Name: Myogenic 엔지니어링된 조직 구조의 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: 학습하세요 골격근 성근아세포를 이용한 교원 기반 심장 조직 공학 구조물 제작 방법을. 이 기술은 심장 전도 장애 치료를 위한 생체 내 조직 복구에 활용됩니다.

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, 쓰래서 연구 기금에서 새 연구원 수상하고, 어린이 병원 보스턴에서 심장 전도 기금에 기부,이 작품은 국립 보건원에서 연구 기금 (HL088206 HL068915)에 의해 지원됩니다.

1 부 : 주조 금형을 구축 조립 <ol><li> 실리콘 튜브 (VWR)를 이등분하고 3cm 길이 조각으로 그것을 잘라 면도날을 사용합니다. </li><li> 튜브의 각 끝 안쪽에 이식 등급 RTV 실리콘 접착제 (Rhodia)의 한 방울을 넣으십시오. </li><li> 빨리 실리콘 접착제 드롭에 폴리에스터 메쉬의 작은 조각 (1cm X 1cm) (맥매스터 - 카)를 장소와 튜브의 끝 부분으로 맞춥니다. 이것은 건설 첨부 파일 약간 제기하고 평평한 표면을 제공합니다. 다른 쪽 끝을 위해 반복합니다. </li><li> 금형 3 일 동안 실온에서 건조하도록 허용합니다. 이들은 본질적으로 일회용 있으므로 한 번에 20-30 금형을 만들기 위해 도움이 그것입니다. </li><li> 접착제가 완전히 건조되면 그들이 필요 때까지, 70 % 에탄올로 가득 비커 이러한 금형을 저장합니다. 이 단계는 금형을 소독 도움이 될 것입니다 그리고 완성된 제품은 그림 1에 표시됩니다. </li></ol> 2 부 : myoblast 세포 격리를위한 준비 <ol><li> 250 1 MG Laminin (시그마)를 희석 ML 0.22 μm의 필터 - 멸균 인산 버퍼 호수 (PBS)가 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Invitrogen)과 1 %의 Fungizone (Invitrogen)를 포함. </li><li> 4 단계 1.1에서 희석 Laminin 솔루션의 ML과 기본 골격 myoblasts을 도금 전 최소한 4 시간 동안 37 º C에서 부화와 코트 150mm 조직 문화 플레이트 (BD 팔콘). </li><li> (20 % FBS (아틀란타 체액), 5 NG / L 기본 Fibroblast의 성장 인자 (Promega), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Invitrogen), 그리고 1 %의 Fungizone와 햄의 F - 10 영양소 혼합 (시그마)를 혼합하여 myoblast 미디어 만들기 Invitrogen). </li><li> 100 ML 2.4 U / ML Dispase - 2 (로체)에서 ~ 295 U / MG Collagenase 2 (워싱턴)의 1g을 해소하여 골격 근육 소화 솔루션을 준비합니다. 0.037 g CaCl 2를 추가하고 잘 섞는다. -20 ° C.에 10 ML 주사기 및 매장 aliquots에 장착되어 0.2 μm의 필터 디스크를 사용하여 소화 버퍼를 검사 필터 ° C myoblast 미디어와 함께 37 조직 소화에 필요한 금액을 넣으십시오. </li></ol> 파트 3 : 골격근에서 Myoblast 절연 <ol><li> 포셉 작은 가위를 사용하여, 척수를 따라 다시 아래로 깔끔히 피부와 근막의 레이어를 다시 필링 후 근육을 절개하여 죽은 신생아 루이스 쥐에서 paraspinal 근육을 제거합니다. </li><li> 조직 문화 후드에서 얼음 1X 행크스 밸런스드 소금 솔루션의 40 ML (HBSS) (Invitrogen)로 가득 50 ML 원뿔 튜브 (BD 팔콘)에 excised 근육을 놓으십시오. 근육 스트립​​은 튜브의 바닥에 정착 조심스럽게 문화 후드 (베이커)에 살균 파스퇴르 피펫과 진공 흡입하여 액체와 혈액 잔존물의 대부분을 제거할 수 있습니다. </li><li> 150mm 문화 요리에 수확 근육 조각을 붓고 및 흡입과 가능한 한 남은 액체의 많은를 제거합니다. 2 개의 싱글 - 양날 면도날을 사용하면 두꺼운 붙여 조직을 말하다. 붙여넣기 사전 예열 소화 솔루션을 붓고와 10 ML의 피펫을 사용하여 새로운 50 ML 튜브에 혼합을 전송하기만하면됩니다. 효소 소화하는 동안 조직은 때때로 피펫 - 에이드 (드루먼드) 무선에 설치되어 10 ML의 피펫과 (버블링 제외) triturated입니다. 