Name: 유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 배우세요 Danio rerio 배아에 mRNA 또는 morpholino를 미세주입하여 유전자 발현을 조절하는 방법을. 이 기술은 발달생물학에서 유전자 기능을 연구하는 데 필수적입니다.

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우리가 그들의 기술 지원에 대한 마블리 실험실과 Narie 스톨러의 회원을 인정하고, 미국 심장 협회 (NCRP 과학자 개발 그랜트 0635363N)과 국립 심장, 폐, 그리고 자금에 대한 혈액 연구소 (부여 SCCOR RFA HL02 - 027).

1 부 : 달걀 생산과 수집 <ol><li> 사전 주사하는 밤, 장소에 디바이더와 탱크를 번식에 물고기를 설정합니다. 원하는 경우 총 계란의 생산을 증가하기 위해 생선 한 남성 두 여성의 비율에서 설정할 수 있습니다. </li><li> 다음날 아침은 객실 조명 후 켜십 여러 탱크에서 디바이더를 뽑아 그대로 짝짓기 시간 약 20 분 동안 수 있습니다. </li><li> 스트레이너를 사용하여 번식 케이지에서 달걀을 수집하고 달걀 물로 그들을 씻어. 계란 물을 페트리 접시에 계란을 붓고 및 전송 피펫과 unfertilized 계란과 부스러기를 제거합니다. 생선은 사출 달걀의 추가 라운드를 생성하기 위해 큰 탱크에 regrouped 수 있습니다. 그들이 단세포 단계를 통과시키는 않고 생산되는 달걀의 최대 숫자 수 있도록 계란 컬렉션의 타이밍을 조정합니다. </li><li> 100mm 페트리 접시의 뚜껑에 거꾸로 현미경 슬라이드를 놓습니다. 하나의 컬럼을 형성 슬라이드의 측면에 대한 계란 라인에 전송 피펫을 사용합니다. 계란 반대 측면에 대한 Kimwipe을 눌러 슬라이드에서 여분의 계란 물을 제거합니다. (그림 1A) </li></ol> 2 부 : 니들이 로딩, 당기 및 준비 <ol><li> micropipette의 풀러와 어리석은 퍼티의 경사로를 통해 누워하여 150mm 페트리 접시에 두 바늘과 가게에 모세관 1.0mm OD 유리를 가져옵니다. 바늘은 사전에 뽑아하실 수 있습니다. </li><li> microloader의 피펫을 사용하여 사출 재료 3 μL와 Backload 바늘. 나머지 거의 또는 전혀 거품이 때까지 바늘 끝 방향으로 볼러스 흔들어. </li><li> 공기 소스와 microinjector를 켜십시오. microinjector에 바늘을 삽입하고 하우징 내에 꽉 인감을 확보. micromanipulator은 움직임과 조정의 광범위한 수 있도록 적절한 위치에 있는지 확인합니다. 무대에서 높은 현미경의 시야 비행기, 그리고 팁의 얇은 영역에 초점에 바늘 끝을 가져와. 바늘은 피어스 chorion와 노른자 정도로 좁은하지만 일관된 비드 크기를 전달할 수 아직도 단풍 지점에서 바늘을 공략하기 날카로운 집게 한 쌍의을 사용합니다. 마이크로 미터에서 미네랄 오일 방울은 각 주입의 볼륨을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 오일에 주입하면, 0.1 mm의 직경을 가진 구슬은 사출 재료 500 PL (그림 1B)를 포함, 500 PL 또는 1nL의 사출 볼륨은 일반적으로 사용됩니다. 발 페달을 우울하게하고 바늘을 트리밍하고 필요에 따라 분사 압력을 조정하는 동안 비드의 크기를 모니터링합니다. 이상적인 분사 볼륨 계란 볼륨의 약 10 %를 채울 것입니다. 바늘 끝의 품질은 주입의 용이성과 결과의 품질과 일관성 모두에게 중요합니다. </li></ol> 파트 3 : 사출 <ol><li> 배아는 네 개의 세포 단계 과거 개발하지 않았습니다. 확인 이상적으로, 태아는 한 세포 단계에서해야합니다. </li><li> 당신의 반대 손으로 장소에서 접시를 들고, 계란의 열 방향으로 바늘을 낮춥니다. </li><li> 피어스 chorion의 표면 및 파쇄 또는 난황의 끊어지고위한 보면서 한 부드러운 스트로크의 노른자를 입력합니다. 난황 (그림 1C)에 주입 물질을 주사. 기포를 주입하거나 중 배아에 치명 수 있으므로 노른자를 스트레칭하지 마십시오. 