Name: 스트레스 응답하는 동안 식물 호르몬을 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-15T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 배우세요 기상상 추출과 GC/MS를 이용한 식물 호르몬 신속 분석법입니다. 소량 조직에서 여러 호르몬을 동시 정량하여 식물 스트레스 반응 연구에 활용할 수 있습니다.

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<ol><li> 처음에 우리는 추출을위한 2ml 나사 캡 튜브를 준비해야합니다 400ul 추출 버퍼를 추가 (1 - 프로파놀 : H2O : 집중 HCL 2:1:0.002 권 / 권 / 권) 및 해당 내부 표준 10 μl가 (10ng/μl ) 유리병 수 있습니다. 액체 질소로 동결 후 세라믹 비즈를 추가합니다. </li><li> 유리병 여전히 액체 질소에 배치하는 동안 (50 200mg 사이) 식물을 추가합니다. 추가 식물의 무게 추가 처리가 신선한 무게를 기반으로 정확한 부량, 나중에 허용하기 전에 예상되어야합니다. </li><li> 모든 액체 질소가 단단히 마개로 병을를 닫기 전에 증발되어 있는지 확인합니다. 뚜껑이 균질 동안 따라서 용제의 유출하고, 추출한 화합물을 방지하기 위해 고무 도장이 있어야합니다. </li><li> 30 초에 대한 6000의 속도 (Precellys 용)에서 FastPrep 또는 Precellys 비드 분쇄기의 균질 화기의 조직을 균질. </li><li> 개별적으로 균질 화기에서 튜브를 제거 조심스럽게 뚜껑을 열고 각 샘플에 dichloromethane의 1ml를 추가합니다. 닫기 튜브 다시 단단히하고 6000 (Precellys) 10 - 15sec에 다시 균질. </li><li> 테이블탑 원심 분리기에 튜브를 전송하고 60sec에 대한 10.000xg에있는 수성 단계에서 유기농 단계를 구분한다. </li><li> 상 분리 후 깨끗한 4ml 유리관으로 개별 튜브에서 로우어 그린 레이어 (유기 위상, 호르몬 및 내부 표준을 포함​​)을 전송합니다. 물의 양도 (상위 단계)를 피하십시오. 또는 에틸 아세테이트 대신 dichloromethane에 사용할 수 있습니다. 이 경우에는 ethyacetate 단계는 상위 레이어 (녹색)하고 지금은 제거하고 신선한 4ml 유리관으로 전달하는 것이 더 쉽습니다 것입니다. 이전처럼, 물의 이동을하지 마십시오. </li><li> 10-25 분 (샘플에 따라)에 대한 다기관을 통해 공기와 용매를 날려, 샘플이 건조하는 경우 (주의) 한 공기 끝에 문의하십시오. overdry 샘플은하지 마세요,이에 대한 화합물의 손실을 발생할 수 있습니다. </li><li> 샘플 건조되면 우리는 carboxylic의 methylation 산성 함유하는 시료의 성분을 시작할 수 있습니다. 첫째, d​​iethyether / 메탄올 혼합 (9시 1분 권 / 권) 100 μl은 2M trimethylsilyldiazomethane 솔루션 (헥산, 시그마 알드리치 년)의 4μl 다음 각 유리병에 추가됩니다. 튜브는 즉시 테플론 늘어선 실리콘 심장 장착되어 오픈 상단 나사 마개로 닫혀 있습니다. 부드럽게 흔들 25 30 분에 대한 RT에서 알을 품다. </li><li> 9 단계를 마친 후, 원하는 컬렉션 온도에서 가열 블록 설정하고 전원을 켜십시오. methylated 화합물의 휘발성들은 크기뿐만 아니라 = O, - OH, NH 및 같은 다른 더 북극 그룹에 따라 달라집니다. jasmonic 산성과 살리실산의 메틸 에스테르의 회수 온도 80 주변 ° C 충분, 반면에 예를 들어 C18 지방산과 같은 다른 화합물, jasmonic 산성 - 아미노산 conjugates, coronatine, 12 - 옥소 - phytodienoic 산성 메틸 에스테르 사이 온도를 필요로 180-200 ° C 효과적으로 휘발 수 있습니다. </li><li> 30 분 부화 후 methylation 반응은 원치 않는 보조 반응을 피하기 위해 중단해야합니다. 이것은 각 유리병에 2M 초산 - 솔루션 (헥산)을 4 μl를 추가하여 이루어집니다. 모자와 짧은 vortexing으로 튜브를 닫은 후, 샘플은 다른 30 ​​분 대한 부화 사용할 수 있습니다. </li><li> 이 증기 위상 추출에 사용되는 필터는 수작업과 제시 형태로 상업적으로 사용할 수 없습니다. 