다시 말하지만, 조직이 여분의 액체를 해결하고 제거할 수 있습니다. </li><li> 락을 플랫폼에서 튜브를 삽입하고 약 30 분 37 º C에서 소화. </li><li> 근육이 액화되면 600 XG (베크맨 GP) 10 분 실온에서 70 μm의 셀 스트레이너 (BD 팔콘)와 원심 분리기를 통해 솔루션을 전달합니다. 파스퇴르 피펫과 흡입으로 많은 액체가 가능한 제거하고 따뜻한 myoblast 매체 10 ML와 펠렛을 resuspend. </li><li> 사전 플레이트 15 분 uncoated 150mm 조직 문화 판에있는 세포는 섬유아 세포를 제거하는 데 도움. </li><li> 아직 laminin - 코팅 cultureware에 연결된 모든 1-2 쥐 새끼 한 접시가 너무 희석하지 않은 세포를 전송합니다. 37 ° C와 5 % CO 2에서 humidified 보육 세트에서 접시를 놓습니다. </li></ol> 4 부 : 주조 설계 조직 구조 (5 ML) <ol><li> 1-2일 후, 인큐베이터에서 150mm의 myoblast 조직 문화 접시 10을 제거 37 ° C 1X PBS로 두 번 그들을 씻어하고 각 플레이트에 따뜻한 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 ML를 추가합니다. 5 분 인큐베이터에 번호판을 반환합니다. </li><li> 문화 후드에있는 접시에서 분리 myoblasts을 수확하고 50 ML 튜브에 액체 (BD 팔콘)를 수집합니다. 접시를 모두 씻어 원심 튜브에 세포와 이것을 결합하는 myoblast 매체 10 ML을 사용합니다. 펠렛은 600 XG (베크맨 GP) 10 분 상온에서 세포 단계 3.5에서 설명한대로 초과하는 액체를 제거합니다. </li><li> 얼음 myoblast 매체와 장소의 1.6 ML에 myoblast 세포를 Resuspend. </li><li> 포셉를 사용하면, 신중하게 단계를 1.5에서 4 구조 금형을 제거하고 1X PBS로 두 번 그들을 씻어. 6 잘 조직 세제곱의 각 금형을 삽입하기 전에 파스퇴르 피펫과 함께 PBS의 모든 흔적에서 진공 흡입lture 플레이트 (BD 팔콘). </li><li> 얼음 구축 준비에 필요한 다른 시약을 (10X 햄의 F10, 항생제, 1을 입력 콜라겐 [3.9 MG / ML] [6]과 Matrigel ™) 모아서 37 º C.에 myoblast 미디어를 유지 500 μL 10X 햄의 F10, 100 μL 페니실린 / 스트렙토 마이신, 100 μL Fungizone, 1.6 ML의 콜라겐 및 15 ML 원뿔 관에 750 μL Matrigel ™를. 결합 10 초가 얼음위에 10로 설정 미니 Vortexer (VWR)과 장소를 사용하기위한 솔루션을 섞는다. </li><li> 다음 단계를 3.5에서 혼합 80 NaHCO 3 μL와 단계 3.3 myoblast 서스펜션을 추가합니다. 10 초에 대한 소용돌이 전체 혼합물과 거품의 솔루션을 취소하고 몇 분 얼음 양동이에 튜브를 반환합니다. </li><li> 그것이 10 ML의 피펫을 사용하여 응고하기 시작하기 전에 금형에 혼합물을 조심스럽게을 캐스팅. 각각의 금형은 점성 액체의 약 1 ML를 개최합니다. 이 절차를 수행하는 동안 공기 방울을 도입 피하기 위해보십시오. </li><li> 인큐베이터에 캐스트 구조가 들어있는 접시를 주의깊게 전송합니다. ~ 30 분 후 인큐베이터에서 확정 구성을 제거하고 조심스럽게 조직 구성 충당하기 위해 각 잘하는 myoblast 매체를 추가합니다. 인큐베이터 (그림 2)에 접시를 반환합니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 이 프로토콜이 제대로 실행되면 myoblast 함유 조직 구조는 생체내 주입에 대한 준비가되어 (몰드에서 제거되면 IE) 또는 2 일 후 체외 분석에서 추가하십시오. <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure1.jpg" alt="" /> 완료 금형 구조 그림 1. 예 (단계 1.5 참조). <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure2.jpg" alt="" width="400" height="321" /> 그림 2. 확정 myoblast 함유 조직 [1]을 구축. <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure3.jpg" alt="" /> 그림 3. myoblast 함유 조직의 H &amp; E 스테인드 섹션 구성. &quot;A&quot;는 세로 부분을 묘사하고 &quot;B&quot;는 단면을 보여줍니다.

