Name: Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 배우세요 제브라피시 태아에 mRNA와 morpholino를 마이크로인젝션하는 기법으로 유전자 발현 조절 및 발달생물학 연구를 수행하는 방법. 이 기술은 신경과학과 유전학 분야에서 유전자 기능을 연구하는 데 필수적입니다.

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이 작품은 ZS에 NIH와 PKD 기초에 의해 지원되었다. 모든 동물 실험은 예일 동물 자원 센터 (YARC) 및 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라 실시되었다.

1 부 : micropipettes의 작성, 그리고 microinjection 챔버 플레이트 <ol><li> 난방 및 micropipette의 끌어당기는 장치 borosilicate 유리 모세관 튜브 (세계 정밀 계측기, 주식 회사, 1B100 - 4) 당기 (셔터 인 스트 루먼트 주식 회사, 플라밍 / 브라운 P - 97)에 의해 micropipettes를 조작. 점토 또는 접착 테이프의 소량 위에는 배양 접시에 보관하십시오. </li><li> (같은 &#39;Zebrafish 도서 &quot;에서 설명)를 주사하는 동안 태아를 들고위한 쉬운 방법으로 될 것입니다 쐐기 모양의 골짜기로 성형 1X E3 중간 플레이트에서 1.5 % 아가로 오스를 (미국 Bioanlytical, 주식 회사, AB00972 - 00500) 부어 1. 한천 챔버 플레이트 4 º C.에서 사용하고 저장하기 전에 응고하자 </li></ol> 2 부 : RNA의 준비 유전자 기능 연구에 대한 하나의 강력한 접근 방식은 zebrafish 배아의 체외 베꼈는데 덮인 RNA에 microinject하는 것입니다. 뒤덮힌 RNA는 CAP 아날로그의 존재에 의한 생체내에있는 진핵세포 mRNAs와 비슷하게 동작합니다. Zebrafish 연구자들은 일상적으로 관심이 자신의 유전자를 overexpress 또는 misexpress이 방법을 활용합니다. 이 예제에서 우리는 EGFP - 태그 사본을 microinject하고 성공적인 주사에 대한 눈에 띄는 판독으로 살고 전체 - 배아 GFP 표현을 사용합니다. <ol><li> 관심의 사본에 체외 CAP RNA의 전사 반응을 수행합니다. 우리가 실험실에서, 우리는 정기적으로 pCS2 + 벡터에 관심이 cDNA를 삽입하고 mMessage mMachine SP6 키트 (앰비온, 주식 회사, AM1340)를 사용 덮인 RNA의 대량의 체외 합성 반응을 수행합니다. </li><li> RNeasy 미니 키트 (Qiagen, 주식, 74104)를 통해 그것을 실행하거나 페놀에 의해 RNA 샘플을 정화 : 클로로포름 추출 및 이소프로판올 석출합니다. </li><li> 신중하게 사용하기 위해 준비까지 -80 º C에서 RNA의 준비와 저장소의 농도를 결정합니다. </li><li> 주사 당일, 가볍게 RNA 샘플, 소용돌이를 해동하고 간단히 스핀 다운. </li><li> 0.050 % 페놀 레드 (시그마 - 알드리치 (주), P0290) - 살균 물, 0.025의 최종 농도와 함께 작동하는 솔루션을 준비합니다. 페놀 레드는 배아로 솔루션의 주입에 대한 눈에 띄는 표지 역할을합니다. 이 문서에서는, 우리는 0.050 % 페놀 레드 100 NG / UL EGFP의 mRNA의 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> -80 ° C.에 얼음과 반환 RNA 재고 작업 샘플을 보관 </li><li> 경우이 샘플을 주입 준비 4 부로 진행합니다. </li></ol> 파트 3 : morpholino의 작성 Morpholino 안티 센스 oligonucleotides 널리 타겟 단백질의 번역을 차단하거나 사전 mRNA의 splicing 2,3를 수정하여 유전자 발현을 수정하는 데 사용됩니다. zebrafish에 Morpholinos는 유전자 기능을 쓰러뜨린하여 강력한 반대 유전학의 도구로 제공하고 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 pkd2의 translational 개시 사이트 (5&#39; - AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC - 3 &#39;)를 타겟으로하는 morpholino oligo를 microinject 것입니다. 이전에 설립 작업을 바탕으로, 우리는 주입된 배아가 phenotypically pkd2 돌연변이 물고기 4 모방 것으로 기대합니다. <ol><li> 우리는 일상적으로 특별히 진 도구에서 관심의 유전자, LLC (필로 매스, OR)을위한 morpholino oligo 300 nmol 주문. </li><li> 3 MM 주식 솔루션을 100 UL 멸균 물을 추가합니다. 사용을위한 준비까지 -20 ° C에서 나누어지는 솔루션 및 저장합니다. </li><li> 주사 당일, 65에서 morpholino 솔루션을 열 5 분 ° C. 즉시 얼음에 냉각 스냅 그리고 짧게 스핀. 이 단계는 oligo에 보조 구조 denatures 및 솔루션 완전히 solubilized 것을 보장합니다. </li><li> 0.050 % 페놀 레드 - 살균 물, 0.025의 최종 농도에 morpholino 솔루션을 diluting에 의해 작동하는 솔루션을 준비합니다. 이 예제에서, 우리는 0.050 % 페놀 레드와 0.50 MM pkd2 morpholino의 작업 솔루션을 준비할 것이다. </li><li> 실온에서 솔루션을 계속해. </li><li> 경우이 샘플을 주입 준비 4 부로 진행합니다 .