그들은 한쪽에서 4cm 길이에 대해 잘 맞는 유리 튜브가 삽입되는에 외부 테플론 튜브 (7~8센티미터 길이 약)로 이루어져 있습니다. 그것이 내부 유리관에 도달하고 때까지 테플론 튜브의 반대쪽에있는 스테인레스 스틸 메쉬 디스크가 튜브 안으로 밀려는 것을에 약 20 - 30mg 흡착제 (SuperQ 100분의 80 (단종) 또는 HayeSep ® Q80/100 중) 추가됩니다. 다른 스테인레스 스틸 메쉬 디스크가 삽입되고 마지막으로 유리 팁되므로 신중하게 흡수에 스테인리스 메쉬 디스크를 누르면, 테플론 튜브로 못살게 굴지입니다. 자세한 사진은 필터는 그림 1에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1127/1127fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. </li><li> 11 단계의 배양 시간 동안 따라서 methylated하고, 휘발성 식물 호르몬의 수집에 대한 필터, 200ul의 dichloromethane 각 2 세척 후 메탄올의 첫 200ul를 사용하여 세탁해야합니다. 필터에 남아있는 용매는 다음 공기 날리게됩니다. 필터는 현재 기상 위상 추출을 통해 휘발성 호르몬의 트래핑에 사용될 수 있습니다. </li><li> 부화 후 30 분 4ml 유리 뚜껑의 고무 septa은 메스로 절단됩니다. 청소 필터가 800ml/min 약 흐름 속도로 개별 진공 라인에 연결되어있는 증기 위상 추출하여 식물 호르몬을 수집합니다. 필터는 다음 컷 septa 통해 유리병에 삽입됩니다. 작은 pipet 팁 또한 공기 유입구의 역할을 삽입됩니다. 절차의 초기 부분에서 삽입 필터와 튜브 개최해야후 필터와 또한 GC / MS를 오염시킬 필터 팁, 연락하려 유리병 내부의 액체 중 하나를 피하기 위해 직립 위치에있다. 모든 액체가 필터를 통해 증발 때까지 튜브 그런 다음 수동으로 개최하고 있습니다. 다음 첨부된 필터와 튜브는 가열 블록 및 3min에 대한 수집 열 증발 화합물에 표시됩니다. 시스템뿐만 아니라 설치의 주요 구성 요소는 그림 1에 묘사된 있습니다. 이 마지막 증기 위상 추출 단계 후에도 부착된 필터와 튜브는 랙에 위치하고 진정 사용할 수 있습니다. </li><li> 필터 다시 실내 온도에 도달하면 그들은 삽입과 함께 장착되어 1.5 ML의 GC - 약병에 dichloromethane의 150ml로 eluted 있습니다. 유리병이 뒤덮힌 및 GC / MS로 분석하는 필터에서 남은 용매를 날려 변경할 수 있습니다. </li></ol> 분할 / splitless 인젝터 화학 이온화 모드 (CI)에 운영하는 질량 분석기로 인터페이스 분석을 위해 사용해야합니다 (° C, 사출 볼륨 1μ이 splitless 모드 250))가 장착된 가스 크로마토 그래프. 화합물이 (30m X 0.25mm X 025μm) HP - 1MS 칼럼에서 분리 ° C 주사 후 1min 40에서 개최하고 온도가 15 프로그램되어 ° 헬륨과 함께 250 ° C (10 분)을,에 C / 분 캐리어로 가스 (일정한 흐름 0.7ml/min). MS 기반의 분석을위한 모두,이 quadropole (예 : 애질런트 HP5973)와 이온 트랩 기반 (예 : 베리안 토성 2200) 질량 분석계를 사용할 수 있습니다. CI 가스 중 이소 부탄 (가스 탱크에 제공) 또는 메탄올은 (액체 저수지의 증기를 사용하는)를 사용할 수 있듯이, 그러나 각각의 경우에 이온화 반응의 조각이 선택한 이온 개수 (SIC) 프로그램하기 전에 확인하여야한다 만들어집니다. 우리는 CI의 시약으로 베리안 GC 3900/Saturn MS 2200 시스템과 메탄올에 대한 다음과 같은 프로그램을 사용했을 : 5.00 - 11.30min 이온 (M +1) + 153-158 (메틸 살리실산 153, 메틸 2 H 5 살리실산을); 11.30 - 13.30min 이온 (M +1) + 207-228 (메틸 jasmonate 207과 225, 메틸 dihydrojasmonate 209 및 227), 13.30 - 16.30min 이온 (M +1) + 237-300 (메틸 아브 산 261, 메틸이 H 6 - 아브 산 267 (압시 신산은 주로 [MH 2 O 1] + 이온을 생산하고). 모든 화합물은 본격적인 상용 표준과 비교하여 확인한다. JA, SA 및 ABA의 부량가 정상 영역을 연관하여 이루어집니다 각 내부 표준의 최대 면적 (추출 이온)와 (은 이온을 추출) 또한 사용되는 식물 재료의 신선한 무게에 따라 달라집니다.