<ol><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Blau, H. M., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human muscle cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).</li>
<li>Powell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+human+bioartificial+muscles+expressing+a+foreign+recombinant+protein+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).</li>
<li>Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Gallop, P. M., Seifter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Properties+of+Soluble+Collagens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Properties of Soluble Collagens.</a> Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).</li>
</ol>

동물 실험은 어린이 병원 보스톤에있는 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

조직 구조가 캐스팅 될있는 금형은 어떤 모양과 크기로 만들 수 있지만, 첨부 파일이 최소한 두 지점이있을 필요합니다. 그렇지 않으면, 매트릭스 및 세포는 구형 구조를 형성하고 세포는 죽지. 현재 프로토콜에서, 우리는이 목적을 위해 폴리에스터 메쉬의 사용을 설명, 아직 우리는 성공적으로 스테인리스 메쉬를 사용했습니다. 물론, 큰 금형보다 세포와 다른 재료의 더 큰 볼륨을 요구​​할 것입니다. 금형을 만들 때 사용하는 실리콘 접착제의 양을 최소화하고이 튜브의 맨 끝에 위치하고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 접착제 근처 myoblasts도 치료의 몇 일 후에, 실용적 수없는 경향이 있기 때문입니다. 또한, 그것은 오염 섬유아 세포 빠르게 증식하고 결국 문화의 myogenic 구성 요소를 압도하므로 조직의 구조를 준비하기 전에 단 하루 두 판 myoblasts를 신중하게합니다. 서로 접촉 세포 융합 및 myotubes로 차별하기 시작되므로 마찬가지로, myoblasts는 밀도가 도금해서는 안됩니다. 조직 구조의 제조에 관해서는, ...

<table><tbody><tr><td>실리콘 튜브</td><td>VWR international</td><td>60985-724</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 접착제</td><td>Rhodia Silicones</td><td>MED ADH 4300 RTV</td><td></td></tr><tr><td>폴리에스테르 메쉬</td><td>McMaster-Carr</td><td>93185T17</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Mixture F-10 HAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6908</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Dispase-2</td><td>Roche Group</td><td>10295825001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>46H8863</td><td></td></tr><tr><td>염기성 섬유아세포 성장인자</td><td>Promega Corp.</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 조직 배양 접시</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>0.05% (1X) Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>1X Hanks Balanced Salt Solution</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>7.5% NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 세포 스트레이너</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m 필터</td><td>Nalge Nunc international</td><td>194-2520</td><td></td></tr></tbody></table>

