 전사된 캡이 있는 RNA를 마이크로 주입하는 것입니다. 이 시연에서는 EGFP 태그가 지정된 전사체를 마이크로 주입하고 성공적인 주입을 위한 가시적인 판독값으로 살아있는 전체 배아 GFP 발현을 사용합니다.

먼저, 관심 있는 전사체에 대해 in vitro cap RNA 전사 반응을 수행합니다. 실험실에서는 관심 있는 A-C-D-N-A를 PC two plus 벡터에 일상적으로 삽입하고 M message M machine SP six kit를 사용하여 다량의 capped RNA에 대한 in vitro 합성 반응을 수행합니다. 다음으로, RN easy mini kit를 통해 RNA 샘플을 실행하거나 페놀 클로로포름 추출 및 이소프로판올 침전을 통해 RNA 샘플을 정제합니다.

RNA 제제의 농도를 신중하게 결정하고 주입 당일 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. RNA 샘플 와류를 가볍게 해동하고 잠시 스핀다운합니다. 이제 멸균수와 0.025-0.05%페놀 레드의 최종 농도로 작업 용액을 준비하고, 페놀 레드는 용액을 배아에 주입하기 위한 가시적인 마커 역할을 합니다.

여기서 우리는 0.05% 페놀 레드를 함유한 마이크로리터 EGFP mRNA당 100나노그램의 작업 용액을 준비할 것입니다. 마지막으로, 작업 샘플을 얼음 위에 보관하고 RNA 스톡을 섭씨 영하 80도로 되돌립니다. 이 샘플을 주입할 준비가 되면 모르포 준비를 진행합니다.

Morino 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 단백질의 번역을 차단하거나 prem NA를 변형하여 유전자 발현을 수정하는 데 널리 사용됩니다. 얼룩말 물고기의 스플라이싱 모르포스(morphos)는 유전자 기능을 무너뜨림으로써 강력한 역 유전학 도구 역할을 합니다. 여기서 우리는 pkd two의 번역 개시 부위를 표적으로 하는 morph oligo를 마이크로 주입합니다. 우리는 gene tools LLC에서 얻은 관심 유전자를 위해 특별히 설계된 300M의 모프 올리고를 일상적으로 사용합니다.

그런 다음 100마이크로리터의 멸균수를 추가하여 3밀리몰 스톡 용액을 만든 다음 용액을 분취하고 주입 당일에 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 모리노 용액을 섭씨 65도에서 5분 동안 가열합니다. 그런 다음 용액을 얼음 위에서 즉시 찰칵 식히고 간단히 회전시키며, 이 단계는 올리고의 2차 구조를 변성시키고 용액이 완전히 용해되도록 합니다.

다음으로, Morpho 용액을 멸균수와 0.025 - 0.05%pinal red의 최종 농도로 희석하여 작업 용액을 준비합니다. 이 시연에서는 0.05%페놀 레드가 포함된 0.5밀리몰 PKD 2 모리노의 작업 솔루션을 준비할 것입니다. 작업 용액을 실온에 보관하고 이 샘플을 주입할 준비가 되면 마이크로 피펫 주입을 진행합니다.

시작하려면 주사에 사용할 마이크로 피펫을 제작해야 합니다. 이것은 마이크로 피펫 극성 장치에서 BOS 규산염 유리 모세관 튜브를 가열하고 당겨서 수행됩니다. 바늘을 뽑으면 소량의 점토 또는 접착 테이프 테이프 위에 페트리 접시에 보관합니다.

다음으로, 쐐기 모양의 홈통으로 성형된 하나의 XE 3개의 중간 플레이트에 1.5%aros를 부어 미세주입 챔버 플레이트를 준비합니다. 그것은 주사 중에 배아를 잡는 쉬운 방법으로 작용할 것입니다. 그런 다음 농업 챔버 플레이트를 응고시키고 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다.

마이크로 피펫 주입을 시작합니다. 집게 또는 수술용 면도날로 말단 끝을 잘라 50배 배율에서 해부 현미경으로 볼 수 있는 구멍을 만듭니다. 다음으로 작업 솔루션의 2 마이크로 리터를 배치하십시오.

커버 슬립에 한 방울 떨어뜨리듯이, 마이크로 피펫의 뒷면을 피하 주사 바늘에 튜브가 장착된 5ml 주사기에 부착하고 마이크로 피펫의 말단 끝을 작업 용액 한 방울에 약간 담그십시오. 마이크로 피펫의 끝이 부러지지 않도록 주의하십시오. 주사기의 플런저를 당겨 마이크로 피펫의 말단 끝을 통해 작업 용액을 사이펀합니다.