<ol><li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Tumlinson, J. H., Alborn, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vapor+phase+extraction+in+metabolic+profiling+of+phytohormones+and+other+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of vapor phase extraction in metabolic profiling of phytohormones and other metabolites.</a> Plant Journal. 39, 790-808 (2004).</li>
<li>Engelberth, J., Alborn, H. T., Schmelz, E. A., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+signals+prime+plants+against+insect+herbivore+attack%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Airborne signals prime plants against insect herbivore attack.</a> PNAS. 101, 1781-1785 (2004).</li>
<li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Alborn, H. T., O&acute, D. onnel, Sammons, P., Toshima, M., H, J. H. T. umlinson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+phytohormones%2C+phytotoxins%2C+and+volatile+organic+compounds+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants.</a> PNAS. 100, 10552-10557 (2003).</li>
<li>Engelberth, J., Schmelz, E. A., Alborn, H., Cardoza, Y. J., Huang, J., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+Jasmonic+acid+and+Salicylic+acid+by+Vapor+Phase+Extraction+and+Gas+Chromatography+-+Chemical+Ionization-Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of Jasmonic acid and Salicylic acid by Vapor Phase Extraction and Gas Chromatography - Chemical Ionization-Mass Spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 312, 242-250 (2003).</li>
</ol>

방법은 크기와 화합물의 화학적 특성이 추출 methylated, 그리고 증발되지 않도록하지 않습니다 제공하는 식물 신호 화합물의 다양한위한 안정적으로 작동하도록 입증되었습니다 여기를 발표했다. 또한, 그것이 본 설명으로 methylation 절차는 derivati​​zation의 유일한 방법은 아니다. Silyllation 및 아세틸화 대체 방법과 프로토콜을하는 것은 쉽게 온라인으로 찾을 수 있습니다. 질량 분석계는 과정에서 너무 많은 불필요한 이온을 제외하도록 실행하는 동안 기록됩니다 제한해야하는 대량 범위를 모니터링 단일 이온이 가능하지 않은 경우. 예를 들어, jasmonic 산성 (JA)과 내부 표준 dihydro jasmonic 산성 (dhJA)는 크게 두 (M +1) + 이온, 207과 225 JA, 그리고 209과 메탄올과 화학 이온화 동안 dhJA에 대한 227을 생산합니다. 이 두 주요 (M +1) + 대중이 (207과 ...