선을 작업, 피펫 팁을 사용하여 일관성있는 구슬의 크기와를 유지하기 위해 필요한 압력을 조정 unfertilized 모양 또는 사출 과정에서 파괴 계란을 제거합니다. </li><li> 계란의 칼럼을 마친 후, 깨끗한 페트리 접시에 주입 계란을 이동 계란 물을 부드러운 스트림을 사용합니다. 필요에 따라 반복합니다. 컨트롤과 같은 여러 uninjected 배아 보관하십시오. 하루에 한의 끝에, 죽은 태아를 제거하고 주입 배아의 수를 기록합니다. 정기적으로 감염의 기회를 줄이기 위해 접시에 계란 물을 교체합니다. </li></ol> 4 부 : 대표 결과 주입되는 내용에 따라 배아들은 uninjected 형제보다 낮은 속도로 살아남을 수 있습니다. 다행히도, 그것이 그들의 큰 숫자를 주입하기 쉬우며, 이것이 거의 문제가 없다 그래서. morphants이 약간 지연 발전을 전시하는 것은 정상입니다. microinjection의 결과를 설명하기 위해, 우리는 유리의 단백질 하트 (Heg)의 수준을 조작하기 위해이 프로토콜을 사용합니다. Heg 정상 심장 개발에 필요한 transmembrane 단백질이다. 의 부재에서 배아는 거대한 유입 책자와 챔버 1 마음을 개발할 수 있습니다. 우리는 500 μm의의 농도에 heg, heg_e3i3_egfr1 및 heg_e4i4_egfr2, 둘은 반대 이전에 undescribed morpholinos를 주입했다. 2 일 게시물 수정에서 uninjected 형제 컨트롤은 (그림 2A와 B) 예상, 정상 나타납니다. heg_e3i3_egfr1 주사 태아가 뇌의 부종 (그림 2C)를했습니다. 이러한 morphants 대부분의 마음은 형태 변경했지만, 그들의 챔버 (그림 2D) 일반적으로 크기입니다. 공룡의 태아가 주입heg_e4i4_egfr2 전시 변수 심장 결함과 함께. 다른 대규모 유입 책자와 적당히 확대 심방 (그림 2E 및 F)를하는 동안 일부는 정상 나타납니다. 로 이전 1보고 heg 돌연변이, 방영 권 확대 유입 트랙트와 아트리움 (그림 2G 및 H)이 있습니다. 우리는 또한 cDNA 전체 길이 heg에서 베꼈는데 400 NG / μL mRNA와 wildtype 배아를 주입했다. uninjected 컨트롤이 정상적으로 개발하는 동안 (그림 3A와 B), 배아는 본체의 축, 머리와 신체의 괴사 및 정중선의 결함 (그림 3C의 단축, mRNA는 wildtype 모양에서 심각한 cyclopia에 이르기까지 phenotypes의 스펙트럼을 전시 heg로 주입 와 D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> 주입하는 그림 1. 태아는 배양 접시에있는 현미경 슬라이드 (A) 상대 줄지어 있습니다. 사출 볼륨은 마이크로 미터에 위치 미네랄 오일에 주입에 의해 결정됩니다. 일반적으로 사용되는 500 PL,의 주사 량은 0.1 mm (B)의 직경이 있습니다. 즉시 주사 후 morpholino 또는 mRNA의 노른자 (C)에서 구두점 명소로 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> 그림 2. 2 일 게시물 수정에서 uninjected 배아는 아무런 총 결함 (A) 또는 심장 표현형 (B)가 없습니다. morpholino heg_e3i3_egfr1 주사 태아가 뇌의 부종 (C, 화살표)하지만 일반적으로 크기의 심장 회의소 (D)를했습니다. morpholino heg_e4i4_egfr2 주사 어떤 배아는 확대 유입 책자 및 심방 (E, F)가. heg 돌연변이 심각하게 확대 유입 책자와 심방을 (G, H) 있습니다. (A), (C), (E) 및 (G) 4X DIC 이미지되며 (B), (D), (F)과 (H) 20x DIC 영상입니다. = 아트리움, 그건 = 유입 트랙트. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> 그림 3. 24 시간 게시물 수정에서 배아 그들 (B) 사이에 신경 튜브와 노 괴사 또는 정중선 결함 (A) 두 명확하게 정의된 눈을 가진 긴 직선 신체를 uninjected. heg mRNA 주사 어떤 배아는 반대로, 짧은 몸 축, 괴사, misshaped somites (C), 그리고 cyclopia (D)를 나타냅니다. (A)와 (C) 4X DIC 이미지되며 (B)와 (D) 20x DIC 이미지입니다.