다음으로, 마이크로 피펫 주입량을 보정합니다. 마이크로미터 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울을 놓고 압력 펄스 마이크로 인젝터 장치에 대한 전원 및 공기 공급을 켭니다. 다음으로, 마이크로 피펫을 마이크로 주입기 장치의 마이크로 피펫 홀더에 부착합니다.

마이크로 인젝터는 압력이 조절되며 해부 현미경 아래의 풋 페달을 눌러 방전이 활성화됩니다. 마이크로 인젝터를 사용하여 작업 용액을 마이크로미터 오일에 한 방울 떨어뜨려 주입량을 테스트합니다. 기름 위에 구형으로 떠 있는 방울의 직경을 측정합니다.

주입 시간과 압력을 조정하여 주입량을 신중하게 보정하십시오. 이 단계는 마이크로 주입 실험의 재현성을 돕습니다. 이 시연에서 모든 마이크로 주입은 0.15mm의 입자 직경으로 수행됩니다.

마지막으로, 주입량이 보정되면 마이크로 주입기의 홀드 손잡이를 사용하여 마이크로 피펫의 역충전 및 누출을 방지합니다. 이제 제브라피시 배아를 준비할 차례입니다. 제브라피쉬는 매일 아침 처음 몇 시간 동안 무작위로 짝짓기를 하여 준비를 시작하고 단일 세포 단계에서 배아를 수집하여 하나의 XE 3 배지에 배치합니다.

3ml 이송 피펫을 사용하여 미세주입 챔버 플레이트의 쐐기 모양의 홈통을 따라 배아를 배열합니다. 배지를 제거하여 배아가 얕고 물에 잠기고 침수되지 않도록 합니다. 이 단계는 배아를 골의 바닥에 정착시키는 데 도움이 될 뿐만 아니라 마이크로 피펫에 의한 코리온의 침투를 돕습니다.

이제 주사를 시작하겠습니다. 먼저, 마이크로 피펫으로 배아를 조작하여 한 세포 단계 배아의 세포질이 해부 현미경으로 보이도록 합니다. 마이크로 피펫의 끝이 부러지지 않도록 주의하고, 코리온을 관통한 다음 마이크로 피펫으로 노른자를 침투시켜 배아에 주입하십시오.

이 시연에서는 세포 바로 아래의 난황에 처음으로 마이크로 주입하고 세포질 및 확산이 작동 용액을 세포로 가져올 수 있도록 합니다. 이 흐름은 작업 용액에 추가된 페놀 레드로 인해 볼 수 있습니다. 이것은 단일 세포 배아이기 때문에 자유롭게 또는 매니퓰레이터로 주입할 수 있습니다.

또한 세포 세포질에 직접 주입하는 방법도 시연할 것입니다. 세포에 직접 microinjection하는 것이 더 강력하지만 적절한 배아 방향과 microinjection 기술로 시간이 많이 걸립니다. 세포막이 난황막보다 더 엄격하기 때문에 세포에 도달하기 위해 난황자를 통해 마이크로 피펫으로 들어가는 것이 더 빠른 경우가 많습니다.

세포질은 동물의 극을 여물통의 바닥을 향하게 하고 안정된 손으로 작업하는 것이 이 주입 방법에 도움이 될 수 있습니다. 미세주입 후, 배아를 E 3 배지가 있는 페트리 접시에 넣고 정상적인 발달을 위해 섭씨 28.5도에서 배양합니다. 배아 발달의 다음 몇 시간 및 며칠 동안 관심 있는 표현형에 대해 배아를 관찰하십시오.

미세주입의 성공을 확인하기 위해, 우리는 in vivo 전체 배아 형광 현미경 검사에 의해 차폐 단계에서 시작하는 발달 중인 배아에서 GFP의 발현을 모니터링할 것입니다. 주입된 캡핑된 RNA는 점차적으로 분해되고 발현된 단백질의 안정성에 따라 달라집니다. 이전에 발표된 결과에 근거하여, PKD 2 모르핀은 PKD 2 돌연변이 제브라피시에서 발견되는 등쪽 몸체 축 곡률을 모방하고 수정 후 약 2-3일 후에 신장 낭종을 나타낼 것으로 예상합니다.

방금 제브라피시에서 mRNA 과발현 및 모르포 올리고뉴클레오티드 유전자 녹다운 연구를 수행하기 위한 강력한 미세주입 기술을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 이것이 중요하다는 것을 기억하십시오. 안정된 손으로 주입하십시오. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.