Myogenic 엔지니어링된 조직 구조의 제작

이 절차는 신생아 Lewis Wraths로부터 골격근 조직을 채취하는 것으로 시작합니다. 이 조직으로부터 근아세포를 분리합니다. 이 근아세포를 조직 배양 접시에서 2일 동안 배양한 후, 회수하여 콜라겐 기반의 조직 구성 혼합물에 섞습니다.

이 혼합물을 배양액에 잠긴 몰드에 조심스럽게 피펫팅하고 37 °C에서 배양합니다. 안녕하세요, 저는 보스턴 어린이 병원 및 하버드 의과대학 마취과학과의 Douglas Cowan 연구실 소속 Christina Pesach입니다. 오늘은 근원성 공학 조직을 제작하는 절차를 보여드리겠습니다.

본 절차를 통해 심장에 삽입할 공학적 조직을 제작합니다. 우리의 목표는 완전 심장 차단증이 있는 어린이의 심박 조율기 삽입술을 대체하는 치료법으로서 심장의 상심실과 하심실 사이에 전기적 연결을 생성하는 것입니다. 이제 시작하겠습니다.

본 구조물에서 주형(casting mold)은 수술로 이식 가능한 콜라겐 기반 조직 구조물의 형태를 잡는 데 사용됩니다. 이 비디오에서는 골격근모세포(skeletal myoblasts)를 포함하는 공학적 조직 구조물을 제작하는 과정이 설명되어 있습니다. 또한 본 프로토콜로 제작된 세포화된 조직의 심장 내 이식 과정이 시연됩니다.

조직 몰드는 조직이 설계된 대상 심장의 생리적 요구 사항을 충족하기 위해 거의 모든 형태나 크기로 제작될 수 있습니다. 본 시연에서는 성체 쥐 심장의 AV groove에 맞게 절단할 수 있는 조직 조각을 형성하는 몰드를 제작합니다. 면도날을 사용하여 실리콘 튜브를 3 cm 길이의 조각으로 자른 다음, 각 조각을 길이 방향으로 이등분하여 몰드 제작을 시작하십시오.

폴리에스테르 메쉬를 작게 자릅니다. 그다음 튜브의 맨 끝 안쪽에 임플란트 등급 RTV 실리콘 접착제를 한 방울 도포합니다. 접착제는 배양 세포에 어느 정도 독성이 있으므로 도포량을 최소한으로 유지하십시오.

폴리에스테르 메쉬 조각을 실리콘 접착제 방울 위에 빠르게 올린 후 튜브의 끝부분과 정렬합니다. 이렇게 하면 구성물을 부착할 수 있도록 약간 솟아오른 평평한 표면이 형성됩니다. 튜브의 반대쪽 끝부분에 대해서도 동일한 과정을 반복합니다.

금형을 상온에서 3일 동안 건조하십시오. 금형은 기본적으로 일회용이므로 한 번에 20~30개를 제작하는 것이 효율적입니다. 접착제가 완전히 마르면 금형을 멸균하기 위해 필요한 시점까지 70% ethanol이 채워진 용기에 보관하십시오.

다음으로, 세포 분리를 준비하기 위해 필요한 모든 용액이 사용 가능한 상태인지 확인하십시오. 항생제와 항진균제가 포함된 0.2 micron 여과 멸균 PBS 250 milliliters에 laminin 1 milligram을 넣어 희석된 laminin 용액을 조제하십시오.

다음으로 150 millimeter 조직 배양 플레이트에 희석된 라미닌 용액 4 milliliters를 코팅하고, 사용 전 37 °C에서 최소 4시간 동안 배양합니다. 또한 근모세포 배지와 골격근 소화 용액이라는 두 가지 다른 용액도 준비해야 합니다.

제조법은 프로토콜의 텍스트 부분을 참조하십시오. 10 mL 주사기에 장착된 0.2 micron 필터 디스크를 사용하여 소화 완충액(digestion buffer)을 여과 멸균하십시오. 소화 완충액은 소분하여 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

Lewis 랫 한 배자당 5 mL의 소화 버퍼가 필요할 것으로 예상하십시오. 필요한 양의 조직 소화 버퍼와 10 mL의 근모세포 배지를 37°C에서 배양하십시오. 그 다음 새끼 랫의 해부를 진행하십시오.

먼저, 핀셋과 소형 가위를 사용하여 희생된 신생 Lewis 쥐의 한 배(litter) 이상을 확보합니다. 죽은 신생 Lewis 쥐의 등 쪽을 따라 척수 방향으로 절개하고 피부와 근막 층을 벗겨낸 후 근육을 절제하여 척추 주변 근육을 제거합니다. 절제한 근육을 1X HBSS 40 mL가 채워진 50 mL 원심분리관(conical tube)에 넣고 얼음에 보관합니다.

근육 조각들이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 후, 배양 접시 내에서 멸균 파스퇴르 피펫(pasture pipette)과 진공 흡입 장치를 사용하여 액체와 혈액 잔해의 대부분을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 수확한 근육 조각들을 150mm 배양 접시에 붓고 남은 액체를 최대한 흡입하여 제거합니다. 단면 면도날 두 개를 사용하여 조직을 걸쭉한 페이스트 상태가 될 때까지 잘게 다집니다.