<ol><li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li>
</ol>

zebrafish 모델 시스템의 장점 중 하나는 특정 유전자 제품에 추가하거나 microinjection하여 배아에서 제거될 수있는 용이입니다. ubiquitously 특정 단백질을 overexpress하려면, mRNA 인코딩 그것은 1 세포 단계에서 노른자로 주입됩니다. 배아의 후속 개발 과정에서 RNA는 유기체에 걸쳐 분산 및 번역입니다. 반대로, 특정 단백질을 제거하기 위해, morpholinos이 사용됩니다. Morpholinos 특정 RNAS에 안티 센스 complementarity 설계 합성 oligonucleotides 있습니다. mRNAs 마찬가지로, morpholinos는 1 세포 단계에서 노른자에 주입하고 있습니다. 배아 내부 그들은 번역을 방지하는 그들의 목표 RNAS를 바인딩합니다. 각 morpholino 또는 mRNA를 위해 만들어진 있어야 주요 수정 주입 물질의 농도이다. morpholino 또는 mRNA 중 하나 너무 높은 농도가 아닌 특정 독성을 일으킬 수 있으며, 각 morpholino가 아닌 특정 결함을 유발하지 않고 효과적으로 유전자 활동을 허물고 그 최적 농도, 200 μm의 500 μm의 사이에 일반적으로 morpholino의 농도를 결정하기 위해 경험적으로 테스트해야하는 동안. 바늘 오프닝의 정확한 크기는 중요하지 않습니다. 바늘 크기, 분사 압력 및 사출 시간의 범위 내에서 정확한 볼륨 볼러스을 생산하기 위해 조정할 수 있습니다. Morpholinos은 단백질 내에 도메인의 기능 해부 등 많은 애플 리케이션을 보유하고 있습니다. 특정 엑손 - 인트론 분기점을 대상으로 설계하면 morpholinos가 발생 splicing을 방지할 수 있습니다. 우린 두 morpholinos의 영향을 조사되는 heg의 사전 mRNA에 바인딩하는 엑손 - 인트론 분기점. morpholino heg_e3i3_egfr1는 성숙한 성적에 엑슨 3 통합의 splicing 기계 방지, 엑슨 3 인트론 세 사이의 접합을 바인딩합니다. morpholino heg_e4i4_egfr2는 비슷하게 엑슨 사를 제거합니다. exons 3, 4 모두 EGF와 같은 반복을 포함하는 도메인을 인코딩. 일부 배아는 heg_e4i4_egfr2 알맞게 phenocopy 돌연변이와 함께 주입, 추가 실험은 심장 개발에 엑슨 4 Heg의 역할을 이해해야합니다. 놀랍게도, heg_e3i3_egfr1 주사 배아는 뇌 부종, heg 돌연변이에 보지 기능이 있습니다. 이 접합자의 돌연변이에 영향을받지 될 산모 기록을 바인딩하는 morpholinos의 능력으로 인해 발생했을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>마이크로인젝터</td><td>도구</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터</td><td>도구</td><td>Narishige International</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>니들 풀러</td><td>도구</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>도구</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 피펫</td><td>도구</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>니들 홀더</td><td>도구</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 기능을 분석 zebrafish 배아들 중 microinjection