스트레스 응답하는 동안 식물 호르몬을 모니터링

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

식물 호르몬 및 관련 신호 화합물은 다양한 환​​경 자극과 스트레스에 식물 반응의 조절에 중요​​한 역할을한다. 가장 심각한 스트레스 중 곤충 herbivory, 병원체 감염과 가뭄 스트레스 있습니다. 이러한 각함으로써 식물의 생존을 보장 그것의 조정 반응하는 것으로 알려져 있습니다 특정 호르몬의 설정 및 / 또는 조합을 강조하십시오. 이러한 반응의 규정에 관련된 주요 호르몬은 jasmonic 산성 (JA), 살리실산 (SA), 그리고 아브 산성 (ABA)입니다. 더 시간적뿐만 아니라 공간적 패션 그들의 풍부한 변화를 모니터링하는 개인 호르몬뿐만 아니라 그것이 필요합니다 이러한 반응 중에 잠재적인 상호 작용의 역할을 이해한다. 이러한 다른 신호 화합물의 쉬운 민감한 및 재현성 부량 위해 우리는 증기 위상 추출 및 가스 크로마 토그래피 / 질량 분석계 (GC / MS) 분석 (1, 2, 3, 4)에 따라 방법을 개발했습니다. 산성 수성하여 식물 조직에서 이러한 화합물을 추출 후 1 프로파놀는 dichloromethane와 혼합 카르복실산 함유 화합물은, methylated 열 아래 volatilized 및 고분자 흡착제에서 수집하고 있습니다. 샘플 약병에 용출 후 analytes는 가스 크로마 토그래피로 구분되며 화학적 이온화 질량 분광법에 의해 감지. 적절한 내부 표준의 사용은 다음 analyte 및 내부 표준의 최대 영역을 관련된하여 간단한 부량 수 있도록합니다.

간단한 방법이 작은 조직 샘플에서 여러 식물 호르몬의 급격한 추출 및 분석을위한 허용 제공됩니다. 절차는 엄숙한 정화 단계로 증기 위상 추출을 사용합니다. 샘플은 GC / 주로 생산하는 화학 이온화 (M +1)과 MS + 이온에 의해 분석됩니다.

식물 호르몬과 관련 신호 화합물은 다양한 환경 자극 및 스트레스에 대한 식물의 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다.

