유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

암수 제브라피쉬를 산란 케이지에서 교배시키면 수정란이 바닥으로 떨어져 쉽게 수집할 수 있습니다. 그다음, 페트리 접시 내의 현미경 슬라이드에 알을 일렬로 배열합니다. 이어서, 충전된 주사 바늘을 고정하고 주입 설정을 조절하여, 마이크로미터로 측정했을 때 주입 볼루스(bolus)가 원하는 크기가 되도록 합니다.

마지막으로, 난자를 하나씩 차례대로 주입합니다. 안녕하세요, 저는 보스턴 어린이 병원 심장학과 John MA 연구실의 Jonathan Rosen입니다. 그리고 저는 마찬가지로 VY 연구실 소속인 Michael Sweeney입니다.

오늘은 mRNA 또는 morpholino를 제브라피쉬 배아에 주입하는 방법을 시연하겠습니다. 저희 실험실에서는 특정 유전자 산물의 넉다운(knockdown) 또는 과발현 효과를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

먼저, 전체 난자 생산량을 늘리기 위해 주입 전날 밤에 격리판을 설치하여 어류 및 교배 수조를 준비합니다. 필요한 경우 암컷 두 마리와 수컷 한 마리의 비율로 구성할 수 있습니다. 다음 날 아침 실내 조명이 켜지면, 여러 수조에서 격리판을 제거하고 약 20분 동안 방해받지 않고 교배할 수 있도록 합니다. 체를 사용하여 교배 케이지에서 난자를 수집하고, egg water로 헹군 후 페트리 접시에 붓습니다.

난수를 사용하여 어류를 더 큰 수조에 다시 모으면 주입에 필요한 난자를 추가로 더 생산할 수 있습니다. 난자가 단세포 단계를 지나지 않도록 하면서 최대한 많은 양의 난자를 생산할 수 있도록 난자 채집 시점을 조절하십시오. 마지막으로, 100 millimeter 페트리 접시의 뒤집힌 뚜껑에 현미경 슬라이드를 배치하십시오.

전달 피펫을 사용하여 알들을 슬라이드 측면에 일렬로 배치해 단일 열을 만들고, 알의 반대편 측면에 Kim wipe를 눌러 슬라이드에서 과잉의 알 용액을 제거합니다. 다음으로, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 미세 주입 바늘을 준비합니다. 외경 1 mm 유리 모세관을 당겨 두 개의 바늘로 만들고, 이 바늘들을 150 mm 페트리 접시에 보관합니다. 실리콘 퍼티(silly putty) 경사면에 올려두어 바늘을 미리 제작해 둘 수 있습니다.

다음 설정을 사용합니다. Heat 6, 45 pole 60, velocity 80. 마이크로 로더 피펫을 사용하여 니들의 넓은 끝단에 3 µL의 주입 물질을 적재합니다.

기포가 거의 또는 전혀 남지 않을 때까지 볼루스를 바늘 팁 방향으로 흔들어 줍니다. 다음으로, 공기 공급원과 마이크로 인젝터를 켭니다. 바늘을 마이크로 인젝터에 삽입하고 하우징 내에서 밀봉이 확실히 되었는지 확인합니다.

마이크로 조작기가 넓은 범위의 이동과 조절이 가능하도록 적절한 위치에 있는지 확인하십시오. 바늘 끝을 현미경의 시야각 내로 가져옵니다. 스테이지에서 높게 띄운 후 바늘 끝의 가장 얇은 영역에 초점을 맞추십시오.

날카로운 핀셋을 사용하여 바늘을 끊어내되, 난황과 배아를 뚫을 수 있을 만큼 충분히 가늘면서도 일정한 크기의 비드를 생성할 수 있는 지점을 선택합니다. 각 주입량을 계산하기 위해, 마이크로미터 위에 미네랄 오일 한 방울을 떨어뜨리고 바늘을 오일에 삽입한 후 풋 페달을 눌러 용액 비드를 오일 속에 주입합니다. 오일에 주입하는 동안 비드의 크기를 모니터링하며, 필요에 따라 바늘의 길이를 조정하거나 주입 압력을 조절합니다.

직경 0.1 mm의 비드는 500 pL의 주입 물질을 포함합니다. 일반적으로 500 pL 또는 1 nL의 주입 부피가 사용됩니다. 이상적인 주입 부피는 난자 부피의 약 10%를 채우는 수준입니다.

바늘 팁의 품질은 주입의 용이성과 결과의 품질 및 일관성 모두에 매우 중요합니다. 이제 주입 절차를 시작하기 위해 주입을 진행할 차례입니다. 배아가 4세포기 이후로 발달하지 않았는지 확인하십시오.

이상적으로는 배아가 1세포기에 있어야 합니다. 다음으로, 바늘을 난자 열 쪽으로 내린 후, 관찰하면서 코리온 표면을 뚫고 한 번의 매끄러운 동작으로 난황 내부로 진입시키십시오. 난황낭이 으깨지거나 찢어진 경우, 주입 물질을 난황에 주입하십시오.

기포가 주입되지 않도록 주의하고, 공정을 진행하며 주입 과정에서 눈에 띄게 손상된 배아가 있는지 살핍니다. 일정한 비드 크기를 유지하기 위해 필요한 경우 압력을 조절하며, 피펫 팁을 사용하여 수정되지 않았거나 주입 과정 중 파괴된 난자를 제거합니다. 난자 한 열의 주입을 완료한 후, 난자 배양액을 부드럽게 흘려 주입된 난자들을 깨끗한 페트리 접시로 옮기고 필요에 따라 이 과정을 반복합니다.

대조군으로 주입하지 않은 배아 여러 개를 남겨둡니다. 첫째 날 중 나중에 죽은 배아를 제거하고 주입된 배아의 수를 기록합니다. 감염 가능성을 줄이기 위해 디시의 난자수를 주기적으로 교체하십시오.

주입되는 물질에 따라 배아의 생존율이 주입되지 않은 대조군 배아보다 낮을 수 있다는 점에 유의하십시오. 다행히 매우 많은 수의 배아를 쉽게 주입할 수 있으므로 이는 거의 문제가 되지 않습니다. 이제 morpho 주입과 mRNA 주입 각각의 대표적인 결과물을 보여드리겠습니다.

수정 후 48시간째의 비주입 대조군은 예상대로 정상적인 모습을 보입니다. 하지만 두 개의 EEG-like 반복 서열 중 첫 번째를 포함하는 HG 동형 단백질(isoform)을 넉다운시키는 morpho HG E three i three eeg FFR one을 주입한 배아에서는 뇌 부종과 심장 유리(heart glass) 현상이 나타납니다. heart glass mRNA 주입 또한 수정 후 24시간째에 뚜렷한 표현형을 생성했습니다.

주입하지 않은 대조군의 머리는 정상적으로 보였습니다. 반대로, M NNA가 주입된 배아 중 일부에서는 안구 결손이 나타났습니다. 우리는 방금 1세포기 단계에서 morpholino 또는 mRNA를 주입하여 이후 발달 과정 중 특정 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시키는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 다음 사항을 기억하는 것이 중요합니다.

mRNA 또는 morpho의 고농도는 morpho가 처리된 배아에서 비특이적인 치사율을 유발할 수 있습니다. 각각의 농도는 실험적으로 테스트해야 하지만, 일반적으로 200에서 500 micromolar 사이의 농도가 전체적인 치사율을 유발하지 않으면서 특정 유전자의 활성을 특이적으로 억제합니다. 이것으로 설명이 끝났습니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.