myogenic 엔지니어링된 조직 구조의 제작

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

전자 맥박 조정기가있다는 사실에도 불구하고 생명을 구하는 의료 기기, 소아 환자에서 장기적인 성능이 아이의 작은 크기와 자신의 피할 수없는 성장에 의해 부과된 제한 문제 때문에 수 있습니다. 따라서 심장 리듬 장애와 소아 환자를 위해 특별히 설계된 혁신적인 치료법에 대한 진정한 필요가있다. 우리는 그 제안이 들어있는 콜라겐 기반 매트릭스로 구성된 전도성 생물 학적 대체 세포가 더 나은 성장에 적응 반복 수술의 필요성을 절감하며 크게 다음과 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 autologously - 파생. 현재 연구에서 우리는 패션에 히드로겔 매트릭스 내에있는 마음의 상단과 하단 회의소 사이 전선관 될 것입니다 수술 - implantable 조직 구조를 기본 골격 myoblast 세포 문화를 통합을위한 절차를 설명합니다. 궁극적으로, 우리는 완전한 심장 블록과 어린이 방실 전기 전도를 복원할 수 있도록 설계 조직의이 유형을 사용하여 기대하고 있습니다. 그런 관점에서, 우리는 신생아 루이스 쥐 및 플레이트 그 규칙을 수정한 버전을 사용 laminin - 코팅 조직 문화 요리에의 골격 근육에서 myoblasts을 분리<sup&gt; [2, 3]</sup&gt;. 1~2일 후, 교양 세포는 항생제로 1을 입력 콜라겐, Matrigel ™, NaHCO를 수집하고 혼합<sub&gt; 3</sub&gt;. 그 결과 거의 모든 모양과 크기의 몰드로 주조 수있는 점성, 균일한 솔루션입니다<sup&gt; [1, 4, 5]</sup&gt;. 우리의 조직​​ 구조에 대한, 우리는 표준 절차를 사용하여 태아의 양고기 피부에서 분리된 제 1 형 콜라겐을 채용<sup&gt; [6]</sup&gt;. 일단 조직이 37 확정했다 ° 구조가 변할 때까지 C는, 문화, 미디어 조심스럽게 판에 추가됩니다. 설계 조직은 다음이 준비되는 시점에서 2 일간 더 탈수를 통해 더욱 응축 수 있습니다<em&gt; 체외에서</em&gt; 평가 또는 외과 - 이식.

여기, 우리는 콜라겐 기반 조직 골격 myoblasts를 포함하는 구성의 제조를 보여줍니다. 이러한 3 - D 설계 구조는 조직을 바꾸거나 수리하는 데 사용할 수 있습니다<em&gt; 생체내에</em&gt;. 우리 목적을 위해서도, 우리는 완전한 심장 블록의 수리를 위해 방실 전선관 이러한 디자인이<sup&gt; [1]</sup&gt;.

Myogenic 엔지니어링된 조직 구조의 제작

전자 페이스메이커가 생명을 구하는 의료 기기임에도 불구하고, 소아 환자에서의 장기적인 성능은 ...로 인해 문제가 될 수 있습니다.