이 절차는 세라믹 비드를 사용하여 식물 시료를 균질화하고, 이어서 디클로로메탄 추출을 통해 유기상을 얻는 것으로 시작합니다. 원심분리 후 시료를 공기 중에서 건조시키고 기상 추출을 위해 준비합니다. 기상 추출 필터에서 용출시킨 후, 질량 분석법과 가스 크로마토그래피를 이용하여 식물 호르몬 분석을 진행할 수 있습니다.안녕하세요, 저는 이곳 샌안토니오의 텍사스 대학교 생물학과 내 JU Engelberg Lab의 Marie Engelberg입니다. 그리고 저는 Ju Engelberg입니다. 오늘은 중요한 식물 호르몬들을 동시에 정량 분석하는 간단한 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 곤충 반응 실험 중인 식물에서 이러한 호르몬의 변화를 모니터링하기 위해 이 방법을 일상적으로 사용하고 있습니다.지방산 조성의 변화 또한 모니터링할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다. 추출을 위해 먼저 2 mL 스크류 캡 바이알 두 개를 준비하십시오.이를 위해, 바이알에 400 µL의 추출 용액과 10 ng/µL 농도의 각 내부 표준 물질 10 µL를 첨가합니다. 다음으로, 바이알을 액체 질소에 넣어 동결시킵니다. 동결 후, 바이알에 세라믹 비즈를 첨가합니다.바이알이 액체 질소에 놓여 있는 동안, 50에서 200 mg 사이의 식물 재료를 첨가합니다. 나중에 생체중(fresh weight)을 기준으로 정확한 정량을 수행할 수 있도록, 추가한 식물 재료의 무게를 후속 처리 전에 추정해야 함을 유의하십시오. 바이알 캡을 단단히 닫기 전에 모든 액체 질소가 증발했는지 확인하십시오.균질화 과정 중 용매와 추출 화합물이 쏟아지는 것을 방지하기 위해 캡에 고무 씰이 있는지 확인하십시오. Fast Prep 또는 PSU 비드 그라인더를 사용하여 조직을 균질화하십시오. PSU의 경우 6,000의 속도로 30초 동안 균질화하십시오.균질화가 완료되면 균질기에서 바이알을 개별적으로 꺼내고, 캡을 조심스럽게 열어 각 샘플에 1 mL의 di chloral methane을 첨가합니다. 바이알을 다시 단단히 닫고 6,000에서 10~15초 동안 균질화합니다. 균질화 후, 바이알을 탁상 원심분리기로 옮겨 10,000 ×g에서 60초 동안 원심분리하여 유기층과 수층을 분리합니다. 층 분리가 완료되면, 개별 바이알에서 아래쪽의 녹색 층을 깨끗한 4 mL 유리 바이알로 옮깁니다.이것은 호르몬과 내부 표준 물질을 포함하는 유기상입니다. 물이나 상층액이 옮겨지지 않도록 주의하며, 매니폴드를 통해 공기로 약 10~25분 동안 용매를 날려 보냅니다. 소요 시간은 시료에 따라 달라집니다.단일 에어플로우 팁을 사용하여 시료가 건조되었는지 주의 깊게 확인하십시오. 과도하게 건조할 경우 화합물이 손실될 수 있으므로 주의하시기 바랍니다. 시료가 건조되면, 시료 내의 카복실산 함유 화합물의 메틸화를 시작할 수 있습니다.먼저, 각 바이알에 9:1 부피비의 디에틸 에테르-메탄올 혼합물 100 µL를 넣습니다. 다음으로, 헥산에 녹인 2 M trimethylsilyldiazomethane 용액 4 µL를 첨가합니다. 테플론 라이닝 실리콘 격막이 장착된 오픈톱 스크류 캡으로 바이알을 즉시 닫고, 바이알을 가볍게 흔든 후 실온에서 25~30분 동안 배양합니다.가열 블록을 켜고 원하는 수집 온도로 설정하십시오. 메틸화된 화합물의 휘발성은 그 크기와 극성 그룹의 수에 따라 달라집니다. 온도는 80에서 200°C 사이로 설정할 수 있습니다. 30분간 배양한 후, 각 바이알에 2 M 아세트산 헥산 용액 4 µL를 첨가하여 메틸화 반응을 중단시키십시오.이는 원치 않는 부반응을 방지하기 위해 수행됩니다. 기상 추출(vapor phase extraction)에 사용되는 필터는 수작업으로 제작됩니다. 이 필터들은 테플론 튜브로 만들어집니다.