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

공부 zebrafish의 장점 중 하나는 배아에서 단백질 수준을 조작의 용이성과 속도입니다. 대상 RNAS에 안티 센스 complementarity과 합성 oligonucleotides 아르 Morpholinos는, 특정 유전자 산물의 표현을 줄이기 위해 배아에 추가할 수 있습니다. 반대로, 처리 mRNA는 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 배 (胚)에 추가할 수 있습니다. 배아에 mRNA 또는 morpholino 중 하나를 추가하는 차량 microinjection입니다. Microinjection은 시간당 배아들 중 수백명의 주입 수있게 효율적이고 빠른 속도입니다. 이 비디오는 microinjection에 관련된 모든 단계를 보여줍니다. 간단히, 달걀이 마련되는 즉시 수집하여 배양 접시에있는 현미경 슬라이드 대항 줄지어 있습니다. 다음 사출 소재로 로드된 미세 스쳐 바늘은 microinjector와 공기 소스에 연결하고 microinjector 컨트롤은 바람직한 사출 볼륨을 생산하기 위해 조정됩니다. 마지막으로, 바늘은 배아의 노른자 속으로 뛰어들었다이며 morpholino 또는 mRNA 퇴학입니다.

이 동영상은 morpholino 또는 mRNA가 감소 또는 후속 개발 중에 특정 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 한 세포 단계에서 zebrafish 배아에 주입 수있는 방법을 보여줍니다.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

제브라피시를 연구할 때 얻을 수 있는 장점 중 하나는 배아 내 단백질 수준을 쉽고 빠르게 조절할 수 있다는 점입니다. 합성...