이 절차는 신생아 Lewis Wraths로부터 골격근 조직을 채취하는 것으로 시작합니다. 이 조직으로부터 근아세포를 분리합니다. 이 근아세포를 조직 배양 접시에서 2일 동안 배양한 후, 회수하여 콜라겐 기반의 조직 구성 혼합물에 섞습니다.이 혼합물을 배양액에 잠긴 몰드에 조심스럽게 피펫팅하고 37 °C에서 배양합니다. 안녕하세요, 저는 보스턴 어린이 병원 및 하버드 의과대학 마취과학과의 Douglas Cowan 연구실 소속 Christina Pesach입니다. 오늘은 근원성 공학 조직을 제작하는 절차를 보여드리겠습니다.본 절차를 통해 심장에 삽입할 공학적 조직을 제작합니다. 우리의 목표는 완전 심장 차단증이 있는 어린이의 심박 조율기 삽입술을 대체하는 치료법으로서 심장의 상심실과 하심실 사이에 전기적 연결을 생성하는 것입니다. 이제 시작하겠습니다.본 구조물에서 주형(casting mold)은 수술로 이식 가능한 콜라겐 기반 조직 구조물의 형태를 잡는 데 사용됩니다. 이 비디오에서는 골격근모세포(skeletal myoblasts)를 포함하는 공학적 조직 구조물을 제작하는 과정이 설명되어 있습니다. 또한 본 프로토콜로 제작된 세포화된 조직의 심장 내 이식 과정이 시연됩니다.조직 몰드는 조직이 설계된 대상 심장의 생리적 요구 사항을 충족하기 위해 거의 모든 형태나 크기로 제작될 수 있습니다. 본 시연에서는 성체 쥐 심장의 AV groove에 맞게 절단할 수 있는 조직 조각을 형성하는 몰드를 제작합니다. 면도날을 사용하여 실리콘 튜브를 3 cm 길이의 조각으로 자른 다음, 각 조각을 길이 방향으로 이등분하여 몰드 제작을 시작하십시오.폴리에스테르 메쉬를 작게 자릅니다. 그다음 튜브의 맨 끝 안쪽에 임플란트 등급 RTV 실리콘 접착제를 한 방울 도포합니다. 접착제는 배양 세포에 어느 정도 독성이 있으므로 도포량을 최소한으로 유지하십시오.폴리에스테르 메쉬 조각을 실리콘 접착제 방울 위에 빠르게 올린 후 튜브의 끝부분과 정렬합니다. 이렇게 하면 구성물을 부착할 수 있도록 약간 솟아오른 평평한 표면이 형성됩니다. 튜브의 반대쪽 끝부분에 대해서도 동일한 과정을 반복합니다.금형을 상온에서 3일 동안 건조하십시오. 금형은 기본적으로 일회용이므로 한 번에 20~30개를 제작하는 것이 효율적입니다. 접착제가 완전히 마르면 금형을 멸균하기 위해 필요한 시점까지 70% ethanol이 채워진 용기에 보관하십시오.다음으로, 세포 분리를 준비하기 위해 필요한 모든 용액이 사용 가능한 상태인지 확인하십시오. 항생제와 항진균제가 포함된 0.2 micron 여과 멸균 PBS 250 milliliters에 laminin 1 milligram을 넣어 희석된 laminin 용액을 조제하십시오.다음으로 150 millimeter 조직 배양 플레이트에 희석된 라미닌 용액 4 milliliters를 코팅하고, 사용 전 37 °C에서 최소 4시간 동안 배양합니다. 또한 근모세포 배지와 골격근 소화 용액이라는 두 가지 다른 용액도 준비해야 합니다.제조법은 프로토콜의 텍스트 부분을 참조하십시오. 10 mL 주사기에 장착된 0.2 micron 필터 디스크를 사용하여 소화 완충액(digestion buffer)을 여과 멸균하십시오. 소화 완충액은 소분하여 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.Lewis 랫 한 배자당 5 mL의 소화 버퍼가 필요할 것으로 예상하십시오. 필요한 양의 조직 소화 버퍼와 10 mL의 근모세포 배지를 37°C에서 배양하십시오. 그 다음 새끼 랫의 해부를 진행하십시오.먼저, 핀셋과 소형 가위를 사용하여 희생된 신생 Lewis 쥐의 한 배(litter) 이상을 확보합니다. 죽은 신생 Lewis 쥐의 등 쪽을 따라 척수 방향으로 절개하고 피부와 근막 층을 벗겨낸 후 근육을 절제하여 척추 주변 근육을 제거합니다. 절제한 근육을 1X HBSS 40 mL가 채워진 50 mL 원심분리관(conical tube)에 넣고 얼음에 보관합니다.근육 조각들이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 후, 배양 접시 내에서 멸균 파스퇴르 피펫(pasture pipette)과 진공 흡입 장치를 사용하여 액체와 혈액 잔해의 대부분을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 수확한 근육 조각들을 150mm 배양 접시에 붓고 남은 액체를 최대한 흡입하여 제거합니다. 단면 면도날 두 개를 사용하여 조직을 걸쭉한 페이스트 상태가 될 때까지 잘게 다집니다.근육 페이스트는 미리 가온된 소화 용액에서 소화됩니다. 소화 용액의 일부를 근육 페이스트 위에 붓고, 용액과 근육 페이스트 혼합물을 새 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 3 liter Lewis Rats의 근육을 효율적으로 소화시키기 위해 일반적으로 10 milliliter 피펫을 사용하여 10 to 15 milliliter의 용액을 사용합니다.