한쪽에서 약 4cm 길이의 알맞게 맞는 유리관을 삽입합니다. 약 20~30mg의 흡착제가 담긴 두 개의 스테인리스 스틸 메쉬 디스크를 확인할 수 있습니다. 메틸화 및 휘발성 식물 호르몬 수집에 사용할 필터를 200µL의 메탄올로 세척하십시오.다음으로, 필터를 200 µL의 디클로로메탄으로 두 번 세척합니다. 각 필터에서 남은 용매가 공기 중으로 완전히 건조되도록 합니다. 이제 이 필터들을 기상 추출을 통한 휘발성 호르몬 포집에 사용할 수 있습니다.시료를 30분 동안 배양한 후, 4mL 바이알 캡의 고무 격막을 메스로 절개합니다. 이제 기상 추출법을 통해 식물 호르몬을 수집하기 위해 추출된 물질을 회수할 준비가 되었습니다. 세척된 필터를 분당 약 800mL의 유속으로 개별 진공 라인에 연결합니다.그 다음, 절개된 격막을 통해 필터를 바이알에 삽입합니다. 공기 유입구 역할을 할 작은 피펫 팁도 함께 삽입합니다. 절차의 이 초기 단계 동안에는 바이알 내부의 액체가 필터 팁에 닿아 필터를 오염시키는 것을 방지하기 위해, 필터가 삽입된 바이알을 수직으로 세운 상태로 유지해야 합니다.그 후, 모든 액체가 필터를 통해 증발할 때까지 GCMS 바이알을 손으로 잡고 유지합니다. 그런 다음 필터가 부착된 바이알을 가열 블록 위에 올리고, 가열 증발된 화합물을 3분 동안 수집합니다. 이 마지막 증기상 추출 단계가 끝나면, 필터가 부착된 상태의 바이알을 랙에 놓고 식힙니다.필터가 실온에 도달하면 인서트가 장착된 1.5 milliliter GC 바이알을 준비합니다. 다시 150 microliters의 di chloral methane이 담긴 루프를 바이알에 넣습니다. 필터에서 남은 용매를 불어낸 후, 바이알의 캡을 닫고 가스 크로마토그래피 질량 분석법으로 분석할 수 있습니다.분석을 위해 split/splitless 인젝터가 장착되고 화학적 이온화 모드로 작동하는 질량 분석계와 연결된 가스 크로마토그래프를 사용하며, 주입된 화합물은 40 °C에서 1분간 유지된 HP-1 MS 컬럼에서 분리됩니다. 온도는 헬륨을 운반 가스로 하여 0.7 mL/min의 일정한 유량으로 분당 15 °C씩 250 °C까지 승온시킨 후 10분간 유지하도록 프로그래밍합니다. MS 기반 분석을 위해 쿼드러폴 및 이온 트랩 기반 질량 분석계 모두 CI 가스로 사용할 수 있습니다.이소부탄 또는 메탄올 중 어느 것을 사용해도 무방합니다. 다만, 각 경우 모두 선택한 이온 카운팅 프로그램을 작성하기 전에 이온화 반응의 파편들을 확인해야 합니다. 본 실험에서는 Saturn MS 2200 질량 분석기가 연결된 variant GC 3, 900 가스 크로마토그래피 시스템을 사용하였으며, CI 시약으로 메탄올을 사용하였습니다.프로그램에 대한 설명은 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다. 모든 화합물은 시판되는 표준품과의 비교를 통해 확인해야 합니다. JA SA 및 A BA의 정량은 추출된 이온의 피크 면적을 각 내부 표준물질의 추출 이온 피크 면적과 상관 분석하여 수행하며, 사용된 식물 재료의 생체중을 기준으로 합니다.GCM S 파일에서 데이터를 추출하고 일부 계산을 거친 결과, 에틴 처리는 처리하지 않은 대조군과 비교하여 살리실산, 모닉산, 그리고 아빅산의 상당한 축적을 유도했음을 확인하였습니다. 각 개별 호르몬에 대한 데이터는 단 한 번의 분석으로 얻었으며, 이는 다중 호르몬 분석을 위한 이 방법의 역량을 보여줍니다. 지금까지 중요한 식물 호르몬 및 기타 신호 전달 화합물을 추출하고 정량화하는 쉽지만 효과적인 절차를 보여드렸습니다.수행 방법이 간단하며, 앞서 살펴본 대부분의 도구들은 표준 실험실 재료로 쉽게 제작할 수 있습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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