근육 페이스트는 미리 가온된 소화 용액에서 소화됩니다. 소화 용액의 일부를 근육 페이스트 위에 붓고, 용액과 근육 페이스트 혼합물을 새 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 3 liter Lewis Rats의 근육을 효율적으로 소화시키기 위해 일반적으로 10 milliliter 피펫을 사용하여 10 to 15 milliliter의 용액을 사용합니다.

튜브를 로킹 플랫폼(rocking platform) 위에 놓고 37 °C에서 약 30분 동안 소화시킵니다. 효소 소화 과정 동안, 기포가 생기지 않도록 조직을 가끔씩 흔들어 줍니다. 무선 피펫에 10 mL 피펫 팁을 장착하여 사용합니다.

근육 조직이 액상화되면 70 micron 셀 스트레이너로 용액을 거릅니다. 그다음 여과된 세포를 실온에서 600 G로 10분 동안 원심분리하고, 파스퇴르 피펫과 흡입기를 사용하여 액체를 최대한 제거한 뒤 10 milliliters의 따뜻한 myoblast medium으로 펠릿을 재현탁합니다. 섬유아세포는 근아세포보다 부착 속도가 빠르므로, 이를 제거하기 위해 코팅되지 않은 150 millimeter 조직 배양 플레이트에서 세포를 15분 동안 사전 부착시킵니다.

플레이트를 37°C, 5% 이산화탄소 조건의 습윤 배양기에 넣습니다. 배양기에서 플레이트를 꺼내어 Lamin 코팅 배양 용기에 아직 부착되지 않은 세포들을 옮깁니다. 이를 근아세포 배지로 희석하여 쥐 새끼 1~2마리당 플레이트 1개가 되도록 준비합니다.

세포를 너무 조밀하게 도말하면 근관으로 분화됩니다. 마지막으로, 37°C, 5% carbon dioxide의 습윤한 조건에서 세포를 배양하십시오. 1~2일간 배양한 후, 세포를 조직 구조체로 캐스팅할 준비가 완료됩니다.

1~2일간 배양한 후, 150 mm 근아세포 조직 배양 플레이트 4개를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 48시간 이상 대기하지 마십시오. 그렇지 않으면 섬유아세포가 근아세포 집단을 압도하게 됩니다. 세포로부터 배지를 흡인하여 제거합니다.

그다음 37°C로 데운 XPBS로 세포를 두 번 헹구어 플레이트에서 근모세포를 떼어내고, 각 플레이트에 데워진 0.05% tryin EDTA 용액 4 mL를 넣은 후 플레이트를 인큐베이터에 5분 동안 다시 넣습니다. 배양 후드 내에서 근모세포를 회수하고 액체를 50 mL 튜브에 수집합니다. 근모세포 배지 10 mL를 사용하여 모든 플레이트를 헹구고, 이를 원심분리 튜브에 담긴 세포와 합칩니다.

상온에서 600 G로 10분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛화하고, 상층액을 가능한 한 많이 흡입하여 제거합니다. 이제 근아세포를 1.4 milliliters의 근아세포 배지에 다시 현탁하고 얼음 위에 둡니다. 핀셋을 사용하여 에탄올 배스에서 구조체 몰드를 조심스럽게 꺼내고, XPBS에 두 번 담가 헹굽니다. 6-웰 조직 배양 플레이트의 빈 웰에 몰드를 넣기 전에 파스퇴르 피펫으로 PBS 흔적을 모두 흡입하여 제거합니다.

이 단계에서 용액을 조제해야 합니다. 다음 시약들을 얼음 위에 준비하십시오. 10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin.

제1형 콜라겐 세포를 근아세포 배지, 중탄산나트륨 및 겔에 재현탁합니다. 서면 프로토콜에 따라 시약들을 혼합합니다. 혼합물을 20초 동안 볼텍싱하면 분홍색으로 변합니다.

시판되는 1형 콜라겐의 종류에 따라 혼합, 응고 및 최종 생성물의 일관성에 미치는 영향이 다를 수 있음에 유의하십시오. 용액 내의 기포를 제거하기 위해 튜브를 아이스 버킷에 몇 분 동안 다시 넣어 두십시오.

1형 콜라겐은 조사(irradiation)되지 않아야 하며, 그렇지 않으면 젤화되지 않습니다. 여기서는 돼지 피부에서 유래한 제품을 사용합니다. 혼합물이 굳기 전에 배양 플레이트의 몰드에 혼합물을 조심스럽게 붓습니다.

각 몰드에는 약 1 mL의 점성 액체를 채웁니다. 이 과정에서 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 구조체 몰드가 담긴 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 조심스럽게 옮깁니다.

혼합물이 응고되면서 색상이 진한 분홍색에서 연한 분홍색으로 변하며 몰드가 굳어집니다. 근아세포 배지를 37 °C로 예열하십시오. 약 30분간 배양한 후, 각 조직 구조체를 예열된 근아세포 배지에 조심스럽게 담그고 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 본 프로토콜을 적절히 수행하면, 근아세포를 포함한 조직 구조체가 체내 이식 또는 추가 분석을 위해 준비됩니다.

이틀간의 배양 후, 지금까지 근원성 조직 공학 구조물을 제작하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 조기 응고를 방지하기 위해 구조물 용액에 필요한 모든 시약을 얼음 위에 보관해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.