암수 제브라피쉬를 산란 케이지에서 교배시키면 수정란이 바닥으로 떨어져 쉽게 수집할 수 있습니다. 그다음, 페트리 접시 내의 현미경 슬라이드에 알을 일렬로 배열합니다. 이어서, 충전된 주사 바늘을 고정하고 주입 설정을 조절하여, 마이크로미터로 측정했을 때 주입 볼루스(bolus)가 원하는 크기가 되도록 합니다.마지막으로, 난자를 하나씩 차례대로 주입합니다. 안녕하세요, 저는 보스턴 어린이 병원 심장학과 John MA 연구실의 Jonathan Rosen입니다. 그리고 저는 마찬가지로 VY 연구실 소속인 Michael Sweeney입니다.오늘은 mRNA 또는 morpholino를 제브라피쉬 배아에 주입하는 방법을 시연하겠습니다. 저희 실험실에서는 특정 유전자 산물의 넉다운(knockdown) 또는 과발현 효과를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.먼저, 전체 난자 생산량을 늘리기 위해 주입 전날 밤에 격리판을 설치하여 어류 및 교배 수조를 준비합니다. 필요한 경우 암컷 두 마리와 수컷 한 마리의 비율로 구성할 수 있습니다. 다음 날 아침 실내 조명이 켜지면, 여러 수조에서 격리판을 제거하고 약 20분 동안 방해받지 않고 교배할 수 있도록 합니다. 체를 사용하여 교배 케이지에서 난자를 수집하고, egg water로 헹군 후 페트리 접시에 붓습니다.난수를 사용하여 어류를 더 큰 수조에 다시 모으면 주입에 필요한 난자를 추가로 더 생산할 수 있습니다. 난자가 단세포 단계를 지나지 않도록 하면서 최대한 많은 양의 난자를 생산할 수 있도록 난자 채집 시점을 조절하십시오. 마지막으로, 100 millimeter 페트리 접시의 뒤집힌 뚜껑에 현미경 슬라이드를 배치하십시오.전달 피펫을 사용하여 알들을 슬라이드 측면에 일렬로 배치해 단일 열을 만들고, 알의 반대편 측면에 Kim wipe를 눌러 슬라이드에서 과잉의 알 용액을 제거합니다. 다음으로, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 미세 주입 바늘을 준비합니다. 외경 1 mm 유리 모세관을 당겨 두 개의 바늘로 만들고, 이 바늘들을 150 mm 페트리 접시에 보관합니다. 실리콘 퍼티(silly putty) 경사면에 올려두어 바늘을 미리 제작해 둘 수 있습니다.다음 설정을 사용합니다. Heat 6, 45 pole 60, velocity 80. 마이크로 로더 피펫을 사용하여 니들의 넓은 끝단에 3 µL의 주입 물질을 적재합니다.기포가 거의 또는 전혀 남지 않을 때까지 볼루스를 바늘 팁 방향으로 흔들어 줍니다. 다음으로, 공기 공급원과 마이크로 인젝터를 켭니다. 바늘을 마이크로 인젝터에 삽입하고 하우징 내에서 밀봉이 확실히 되었는지 확인합니다.마이크로 조작기가 넓은 범위의 이동과 조절이 가능하도록 적절한 위치에 있는지 확인하십시오. 바늘 끝을 현미경의 시야각 내로 가져옵니다. 스테이지에서 높게 띄운 후 바늘 끝의 가장 얇은 영역에 초점을 맞추십시오.날카로운 핀셋을 사용하여 바늘을 끊어내되, 난황과 배아를 뚫을 수 있을 만큼 충분히 가늘면서도 일정한 크기의 비드를 생성할 수 있는 지점을 선택합니다. 각 주입량을 계산하기 위해, 마이크로미터 위에 미네랄 오일 한 방울을 떨어뜨리고 바늘을 오일에 삽입한 후 풋 페달을 눌러 용액 비드를 오일 속에 주입합니다. 오일에 주입하는 동안 비드의 크기를 모니터링하며, 필요에 따라 바늘의 길이를 조정하거나 주입 압력을 조절합니다.직경 0.1 mm의 비드는 500 pL의 주입 물질을 포함합니다. 일반적으로 500 pL 또는 1 nL의 주입 부피가 사용됩니다. 이상적인 주입 부피는 난자 부피의 약 10%를 채우는 수준입니다.바늘 팁의 품질은 주입의 용이성과 결과의 품질 및 일관성 모두에 매우 중요합니다. 이제 주입 절차를 시작하기 위해 주입을 진행할 차례입니다. 배아가 4세포기 이후로 발달하지 않았는지 확인하십시오.이상적으로는 배아가 1세포기에 있어야 합니다. 다음으로, 바늘을 난자 열 쪽으로 내린 후, 관찰하면서 코리온 표면을 뚫고 한 번의 매끄러운 동작으로 난황 내부로 진입시키십시오. 난황낭이 으깨지거나 찢어진 경우, 주입 물질을 난황에 주입하십시오.기포가 주입되지 않도록 주의하고, 공정을 진행하며 주입 과정에서 눈에 띄게 손상된 배아가 있는지 살핍니다. 일정한 비드 크기를 유지하기 위해 필요한 경우 압력을 조절하며, 피펫 팁을 사용하여 수정되지 않았거나 주입 과정 중 파괴된 난자를 제거합니다. 난자 한 열의 주입을 완료한 후, 난자 배양액을 부드럽게 흘려 주입된 난자들을 깨끗한 페트리 접시로 옮기고 필요에 따라 이 과정을 반복합니다.대조군으로 주입하지 않은 배아 여러 개를 남겨둡니다. 첫째 날 중 나중에 죽은 배아를 제거하고 주입된 배아의 수를 기록합니다. 감염 가능성을 줄이기 위해 디시의 난자수를 주기적으로 교체하십시오.주입되는 물질에 따라 배아의 생존율이 주입되지 않은 대조군 배아보다 낮을 수 있다는 점에 유의하십시오. 다행히 매우 많은 수의 배아를 쉽게 주입할 수 있으므로 이는 거의 문제가 되지 않습니다. 이제 morpho 주입과 mRNA 주입 각각의 대표적인 결과물을 보여드리겠습니다.수정 후 48시간째의 비주입 대조군은 예상대로 정상적인 모습을 보입니다. 하지만 두 개의 EEG-like 반복 서열 중 첫 번째를 포함하는 HG 동형 단백질(isoform)을 넉다운시키는 morpho HG E three i three eeg FFR one을 주입한 배아에서는 뇌 부종과 심장 유리(heart glass) 현상이 나타납니다. heart glass mRNA 주입 또한 수정 후 24시간째에 뚜렷한 표현형을 생성했습니다.주입하지 않은 대조군의 머리는 정상적으로 보였습니다. 반대로, M NNA가 주입된 배아 중 일부에서는 안구 결손이 나타났습니다. 우리는 방금 1세포기 단계에서 morpholino 또는 mRNA를 주입하여 이후 발달 과정 중 특정 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시키는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 다음 사항을 기억하는 것이 중요합니다.mRNA 또는 morpho의 고농도는 morpho가 처리된 배아에서 비특이적인 치사율을 유발할 수 있습니다. 각각의 농도는 실험적으로 테스트해야 하지만, 일반적으로 200에서 500 micromolar 사이의 농도가 전체적인 치사율을 유발하지 않으면서 특정 유전자의 활성을 특이적으로 억제합니다. 이것으로 설명이 끝났습니다.시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

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