---- </li></ol> 4 부 : 귀하의 작업 솔루션 micropipette를 필링 <ol><li> 포셉와 micropipette의 말초 팁 또는 50X 배율에서 해부 현미경 (니콘 인스 트루먼 트 주식 회사, SM2645)의 단지 보이는 개방을 만드는 수술 razorblade 컷. </li><li> coverslip에 드롭으로 작업 솔루션의 플레이스 2 UL. </li><li> 피하 주사 바늘과 약간 잠수함 작업 솔루션의 드롭에 micropipette의 말초 팁을에 튜브가 장착되어 5 ML의 주사기에 micropipette의 뒷면을 연결합니다. micropipette의 팁을 휴식 않도록주의를 가져가라. </li><li> 주사기의 플런저를 당기는하여 micropipette의 말초 끝에 통해 작업 솔루션을 사이픈. </li></ol> 5 부 : micropipette 사출 볼륨을 눈금 보정 <ol><li> 마이크로 미터 슬라이드에 광유의 드롭 (미국 Bioanalytical, 주식 회사, AB00921 - 00025) (FI를 배치쉐어, 12-561 - SM1). </li><li> 압력 펄스 마이크로 연료 분사 장치 (세계 정밀 계측기 주식 회사, PV830)에 전원 및 공기 공급을 켜십시오. </li><li> 마이크로 연료 분사 장치의 micropipette 홀더에 micropipette을 첨부합니다. 마이크로 연료 분사 압력과 배출 규제가 발 페달을 눌러 활성화됩니다있다. </li><li> 해부 현미경 아래에서 마이크로 미터 기름에 귀하의 작업 솔루션의 한 방울을 배치하기 위해 마이크로 인젝터를 사용하여 사출 볼륨을 테스트합니다. 그것은 기름 위에 구형의 수레로 드롭의 직경을 측정합니다. </li><li> 기간 및 신중하게 분사의 볼륨을 조정하기 위해 사출 압력을 조정합니다. 이 단계는 microinjection 실험의 재현성에 에이즈. 이 예제에서는 모든 microinjections은 0.15 mm (볼륨에서 약 1.76 NL)의 드롭 직경 할 것입니다. </li><li> 주사 볼륨이 보정되면 backfilling 및 micropipette의 누출을 방지하기 위해 마이크로 인젝터에있는 &quot;대기&quot;노브를 사용합니다. </li></ol> 6 부 : microinjection에 대비하여 수정된 zebrafish의 배아 <ol><li> Zebrafish는 무작위로 매일 아침의 처음 몇 시간 짝짓기합니다. 1 세포 단계에서 배아를 수집하고 1X E3 미디어에서 그들을 놓으십시오. </li><li> 3 ML 전송 pipet (백톤 디킨슨 Labware, 357,524)를 사용하여 microinjection 챔버 플레이트에 쐐기 모양의 골짜기를 따라 배아를 준비. </li><li> 배아가 shallowly 잠수과 침수되지 않도록 매체를 제거합니다. 이 단계는 아니라 micropipette하여 chorion의 침투에로 골짜기의 바닥에 배아를 정착 에이즈. </li></ol> 7 부 : chorion 통해 Microinjection <ol><li> 1 세포 단계의 배아의 세포질은 해부 현미경으로 볼 수 있도록 micropipette으로 배아를 조작. micropipette의 팁을 휴식 않도록주의를 가져가라. </li><li> 배아에 주입하기 위해 micropipette와 chorion 노른자를 침투. 이 예제에서, 우리는 먼저 직접 셀에 아래의 노른자에 microinjecting 수 있으며, 세포로 작업 솔루션을 제공할 수 세포질 유동 및 확산을 수 있습니다. 이 흐름은 작업 솔루션에 추가 페놀 레드로 인해 볼 수 있습니다. </li><li> 우리는 또한 세포 세포질에 직접 주입을 설​​명합니다. 셀에 직접 microinjection 더 강력한하지만 적절한 배아 오리 엔테이션과 microinjection 기술이 필요합니다 같은 시간 소모됩니다. 세포막은 노른자 막보다 엄격한이기 때문에, 그것은 세포 세포질에 도달 노른자를 통해 micropipette를 입력하는 것이 빠르다. 여물 하단으로 동물 극을 Orienting하고 지속적인 손으로 작업하는 것은 주입이 방법에 도움이됩니다. </li><li> microinjection 후, E3 매체와 페트리 접시에 배아를 장소와 28.5에서 그들을 품어 ° C를 일반 개발. </li><li> 배아 개발의 다음 몇 시간 일 동안 관심의 phenotypes에 대한 배아를 관찰합니다. </li></ol> 8 부 : 대표 결과 EGFP의 mRNA의 overexpression : microinjection의 성공을 확인하려면, 우리는 (Leica 마이크로 GmbH를, MZFLIII) 생체내 전체 - 배아 형광 현미경에 의해 보호막 단계 (~ 6 HPF)에서 시작 개발 배아에서 GFP의 표현을 모니터링합니다. 구조 표현 배아 발달의 초기 이벤트 기간 동안 가장 강력한이며 주입 뒤덮힌 RNA가 점진적으로 저하되고 표현 단백질의 안정성에 따라 자주 개발하는 동안 감소됩니다. pkd2 translational 차단 morpholino : 이전에 게시된 결과를 바탕으로, 우리가 pkd2 morphants과 같이 약 2 pkd2 돌연변이 zebrafish와 현재 신장 cysts에있는 등 지느러미 본문 축 곡률 모방 기대 - 3 DPF 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="그림 1" /> 그림 1 : EGFP의 mRNA와 pkd2 AUG morpholino의 microinjection에서 대표 발생합니다. (A) 탭 배아는 EGFP mRNA의 0.17 NG와 1 세포 단계에서 microinjected 및 생체내 GFP 발현에 1 DPF에 시각되었습니다. (B, C) ​​탭 배아는 0.50 밀리미터에서 pkd2 translational 차단 morpholino의 ~ 1.7 NL과 1 세포 단계에서 microinjected 4 DPF에서 지느러미 신체 곡률에 대한 채점했다.

