Name: 인간 췌장 아일릿 격리 : 부품 I : 소화 및 췌장 조직의 수집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 학습하세요 인간 췌장 아일릿 격리 방법으로, 자동화된 소화 및 조직 수집 기술을 활용하여 고품질 아일릿을 확보하는 과정입니다. 이 기술은 당뇨병 치료를 위한 이식 연구에 필수적입니다.

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시카고 일리노이 대학뿐만 아니라 아일릿 세포 자원 센터 NIH 그랜트 (RFA - RR 05-003), 크리스토퍼 재단 Efroymson 재단과 Tellabs 재단에서 기금을 지원.

1. 시설 설치 <ol><li> 인간 아일릿 절연은 팀웍과 관련된 시간 민감한 절차이며, 따라서, 넷 개인이 절차를 수행하기 위해 필요합니다. 팀은 dissects과 췌장을 cannulates 외과 의사에 의해 리드입니다. </li><li> 아일릿 절연은 팀이 UIC 아일릿 격리 시설을 입력하는 순간을 시작합니다. 팀 구성원은 필요한 모든 장비는 원심 분리기와 같은 검사입니다 켜져 있는지 확인하십시오. 그들은 또한 모든 후즈과 표면을 살균해야합니다. </li><li> 두 사람은 cannulation 테이블, 슬러쉬 기계, 소화 회로, 재관류 장치, COBE 정화 기계, 및 수술 테이블을 설정합니다. </li><li> 동시에, 다른 두 팀 구성원은 격리하는 동안 필요한 미디어를 준비합니다. </li><li> 다음 세균학 튜브 (병, 튜브, 형태 및 가방), 샘플링 튜브 (세척 사전 가득) 및 평가 튜브와 플레이트는 준비가되어 있습니다. </li><li> 다음과 같이 설정 정화 튜브를 준비 : 제 1 관 빈 150 ML에 표시된 튜브 2-12 인간 알부민 (세척 용액)과 보충 M199 미디어 200 ML 가득 230 ML에 표시하고, 드디어 한 50 ML 원뿔 관 세척 솔루션 50 ML 가득. 일단 이러한 준비 단계 우리가 준비하고 췌장을 perfusing 시작할 준비가 완료됩니다. </li></ol> 2. 췌장 준비 및 재관류 <ol><li> 준비와 췌장의 재관류를 시작하려면 연산자는 멸균 기술을 사용하여 패키지에서 장기를 제거합니다. 의사는 오염 제거 테이블에 췌장을 전송합니다. </li><li> 외과 원래 췌장 보존 솔루션과 준비 &quot;조달&quot;세균학 병을 채우기 위해 그것을 사용합니다 운영자에게 손으로 그것을 하나의 60 ML의 주사기를 작성합니다. </li><li> 장기가 아일릿 절연 (췌장이 조달하는 동안 손상이나 해부학적인 몸의 구조도 비정상적인 경우가 아일릿 절연을 위해 사용할 수 없습니다)에 적합 여부를 확인하는 육안​​ 검사 후, 의사는 collagenase를 준비하는 연산자를 요청합니다. 저 다시 중단 시간이 서로 다른 효소 브랜드와 많은 사이 다릅니다 것을 기억하십시오. </li><li> 외과 의사가 준비되면 오염 제거 테이블 (Betadine, Fungizone / Cefazolin하고 HBSS) 오염 제거 솔루션을 가지고 적절한 용기에 그들을 부어. 외과 의사는 잠시 오염 제거 솔루션의 각 췌장을 세척 췌장의 오염 제거를 수행합니다. 췌장은 다음이 무게 것입있는 작은 멸균 병에 배치됩니다. 무게가 배치 기록에 입력 후, 췌장 일부 보존 솔루션 cannulation의 냄비에 배치됩니다. </li><li> 외과의 노출과 부분적으로 메인 덕트를 절개하고 정맥과 함께 췌장의 각 절반을 cannulate 것입니다. 정맥은 봉합에 의해 보안됩니다. 