스트레스 응답하는 동안 식물 호르몬을 모니터링

이 절차는 세라믹 비드를 사용하여 식물 시료를 균질화하고, 이어서 디클로로메탄 추출을 통해 유기상을 얻는 것으로 시작합니다. 원심분리 후 시료를 공기 중에서 건조시키고 기상 추출을 위해 준비합니다. 기상 추출 필터에서 용출시킨 후, 질량 분석법과 가스 크로마토그래피를 이용하여 식물 호르몬 분석을 진행할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 이곳 샌안토니오의 텍사스 대학교 생물학과 내 JU Engelberg Lab의 Marie Engelberg입니다. 그리고 저는 Ju Engelberg입니다. 오늘은 중요한 식물 호르몬들을 동시에 정량 분석하는 간단한 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 곤충 반응 실험 중인 식물에서 이러한 호르몬의 변화를 모니터링하기 위해 이 방법을 일상적으로 사용하고 있습니다.

지방산 조성의 변화 또한 모니터링할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다. 추출을 위해 먼저 2 mL 스크류 캡 바이알 두 개를 준비하십시오.

이를 위해, 바이알에 400 µL의 추출 용액과 10 ng/µL 농도의 각 내부 표준 물질 10 µL를 첨가합니다. 다음으로, 바이알을 액체 질소에 넣어 동결시킵니다. 동결 후, 바이알에 세라믹 비즈를 첨가합니다.

바이알이 액체 질소에 놓여 있는 동안, 50에서 200 mg 사이의 식물 재료를 첨가합니다. 나중에 생체중(fresh weight)을 기준으로 정확한 정량을 수행할 수 있도록, 추가한 식물 재료의 무게를 후속 처리 전에 추정해야 함을 유의하십시오. 바이알 캡을 단단히 닫기 전에 모든 액체 질소가 증발했는지 확인하십시오.

균질화 과정 중 용매와 추출 화합물이 쏟아지는 것을 방지하기 위해 캡에 고무 씰이 있는지 확인하십시오. Fast Prep 또는 PSU 비드 그라인더를 사용하여 조직을 균질화하십시오. PSU의 경우 6,000의 속도로 30초 동안 균질화하십시오.

균질화가 완료되면 균질기에서 바이알을 개별적으로 꺼내고, 캡을 조심스럽게 열어 각 샘플에 1 mL의 di chloral methane을 첨가합니다. 바이알을 다시 단단히 닫고 6,000에서 10~15초 동안 균질화합니다. 균질화 후, 바이알을 탁상 원심분리기로 옮겨 10,000 ×g에서 60초 동안 원심분리하여 유기층과 수층을 분리합니다. 층 분리가 완료되면, 개별 바이알에서 아래쪽의 녹색 층을 깨끗한 4 mL 유리 바이알로 옮깁니다.

이것은 호르몬과 내부 표준 물질을 포함하는 유기상입니다. 물이나 상층액이 옮겨지지 않도록 주의하며, 매니폴드를 통해 공기로 약 10~25분 동안 용매를 날려 보냅니다. 소요 시간은 시료에 따라 달라집니다.

단일 에어플로우 팁을 사용하여 시료가 건조되었는지 주의 깊게 확인하십시오. 과도하게 건조할 경우 화합물이 손실될 수 있으므로 주의하시기 바랍니다. 시료가 건조되면, 시료 내의 카복실산 함유 화합물의 메틸화를 시작할 수 있습니다.

먼저, 각 바이알에 9:1 부피비의 디에틸 에테르-메탄올 혼합물 100 µL를 넣습니다. 다음으로, 헥산에 녹인 2 M trimethylsilyldiazomethane 용액 4 µL를 첨가합니다. 테플론 라이닝 실리콘 격막이 장착된 오픈톱 스크류 캡으로 바이알을 즉시 닫고, 바이알을 가볍게 흔든 후 실온에서 25~30분 동안 배양합니다.

가열 블록을 켜고 원하는 수집 온도로 설정하십시오. 메틸화된 화합물의 휘발성은 그 크기와 극성 그룹의 수에 따라 달라집니다. 온도는 80에서 200°C 사이로 설정할 수 있습니다. 30분간 배양한 후, 각 바이알에 2 M 아세트산 헥산 용액 4 µL를 첨가하여 메틸화 반응을 중단시키십시오.

이는 원치 않는 부반응을 방지하기 위해 수행됩니다. 기상 추출(vapor phase extraction)에 사용되는 필터는 수작업으로 제작됩니다. 이 필터들은 테플론 튜브로 만들어집니다.