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.++A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th, University of Oregon. (2000).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos%3A+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li>
<li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li>
<li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li>
<li>Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li>
<li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li>
<li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li>
<li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li>
<li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li>
</ol>

zebrafish 배아에 Microinjection 개발에서 특정 유전자의 역할을 탐험 잘 설립하고 강력한 기술입니다. 응용 프로그램 overexpression, misexpression와 관심뿐만 아니라 여러 유전자 간의 epistatic 분석의 유전자의 최저의 assays를 포함합니다. zebrafish의 Microinjection은 널리 유전자 변형 동물을 생성하고, 초기 배아 blastula 5,6,7,8,9의 세포 운명을 매핑에 사용되고 있습니다. 또한,이 기법의 응용 프로그램은 세포 이식 방법 10 세균 온라인 chimeras을 생성의 주요 단계로 제공하고 있습니다. 유전자의 &#39;이득의 기능을&#39;표현형을 탐험에 대한 하나의 대안 방법은 유전자의 constitutively 적극적인 양식을 microinject하는 것입니다. 또한, 유전자의 의사 &#39;손실 함수&#39;표현형은 그 유전자의 지배 부정적인 형태의 mi...

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zebrafish 태아의 mrna와 morpholino의 안티 센스 oligonucleotides의 microinjection.