췌장을 perfuse하려면 먼저 재관류 단위로 이동하고 분지에 효소 솔루션을 부어. 총 재관류 시간은 5 분 동안 180 mmHg에서 다음 5 분 80 mmHg에서 약 10 분 거리에 있습니다. 췌장은 재관류 후 커지는. </li><li> 지방 조직은 신중하게 췌장에서 손질되는 cannulation의 이동 perfused 췌장을 이동합니다. 다음 10-12 조각으로 췌장을 절감하고 소화에 대한 Ricordi 상공 회의소로 전송할 수 있습니다. </li></ol> 3. 췌장의 소화 <ol><li> 소화 단계를 시작하려면, 빈 Ricordi 회의소로 췌장을 전송 화면에 넣어 Pulmozyme 중 하나를 2.5 ML의 약병을 (챔버를 조직 블록의 큰 덩어리를 방지) 추가 챔버를 닫고 시스템을 작성하십시오. </li><li> 5 분 해결책을 펌핑 시작합니다. 부드럽게 골고루 따뜻한 솔루션을 걸쳐 해산하는 곳에는 바위. 5 분 후에, 부드럽게 전체 소화 단계에 대한 챔버를 흔들. 37 온도를 유지 ˚ C. </li><li> 온도가 37 ° 후 챔버를 흔들어에 도달할 때까지 부드럽게 챔버 록. 샘플에게 2 분마다을 받아 무료로 아일 레츠이 범위 아래에서 발견될 경우 감지합니다. 배치 기록의 소화 테이블에 아일릿 평가 정보를 기록합니다. 그들의 50 %가 솔루션에 무료로 절연 부동있을 때까지 아일 레츠의 비율을 지속적으로 모니터. </li></ol> 4. 조직 모음 <ol><li> 일단 아일 레츠의 50 %가 샘플 무료 발견, 소화는 회로의 차가운 RPMI 희석 솔루션을 추가하여 중지됩니다. 티슈 500 ML 원뿔 튜브 30 ML 인간 알부민과 함께 미리 채워진에 수집됩니다. 일단 튜브는 흡입이 뜨는에서, 버리고 차가운 씻어 솔루션으로 펠렛을 씻어 있습니다. 일분, 4 ˚ C. 위해 1100 RPM (분당 돌리기)에서 원뿔 튜브를 스핀 </li><li> 한 500 ML 원뿔로 소화 췌장 조직과 정지 모든 컬렉션 튜브를 결합합니다. 튜브 세차 조직 가득 차면, 분사 모든 조직은 여러 번 씻어 때까지 세척 과정을 반복합니다. 이 튜브를 회전하고 단일 250 ML 원뿔 관에 조직을 전송합니다. 250 ML까지를 볼륨을 가지고M199 세척 솔루션은 HA와 함께 보충 및 샘플링을위한 준비를합니다. </li><li> 피펫과 1 ML 샘플을 가지고 씻어 솔루션 9 ML 사전 가득한 15 ML 원뿔 관에 추가할 수 있습니다. 그런 다음 그리드 계산 접시에 직접 1ml 밖으로 부드럽게 반전 15 ML 원뿔 관에 의해이에서 샘플을 섞는다. 세포를 카운트하고, 희석 요인 2500 (10x250)의를 사용하여 휴대폰 번호를 계산합니다. </li><li> 250 ML 원뿔 튜브를 스핀과 UW (위스콘신 대학) 일반적으로 장기 보존을 위해 사용하는 솔루션 150 ML를 추가합니다. UW이 추가되면, 피펫을 사용하여 철저하게 세포 현탁액을 섞는다. UW의 시작 시간을 기록하고 정화 연산자로 통신합니다. 얼음 가끔 소용돌이에 튜브 (들)을 둡니다. 이제 아일 레츠는 더욱 정화 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
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<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
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<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