한쪽에서 약 4cm 길이의 알맞게 맞는 유리관을 삽입합니다. 약 20~30mg의 흡착제가 담긴 두 개의 스테인리스 스틸 메쉬 디스크를 확인할 수 있습니다. 메틸화 및 휘발성 식물 호르몬 수집에 사용할 필터를 200µL의 메탄올로 세척하십시오.

다음으로, 필터를 200 µL의 디클로로메탄으로 두 번 세척합니다. 각 필터에서 남은 용매가 공기 중으로 완전히 건조되도록 합니다. 이제 이 필터들을 기상 추출을 통한 휘발성 호르몬 포집에 사용할 수 있습니다.

시료를 30분 동안 배양한 후, 4mL 바이알 캡의 고무 격막을 메스로 절개합니다. 이제 기상 추출법을 통해 식물 호르몬을 수집하기 위해 추출된 물질을 회수할 준비가 되었습니다. 세척된 필터를 분당 약 800mL의 유속으로 개별 진공 라인에 연결합니다.

그 다음, 절개된 격막을 통해 필터를 바이알에 삽입합니다. 공기 유입구 역할을 할 작은 피펫 팁도 함께 삽입합니다. 절차의 이 초기 단계 동안에는 바이알 내부의 액체가 필터 팁에 닿아 필터를 오염시키는 것을 방지하기 위해, 필터가 삽입된 바이알을 수직으로 세운 상태로 유지해야 합니다.

그 후, 모든 액체가 필터를 통해 증발할 때까지 GCMS 바이알을 손으로 잡고 유지합니다. 그런 다음 필터가 부착된 바이알을 가열 블록 위에 올리고, 가열 증발된 화합물을 3분 동안 수집합니다. 이 마지막 증기상 추출 단계가 끝나면, 필터가 부착된 상태의 바이알을 랙에 놓고 식힙니다.

필터가 실온에 도달하면 인서트가 장착된 1.5 milliliter GC 바이알을 준비합니다. 다시 150 microliters의 di chloral methane이 담긴 루프를 바이알에 넣습니다. 필터에서 남은 용매를 불어낸 후, 바이알의 캡을 닫고 가스 크로마토그래피 질량 분석법으로 분석할 수 있습니다.

분석을 위해 split/splitless 인젝터가 장착되고 화학적 이온화 모드로 작동하는 질량 분석계와 연결된 가스 크로마토그래프를 사용하며, 주입된 화합물은 40 °C에서 1분간 유지된 HP-1 MS 컬럼에서 분리됩니다. 온도는 헬륨을 운반 가스로 하여 0.7 mL/min의 일정한 유량으로 분당 15 °C씩 250 °C까지 승온시킨 후 10분간 유지하도록 프로그래밍합니다. MS 기반 분석을 위해 쿼드러폴 및 이온 트랩 기반 질량 분석계 모두 CI 가스로 사용할 수 있습니다.

이소부탄 또는 메탄올 중 어느 것을 사용해도 무방합니다. 다만, 각 경우 모두 선택한 이온 카운팅 프로그램을 작성하기 전에 이온화 반응의 파편들을 확인해야 합니다. 본 실험에서는 Saturn MS 2200 질량 분석기가 연결된 variant GC 3, 900 가스 크로마토그래피 시스템을 사용하였으며, CI 시약으로 메탄올을 사용하였습니다.

프로그램에 대한 설명은 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다. 모든 화합물은 시판되는 표준품과의 비교를 통해 확인해야 합니다. JA SA 및 A BA의 정량은 추출된 이온의 피크 면적을 각 내부 표준물질의 추출 이온 피크 면적과 상관 분석하여 수행하며, 사용된 식물 재료의 생체중을 기준으로 합니다.

GCM S 파일에서 데이터를 추출하고 일부 계산을 거친 결과, 에틴 처리는 처리하지 않은 대조군과 비교하여 살리실산, 모닉산, 그리고 아빅산의 상당한 축적을 유도했음을 확인하였습니다. 각 개별 호르몬에 대한 데이터는 단 한 번의 분석으로 얻었으며, 이는 다중 호르몬 분석을 위한 이 방법의 역량을 보여줍니다. 지금까지 중요한 식물 호르몬 및 기타 신호 전달 화합물을 추출하고 정량화하는 쉽지만 효과적인 절차를 보여드렸습니다.

수행 방법이 간단하며, 앞서 살펴본 대부분의 도구들은 표준 실험실 재료로 쉽게 제작할 수 있습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.