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

개발하는 동안 유전자의 역할을 조사하는 필수적인 도구가 유전자 최저, overexpression, 그리고 misexpression 연구를 수행하는 능력입니다. zebrafish에서 (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), 개발 배아에 RNA, DNA, 단백질, 안티 센스 oligonucleotides와 다른 작은 분자의 microinjection은 연구자에게 유전자 기능을 탐험에 대한 신속하고 강력한 분석을 제공합니다<em&gt; 생체내에</em&gt;. 이 동영상 기사에서는, 우리는 준비하고 microinject하는 방법을 보여줍니다 것입니다<em&gt; 체외에서</em&gt; 합성 EGFP의 mRNA와 translational 차단 morpholino oligo에 대한<em&gt; pkd2</em&gt; 1 - 세포 단계의 배아 zebrafish에 autosomal 지배 polycystic 신장병 (ADPKD)과 관련된 유전자. 우리는 다음 GFP 표현 및 표현형 분석을 확인하여 mRNA 및 morpholino의 microinjections의 성공을 분석합니다. 이 기술의 광범위한 응용 프로그램을 생성하는 유전자 변형 동물 및 세균 라인 chimeras, 세포 - 운명의 매핑 및 유전자 검사를 포함합니다. 여기에 우리의 EGFP와 최저의 overexpression을위한 프로토콜을 설명<em&gt; pkd2</em&gt; mRNA와 morpholino의 oligonucleotide 주입에 의해.

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

발달 과정 중 유전자의 역할을 조사하기 위한 필수적인 도구는 유전자 넉다운(knockdown), 과발현 및 오발현(misexpression)을 수행할 수 있는 능력입니다...