절연 결과 9,10 영향을 미치는 다양한 요소가 있습니다. 그 중에서도 췌장 조직의 소화는 현저한 역할을한다. 우리 자신의 인간 아일릿 절연 경험을 바탕으로, 우리는 잠재적으로 아일릿 수율과 품질에 영향을 미칠 수있는 중요한 포인트 아래와 요약. <ol><li> 효소의 종류가 활용되면 소화 시간이 다릅니다. </li><li> 즉시 완전히 acinar 조직에서 분리 아일 레츠의 40~50%로 소화가 희석 솔루션을 추가하고 조직을 아래로 냉각하여 즉시 중단해야합니다. </li><li> 조직의 부드러운 처리, 수집, 세탁, 그리고 혼합 때. </li><li> 수집 조직 및 UW 솔루션의 조합은 더 나은 정화 결과를 얻기 위해서는 적어도 30 분 동안 얼음에 배치해야합니다. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>아이스 슬러시 머신</td><td>장비</td><td>Taylor Company</td><td>K4036546</td><td>멸균 얼음 제조</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>장비</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 도립 현미경 TLBD4.1</td><td>장비</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>2 mm 그리드 세포 배양 접시</td><td>장비</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>췌도 세포 수 측정</td></tr><tr><td>디지털 항온수조 EX7</td><td>장비</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>온도계</td><td>장비</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>MonoBloc 저울 AB 104-S</td><td>장비</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>췌장 무게 측정</td></tr><tr><td>MasterFlex II 속도 조절기</td><td>장비</td><td>Cole-Parmer</td><td>J00006445</td><td>소화 과정 중 유속 조절</td></tr><tr><td>디지털 사이트 DS L1</td><td>장비</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>관류 장치</td><td>장비</td><td>주문 제작</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>관류 장치용 냉각기</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>Ricordi 챔버</td><td>장비</td><td>University of Miami</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 희석액</td><td>시약</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>위스콘신 대학교(UW) 용액</td><td>시약</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 완충염 용액 (HBSS)</td><td>시약</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>25% 인혈청 알부민</td><td>시약</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>M199 배지 (세척액)</td><td>시약</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase NB1 GMP 등급</td><td>시약</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Protease NB1 GMP 등급</td><td>시약</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>베타딘</td><td>시약</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>세파졸린</td><td>시약</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>디티존</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 췌장 아일릿 격리 : 부품 i : 소화 및 췌장 조직의 수집

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

1 형 당뇨병의 관리는 매년 100여 억 달러를 비용, 모두 개인과 사회에, 부담합니다. 포도당 모니터링 및 새로운 인슐린 공법의 광범위한 사용에도 불구하고, 많은 사람은 여전히​​ 파괴적인 보조 합병증을 개발합니다. 췌장 아일릿 이식은 당뇨병 환자에서 정상적인 혈당 조절 근처에 복원할 수 있습니다<sup&gt; 1</sup&gt;, 집중적인 인슐린 요법과 관련된 심각한 혈당 에피소드의 위험이없이. 충분한 아일릿 질량을 제공하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 중요합니다. 그러나 기증자 특성, 기관 조달 및 보존은 절연 결과에 영향을<sup&gt; 2</sup&gt;. 시카고 일리노이 대학 (UIC)에서 우리는 개선 정화 기울기와 함께 성공적인 격리 프로토콜을 개발했습니다<sup&gt; 3</sup&gt;. 이 프로그램은 2004 년 1 월 시작, 그리고 300 개 이상의 isolations 11 월 2008까지 수행했다. pancreata는 (UW, 위스콘신 또는 HTK 대학, 히스티딘 - 트립토판 Ketoglutarate) 차가운 보존 솔루션에 보내진<sup&gt; 4-7</sup&gt; 아일릿 절연을위한 UIC에서 셀 절연 연구실 있습니다. 췌장 아일 레츠는 원래 Ricordi에 기술된 방법의 수정된 버전입니다 UIC 방법을 사용하여 격리되었다<em&gt; 외</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. 간단히, 주변 조직에서 췌장 청소 후에, 그것은 효소 솔루션 (Serva Collagenase + 중성 프로 테아제 또는 시그마 V 효소)와 perfused했습니다. 커지는 췌장은 다음 Ricordi의 소화 챔버로 전학 수정, 폐쇄 순환 튜브 시스템에 연결하고, 37 ° C.까지 예열했다 소화 동안 챔버가 부드럽게 흔들리고되었습니다. 샘플은 소화의 진행 상태를 모니터링하는 연속적으로 촬영했다. 무료 아일 레츠가 현미경으로 발견되었습니다되면, 소화가 추위 플러싱에 의해 중지되었습니다 (4 ° C) 효소를 희석하기 위해 순환 시스템에 RPMI 희석 용액 (Mediatech, 헤른던, VA). 수집과 인간의 알부민과 보충 M199 미디어 씻은 후에, 조직은 미리 정화 개수에 대한 샘플과 정화 ​​전에 UW 솔루션 incubated했다. 인간 아일 레츠의 정화와 문화 : 정제 과정은 부 II에서 설명하는 것입니다.