튜브를 로킹 플랫폼(rocking platform) 위에 놓고 37 °C에서 약 30분 동안 소화시킵니다. 효소 소화 과정 동안, 기포가 생기지 않도록 조직을 가끔씩 흔들어 줍니다. 무선 피펫에 10 mL 피펫 팁을 장착하여 사용합니다.근육 조직이 액상화되면 70 micron 셀 스트레이너로 용액을 거릅니다. 그다음 여과된 세포를 실온에서 600 G로 10분 동안 원심분리하고, 파스퇴르 피펫과 흡입기를 사용하여 액체를 최대한 제거한 뒤 10 milliliters의 따뜻한 myoblast medium으로 펠릿을 재현탁합니다. 섬유아세포는 근아세포보다 부착 속도가 빠르므로, 이를 제거하기 위해 코팅되지 않은 150 millimeter 조직 배양 플레이트에서 세포를 15분 동안 사전 부착시킵니다.플레이트를 37°C, 5% 이산화탄소 조건의 습윤 배양기에 넣습니다. 배양기에서 플레이트를 꺼내어 Lamin 코팅 배양 용기에 아직 부착되지 않은 세포들을 옮깁니다. 이를 근아세포 배지로 희석하여 쥐 새끼 1~2마리당 플레이트 1개가 되도록 준비합니다.세포를 너무 조밀하게 도말하면 근관으로 분화됩니다. 마지막으로, 37°C, 5% carbon dioxide의 습윤한 조건에서 세포를 배양하십시오. 1~2일간 배양한 후, 세포를 조직 구조체로 캐스팅할 준비가 완료됩니다.1~2일간 배양한 후, 150 mm 근아세포 조직 배양 플레이트 4개를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 48시간 이상 대기하지 마십시오. 그렇지 않으면 섬유아세포가 근아세포 집단을 압도하게 됩니다. 세포로부터 배지를 흡인하여 제거합니다.그다음 37°C로 데운 XPBS로 세포를 두 번 헹구어 플레이트에서 근모세포를 떼어내고, 각 플레이트에 데워진 0.05% tryin EDTA 용액 4 mL를 넣은 후 플레이트를 인큐베이터에 5분 동안 다시 넣습니다. 배양 후드 내에서 근모세포를 회수하고 액체를 50 mL 튜브에 수집합니다. 근모세포 배지 10 mL를 사용하여 모든 플레이트를 헹구고, 이를 원심분리 튜브에 담긴 세포와 합칩니다.상온에서 600 G로 10분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛화하고, 상층액을 가능한 한 많이 흡입하여 제거합니다. 이제 근아세포를 1.4 milliliters의 근아세포 배지에 다시 현탁하고 얼음 위에 둡니다. 핀셋을 사용하여 에탄올 배스에서 구조체 몰드를 조심스럽게 꺼내고, XPBS에 두 번 담가 헹굽니다. 6-웰 조직 배양 플레이트의 빈 웰에 몰드를 넣기 전에 파스퇴르 피펫으로 PBS 흔적을 모두 흡입하여 제거합니다.이 단계에서 용액을 조제해야 합니다. 다음 시약들을 얼음 위에 준비하십시오. 10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin.제1형 콜라겐 세포를 근아세포 배지, 중탄산나트륨 및 겔에 재현탁합니다. 서면 프로토콜에 따라 시약들을 혼합합니다. 혼합물을 20초 동안 볼텍싱하면 분홍색으로 변합니다.시판되는 1형 콜라겐의 종류에 따라 혼합, 응고 및 최종 생성물의 일관성에 미치는 영향이 다를 수 있음에 유의하십시오. 용액 내의 기포를 제거하기 위해 튜브를 아이스 버킷에 몇 분 동안 다시 넣어 두십시오.1형 콜라겐은 조사(irradiation)되지 않아야 하며, 그렇지 않으면 젤화되지 않습니다. 여기서는 돼지 피부에서 유래한 제품을 사용합니다. 혼합물이 굳기 전에 배양 플레이트의 몰드에 혼합물을 조심스럽게 붓습니다.각 몰드에는 약 1 mL의 점성 액체를 채웁니다. 이 과정에서 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 구조체 몰드가 담긴 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 조심스럽게 옮깁니다.혼합물이 응고되면서 색상이 진한 분홍색에서 연한 분홍색으로 변하며 몰드가 굳어집니다. 근아세포 배지를 37 °C로 예열하십시오. 약 30분간 배양한 후, 각 조직 구조체를 예열된 근아세포 배지에 조심스럽게 담그고 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 본 프로토콜을 적절히 수행하면, 근아세포를 포함한 조직 구조체가 체내 이식 또는 추가 분석을 위해 준비됩니다.이틀간의 배양 후, 지금까지 근원성 조직 공학 구조물을 제작하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 조기 응고를 방지하기 위해 구조물 용액에 필요한 모든 시약을 얼음 위에 보관해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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