이 절차는 먼저 morpho와 시험관 내 전사(in vitro transcribed)된 cap mRNA를 준비하는 것으로 시작합니다. 마이크로 피펫에 morpho 함유 용액을 사이펀 방식으로 채운 후, 마이크로미터-정밀 1-셀 스테이지를 사용하여 주입량을 보정합니다. 그런 다음 제브라피시 배아를 수집하여 난황 미세 주입을 위해 미세 주입 챔버에 배치합니다.작동 용액을 세포 바로 아래의 난황에 주입하고, 세포 미세 주입을 위해 세포질의 움직임을 이용하여 용액을 이동시킵니다. 주입 후 용액을 세포 세포질로 주입하십시오. 배아를 E3 배지에서 28.5 °C로 배양하고, 이후 단계에서 관심 있는 표현형이 나타나는지 확인하십시오.안녕하세요, 저는 Yale University School of Medicine 유전학과의 Sasha 박사님 연구실 소속이자 아들인 Shiloh Yuen입니다. 오늘은 제브라피시에서 mRNA 과발현 및 morpho 올리고뉴클레오타이드 유전자 넉다운 연구를 수행하기 위한 강력한 미세주입 기술을 시연하겠습니다. 저희 연구실에서는 낭성 신장 질환에서 섬모의 역할을 연구하기 위해 이 절차를 활용하고 있습니다.이제 시작하겠습니다. 유전자 기능 연구를 위한 하나의 강력한 접근법은 시험관 내에서 전사된 캡핑된 RNA를 제브라피쉬 배아에 미세 주입하는 것입니다. 본 시연에서는 EGFP 태그가 붙은 전사체를 미세 주입하고, 성공적인 주입의 가시적 판독값으로 살아있는 전체 배아의 GFP 발현을 이용하겠습니다.먼저, 관심 있는 전사체에 대해 인 비트로(in vitro) 캡 RNA 전사 반응을 수행합니다. 본 실험실에서는 일반적으로 관심 있는 cDNA를 pCS2+ 벡터에 삽입하고, Mmessage mMachine SP6 키트를 사용하여 다량의 캡핑된 RNA 인 비트로 합성 반응을 수행합니다. 그다음, RNeasy Mini 키트를 사용하거나 페놀-클로로포름 추출 및 이소프로판올 침전법을 통해 RNA 샘플을 정제합니다.RNA 준비물의 농도를 주의 깊게 측정하고, 주입 당일 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오. RNA 샘플을 해동한 후 가볍게 볼텍싱하고 잠시 원심 분리하십시오. 이제 멸균수와 최종 농도 0.025~0.05% phenol red를 사용하여 작업 용액을 준비하십시오. phenol red는 배아 내로 용액이 주입되었음을 확인하는 가시적 마커 역할을 합니다.여기서는 0.05% phenol red가 포함된 100 ng/µL 농도의 EGFP mRNA 작동 용액을 준비하겠습니다. 마지막으로, 작동 샘플은 얼음 위에 보관하고 RNA 스톡은 -80 °C로 되돌려 놓으십시오. 이 샘플을 주입할 준비가 되면 morpho 준비 단계로 진행하십시오.Morpholino 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 단백질의 번역을 차단하거나 pre-mRNA 스플라이싱을 수정하여 유전자 발현을 조절하는 데 널리 사용됩니다. 제브라피쉬의 morphino는 유전자 기능을 넉다운(knock down)함으로써 강력한 역유전학 도구로 활용됩니다. 본 실험에서는 pkd2의 번역 개시 부위를 표적으로 하는 morph oligo를 미세 주입하겠습니다. 당사는 일반적으로 Gene Tools LLC에서 구입한, 관심 유전자에 맞게 특수 설계된 300 µM 농도의 morph oligo를 사용합니다.그 다음 멸균수 100 µL를 첨가하여 3 mM 스톡 용액을 제조한 후, 용액을 소분하여 주사 당일 사용 전까지 -20 °C에서 보관합니다. 모리노(morino) 용액을 65 °C에서 5분 동안 가열합니다. 그 후 즉시 얼음 위에서 급냉(snap cool)하고 짧게 원심 분리합니다. 이 단계는 올리고의 2차 구조를 변성시켜 용액이 완전히 가용화되도록 합니다.다음으로, Morpho 용액을 멸균수에 희석하고 최종 농도를 0.025~0.05% phenol red로 맞추어 작업 용액을 준비합니다. 본 시연에서는 0.05% phenol red가 포함된 0.5 millimolar PKD2-Morpho 작업 용액을 준비하겠습니다. 작업 용액은 실온에서 보관하고, 샘플을 주입할 준비가 되면 마이크로 피펫 충전 단계를 진행하십시오.우선, 주입에 사용할 마이크로 피펫을 제작해야 합니다. 이는 마이크로 피펫 폴러 장치에서 BOS 실리케이트 유리 모세관을 가열하고 당겨서 수행합니다. 바늘이 제작되면, 소량의 점토나 접착 테이프 위에 올려둔 페트리 접시에 보관합니다.다음으로, 쐐기 모양의 홈이 성형된 3개의 XE medium 플레이트에 1.5% agarose를 부어 미세주입 챔버 플레이트를 준비합니다. 이는 주입 과정 동안 배아를 쉽게 고정하는 방법으로 활용됩니다. 그 후 agarose 챔버 플레이트를 응고시킨 다음, 사용 전까지 4°C에서 보관합니다.마이크로 피펫 충전을 시작합니다. 해부 현미경 50배 배율에서 겨우 보일 정도의 개구부가 생기도록 핀셋이나 수술용 면도날로 원위부 팁을 절단하십시오. 다음으로 작업 용액 2 µL를 취합니다.커버 슬립 위에 한 방울을 떨어뜨린 후, 마이크로 파이펫의 뒷부분을 하이포더믹 바늘에 튜브가 연결된 5 mL 주사기에 부착하고, 마이크로 파이펫의 원위단 팁을 작업 용액 방울에 살짝 담급니다. 