높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연을위한 절차 : 수정된 자동화된 방법을 사용하여 (부분 I 소화 및 췌장 조직의 수집).

인간 췌장 아일릿 격리 : 부품 I : 소화 및 췌장 조직의 수집

제1형 당뇨병의 관리는 개인과 사회 모두에게 부담이 되며, 연간 1,000억 달러 이상의 비용이 발생합니다. ...의 광범위한 사용에도 불구하고...

이 절차는 정상 기증자 췌장 조직을 확보하는 것으로 시작합니다. 간단한 트리밍 단계를 거친 후, 팽창된 췌장을 균일한 조각으로 절단하여 소화 챔버로 옮깁니다. 췌장에 캐뉴를 삽입하고 자동 관류 장치를 통해 캐뉴로 콜라게나제 용액을 주입합니다.마지막으로, 췌장 조직을 대용량 원추형 튜브에 수집하며, 이후 영상에서 보여줄 islet 이식을 위해 추가로 정제합니다. 안녕하세요, 저는 일리노이 대학교 시카고 캠퍼스 외과부 Human Islet Program의 American Chief입니다. 안녕하세요, 제 이름은 Barbara Barbero이며 저 또한 Human Islet Program 소속입니다.오늘은 인간 췌도 분리 절차를 보여드리겠습니다. 저희 시설에서는 임상적 용도로 사용할 고품질의 인간 췌도를 수확하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.인간 췌도 분리는 시간 민감도가 높은 절차로 팀워크가 필요하며, 따라서 이 절차를 수행하기 위해서는 4명의 인원이 필요합니다. 팀은 췌장을 절제하고 캐뉼라를 삽입하는 외과 의사가 이끕니다. 췌도 분리는 팀이 UIC 췌도 분리 시설에 진입하는 순간부터 시작됩니다.팀원들은 원심분리기와 같은 모든 필요한 기기가 점검되었는지 확인하고 전원을 켭니다. 또한 모든 후드와 표면을 소독합니다. 두 명의 인원이 캐뉼레이션 테이블, 슬러시 머신 소화 장치, 회로 관류 장치, 유닛 코프 정제기 및 수술대를 설치합니다.동시에, 다른 두 팀원은 분리 과정에 필요한 배지를 준비합니다. 다음으로, 세균학 시험관, 시료 채취관, 분석용 시험관 및 플레이트를 준비합니다. 정제 시험관 세트를 다음과 같이 준비하는데, 첫 번째 시험관은 비워두고 150 milliliters 지점에 표시를 합니다.2번부터 12번 튜브에 휴먼 알부민 또는 세척액이 첨가된 M1 99 배지 200 milliliters를 채우고 230 milliliters 지점에 표시합니다. 마지막으로, 50 milliliter 원추형 튜브 하나에 세척액 50 milliliters를 채웁니다.이러한 준비 단계가 완료되면, 췌장의 전처리와 관류를 시작할 준비가 된 것입니다. 췌장의 전처리와 관류를 시작하기 위해, 작업자는 포장지에서 장기를 꺼냅니다. 외과 의사는 멸균 기술을 사용하여 췌장을 오염 제거 테이블로 옮깁니다.외과 의사는 60 cc 주사기 하나에 원래의 췌장 보존액을 채워 작업자에게 전달하며, 작업자는 이를 사용하여 준비된 조달 박테리아 배양병을 채웁니다. 장기가 아일렛 분리에 적합한지 육안으로 검사한 후, 외과 의사는 작업자에게 콜라게나아제를 준비하도록 요청합니다. 준비는 조아트입니다.적출 과정 중 췌장이 손상되었거나 해부학적 이상이 있는 경우, islet 분리에 사용할 수 없습니다. Resus 현탁액의 처리 시간은 효소 브랜드 및 로트마다 다르다는 점에 유의하십시오. 외과 의사가 준비되면, 오염 제거 용액을 오염 제거 테이블로 가져가 적절한 용기에 부으십시오.외과의는 췌장을 1분 동안 세척하여 오염 물질을 제거합니다. 그 후 췌장을 각 제균 용액이 담긴 소형 멸균 용기에 넣어 무게를 측정합니다. 무게를 배치 기록서에 기입한 후, 췌장을 캐뉼라 삽입용 팬에 놓습니다.외과의는 일부 보존액을 사용하여 주관을 노출시키고 부분적으로 절개한 다음, 췌장의 각 반부를 캐뉼라로 삽입하고 봉합사로 고정하여 췌장에 관류를 실시합니다. 먼저, 이를 관류 장치로 이동시키고 효소 용액을 수조에 붓습니다. 총 관류 시간은 약 10분이며, 80 mmHg에서 5분 동안 진행합니다.