이때 마이크로 파이펫의 팁이 부러지지 않도록 주의하십시오. 주사기의 플런저를 당겨 마이크로 파이펫의 원위단을 통해 작업 용액을 사이펀 방식으로 흡입합니다.다음으로, 마이크로 파이펫의 주입량을 보정하겠습니다. 마이크로미터 슬라이드 위에 미네랄 오일 한 방울을 떨어뜨리고, 압력 펄스 마이크로 인젝터 장치의 전원과 공기 공급 장치를 켭니다. 그 다음, 마이크로 인젝터 장치의 마이크로 파이펫 홀더에 마이크로 파이펫을 장착합니다.마이크로 인젝터는 압력 조절 방식이며, 해부 현미경 아래의 풋 페달을 눌러 배출을 활성화합니다. 마이크로 인젝터를 사용하여 작동 용액 한 방울을 마이크로미터 오일 위에 떨어뜨려 주입량을 테스트하십시오. 오일 위에 구 형태로 떠 있는 방울의 직경을 측정합니다.주입량(volume of injection)을 정밀하게 보정하기 위해 주입 시간과 압력을 조정하십시오. 이 단계는 미세 주입 실험의 재현성을 높이는 데 도움이 됩니다. 본 시연에서는 모든 미세 주입을 0.15 millimeters의 액적 직경으로 수행합니다.마지막으로, 주입량이 보정되면 마이크로 인젝터의 hold 노브를 사용하여 마이크로 피펫의 역류와 누출을 방지하십시오. 이제 제브라피쉬 배아를 준비할 차례입니다. 제브라피쉬는 무작위로 교배하므로, 매일 아침 처음 몇 시간 동안 준비를 시작하여 1세포기 배아를 수집하고 이를 one XE three 배지에 넣으십시오.3 mL 전이 피펫을 사용하여 미세주입 챔버 플레이트의 쐐기 모양 홈을 따라 배아를 배치합니다. 배아가 얕게 잠기고 완전히 잠기지 않도록 배지를 제거합니다. 이 단계는 배아가 홈 바닥에 안착하도록 돕고, 미세 피펫이 난막을 더 잘 관통할 수 있게 합니다.이제 주입을 시작하겠습니다. 먼저, 해부 현미경 하에서 1세포기 배아의 세포질이 보이도록 마이크로 피펫으로 배아를 조작합니다. 마이크로 피펫의 팁이 부러지지 않도록 주의하며, 마이크로 피펫으로 난막과 난황을 차례로 관통하여 배아 내부로 주입합니다.본 시연에서는 먼저 세포 바로 아래의 난황에 미세 주입을 수행하여, 세포질 흐름과 확산을 통해 작업 용액이 세포 내로 유입되도록 하겠습니다. 작업 용액에 첨가된 페놀 레드(phenol red) 덕분에 이러한 흐름을 시각적으로 확인할 수 있습니다. 이는 단세포 배아이므로, 핸드 프리(freehand) 방식이나 마니퓰레이터를 사용하여 주입할 수 있습니다.세포질로의 직접 주입 방법 또한 시연하겠습니다. 세포 내로 직접 미세주입하는 방식은 더 확실하지만, 적절한 배아 방향 설정과 미세주입 기술이 필요하므로 시간이 더 많이 소요됩니다. 세포막은 난황막보다 더 견고하기 때문에, 미세 피펫을 난황을 통해 삽입하여 세포에 도달하는 것이 더 빠른 경우가 많습니다.동물극이 홈의 바닥을 향하도록 세포질을 배치하고 안정된 손길로 작업하면 이 주입 방법을 수행하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미세주입 후, 배아를 E three 배지가 들어 있는 페트리 접시에 옮기고 정상적인 발달을 위해 28.5 °C에서 배양하십시오. 이후 수 시간 및 수일 동안 배아가 발달하는 과정을 관찰하며 관심 있는 표현형이 나타나는지 확인하십시오.미세주입의 성공 여부를 확인하기 위해, shield stage부터 in vivo 전체 배아 형광 현미경을 통해 발달 중인 배아 내 GFP 발현을 모니터링합니다. 구성체의 발현은 배아 발달 초기 단계에서 가장 강하게 나타나며, 주입된 capped RNA가 점차 분해됨에 따라 그리고 발현된 단백질의 안정성에 따라 발달 과정 중에 감소하는 경우가 많습니다. 이전에 발표된 결과에 근거하여, PKD2 morphant는 PKD2 돌연변이 제브라피쉬에서 발견되는 배면 체축의 만곡을 모방하고 수정 후 약 2~3일 사이에 신장 낭종을 나타낼 것으로 예상됩니다.지금까지 제브라피시에서 mRNA 과발현 및 morpho oligonucleotide 유전자 넉다운 연구를 수행하기 위한 견고한 미세주입 기술을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때 가장 중요한 점은 흔들림 없는 손으로 안정적으로 주입하는 것임을 기억하시기 바랍니다. 이상입니다.시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Biology

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여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

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배우세요 제브라피시 태아에 mRNA와 morpholino를 마이크로인젝션하는 기법으로 유전자 발현 조절 및 발달생물학 연구를 수행하는 방법. 이 기술은 신경과학과 유전학 분야에서 유전자 기능을 연구하는 데 필수적입니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

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