그 후 180 mmHg의 압력으로 5분 동안 유지하면 췌장이 팽창된 것처럼 보일 것입니다. 관류가 끝나면 관류된 췌장을 캐뉼라 팬으로 옮겨 췌장에서 지방 조직을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 췌장을 10~12조각으로 잘라 소화를 위해 기록 챔버로 옮깁니다.소화 단계를 시작하려면 췌장을 빈 기록 챔버로 옮깁니다. 챔버를 막지 않도록 주의하며 화면에 놓인 2.5 mL Pulmozyme 바이알 하나를 추가하고, 챔버를 닫은 후 시스템을 채웁니다. 5분 동안 용액을 펌핑합니다.챔버를 가볍게 흔들어 따뜻한 용액이 전체적으로 고르게 분산되도록 합니다. 5분 후, 전체 소화 단계 동안 챔버를 가볍게 흔들어 줍니다. 온도는 37 °C로 유지합니다.2분마다 샘플을 채취하여 현미경 하에서 유리 아일렛(free eyelets)이 발견되는지 확인하고, 배치 레코드의 소화 표에 아일렛 평가 정보를 기록하십시오. 아일렛의 50%가 용액 내에 유리 상태로 분리되어 떠 있을 때까지 백분율을 지속적으로 모니터링하십시오. 샘플에서 아일렛의 50%가 유리 상태로 확인되면, 차가운 RPMI 희석액을 첨가하여 소화를 중단합니다.회로 조직을 30 mL의 Human albumin이 미리 채워진 500 mL 원추형 튜브에 수집합니다. 원추형 튜브를 4 °C에서 1100 RPM으로 1분 동안 원심분리합니다.튜브를 원심분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 펠렛을 세척합니다. 차가운 세척액을 사용하여 소화된 췌장 조직이 현탁된 모든 수집 튜브를 하나의 500 milliliter 원추형 튜브에 합칩니다. 세척된 조직으로 튜브가 가득 차면 원심분리하고, 모든 조직이 여러 번 세척될 때까지 세척 과정을 반복합니다.이 튜브를 원심 분리하고 조직을 단일 250 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 휴먼 알부민이 첨가된 M1 99 세척액을 사용하여 부피를 250 milliliters로 맞춘 후 샘플링을 준비합니다. 피펫으로 1 milliliter 샘플을 취해 세척액 9 milliliters가 미리 채워진 15 milliliter 원추형 튜브에 넣습니다.그 다음 15 mL 원추형 튜브를 가볍게 반전시켜 혼합합니다. 이 샘플에서 1 mL를 격자 세포 계수기에 직접 분취합니다. 세포 수를 세어 세포 수를 계산합니다.희석 배수 2,500을 사용하여 250 milliliter 원추형 튜브를 스핀하고 150 milliliters의 uw. University of Wisconsin Solution을 첨가하십시오. UW를 첨가한 후, 피펫팅을 통해 세포 현탁액을 충분히 혼합하고 이를 정제 담당자에게 기록 및 전달하십시오.uw에서의 시작 시간입니다. 튜브를 얼음에 박아두고 가끔씩 소용돌이 모양으로 섞어줍니다. 이제 이 단계에서 아일렛(eyelets)을 추가로 정제할 수 있으며, 세포 수 측정을 위해 정제되지 않은 췌장 조직 샘플을 채취합니다.다이온 용액을 시료에 첨가하면 췌도 세포군만 붉게 염색됩니다. 이를 통해 이들의 품질과 양을 평가할 수 있습니다. 본 영상에서는 성공적인 췌도 이식에 필수적인 고품질의 다량의 인간 췌도 세포를 분리하는 절차를 시연하였습니다.저희의 경험에 따르면, 인간 섬유세포(eyelets)의 40~50%가 주변 내측 조직으로부터 분리되는 즉시, 소화 혼합물을 희석하고 냉각시켜 소화 과정을 최대한 빠르게 중단시켜야 합니다. 또한 조직을 수집, 세척 및 혼합하는 동안 부드럽게 다루는 것이 중요합니다. 저희는 고순도의 인간 섬유세포를 우수하게 회수할 수 있는 U University의 매우 훌륭한 Chicago 정제 방법을 사용할 것을 권장합니다.이 방법은 또한 분리 시간을 현저히 단축하여, 안구 소절(eyelet)의 허혈 관련 손상을 최소화합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연 (부분 II : 인간 아일 레츠의 정화 및 문화)에 대한 절차를 수정 자동화된 방법을 사용하여.

인간 췌장 아일릿 절연 : 2 부 : 인간 아일 레츠의 정화와 문화

연구 2 형 당뇨병 아일 레츠의 공급 부족이다. 여기 부분 pancreatectomy를 겪고 환자에서 아일 레츠를 분리를위한 프로토콜을 공유할 수 있습니다. 이 방법은 제 2 형 당뇨병 환자에서 아일 레츠을 얻기위한 독특한 장소를 나타내며 임상 기초 및 임상 연구에 적합한 숫자가 아닌 당뇨병 과목과 일치.

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

랑게르한스 섬이라고도 불리는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능을 위한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 프로토콜은 먼저 Vater의 Ampulla를 통해 콜라겐 분해 효소를 관류하여 외분비 췌장 조직을 소화하고 단순화 된 밀도 구배 원심 분리를 통해 췌장 섬을 분리하는 방법을 설명합니다.

콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

당뇨병 연구 분야에 중요한 도전은 섬 β 세포 복제를 조절하고 β - 세포 재생을 자극하는 방법을 개발하는 분자 메커니즘을 이해한다. 여기서 높은 콘텐츠 스크리닝 방법 식별 및 작은 분자의 β 세포의 복제를 촉진 활성을 평가하기 제시된다.

높은 콘텐츠<em&gt; 체외</em&gt; 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

여기서, 우리는 액적 기반 의 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 단면 췌도로부터 단일 세포의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 프로토콜을 제시한다.

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

췌장 메타 플라스틱 세포는 췌장 종양을 일으키는 악성 세포의 전구체입니다. 그러나 온전한 생존 가능한 췌장 세포를 분리하는 것은 어렵습니다. 여기에서는 췌장 조직 해리를 위한 효율적인 방법을 제시합니다. 그런 다음 세포를 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 또는 2차원 또는 3차원 공동 배양에 사용할 수 있습니다.

생존 가능한 단일 세포를 분리하기 위한 췌장 조직 해부

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원차 섬과 선반세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병의 발병 기전에서 세포 간 소통을 연구하는 귀중한 도구를 제공하였습니다.

마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

학습하세요 인간 췌장 아일릿 격리 방법으로, 자동화된 소화 및 조직 수집 기술을 활용하여 고품질 아일릿을 확보하는 과정입니다. 이 기술은 당뇨병 치료를 위한 이식 연구에 필수적입니다.

인간 췌장 아일릿 격리 : 부품 I : 소화 및 췌장 조직의 수집

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