Name: Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 배우세요 Langendorff 관류 랫 하트에서 광학 매핑을 이용한 심장 표면 동작전위 측정 기법. 고해상도 영상으로 심장 전기생리학 연구에 활용할 수 있습니다.

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그리고 어린이 병원 보스턴에서 심장 전도 기금에 기부,이 작품은 연구 국립 보건원에서 보조금 (HL088206 HL068915)에 의해 지원됩니다.

1 부 : 준비 솔루션 및 절연 perfused 심장 시스템 <ol><li> 이전 [5, 6]를 설명된대로 실험의 아침, 크렙스 - Henseleit 솔루션의 4.0 L가 준비됩니다. </li><li> 11 mMol / L 2,3 - butanedione monoxime (BDM)가 단계 1.1 준비 perfusate에서 decanted 크렙스 - Henseleit 솔루션의 1.0 L에 녹아있다. </li><li> 크렙스 - Henseleit의 추가 150 ML은 단계 1.1 준비 perfusate에서 제거 5 몰 / L DI - 8 - ANEPPS (디메틸 sulfoxide (DMSO)에 용해 10 mMol / L 주식의 희석)로 혼합합니다. </li><li> 5 % CO 2 가스, 이러한 3 솔루션은 물 외피 유리들은 41.0 ° C로 미리 예열 및 95 % 증가 O 2 μm의 필터링 0.2을 사용하여 잠수 버블러 (Radnoti)와 산소 아르 저수지 (Radnoti)으로 전송됩니다. 3 재고 저수지의 솔루션은 MasterFlex ™ L / S 연동 펌프와 낮은 흡수 실리콘 튜브 (콜 - 파머)와 벽 마운트 Langendorff 시스템에 펌핑하고 있습니다. </li><li> 이전 조립, Langendorff 시스템 유리 (Radnoti)는 꼼꼼하게 E - TOXA - CLEAN 시약 (시그마 - 알드리치)으로 세탁과 철저히 0.1 M / L HCL, 100 % 에탄올 및 증류수로 씻어서 있습니다. </li><li> 비 순환 Langendorff 장치가 물 외피 가열 코일과 거품 제거기 마음에서 분리 세 별도의 산소 저수지에서 70mm HG 정압를 제공하기 위해 만들어진 (Radnoti) [7]. 3 독립 재관류 라인은 우리가 정확하게 1.3 단계 1.1에서 준비한 솔루션의 배포를 제어할 수 있도록 2 개의 3 방향 stopcocks의 가슴 위에 수렴. 워터 외피 유리는 MasterFlex PharMed BPT 튜빙 (콜 - 파머)과 직렬로 연결되어 있고 39 ° C 예열이 E100 circulators (Lauda)를 사용하여 증류수와 함께. 것입니다 가열 코일 및 버블 트랩에 압력 머리 저수지를 연결하는 백금 - 치료의 실리콘 튜브 (콜 - 파머)를 통해 열 손실이 37 ° C perfusate 마음에 도달 결과. </li></ol> 2 부 : 추수 쥐 심장 설정 Langendorff 재관류 <ol><li> 2백~2백50그램 루이스 쥐 깊은 전신 마취를 유발하기 위해서, 100 MG / kg 케타민을 10 MG / kg Xylazine은 intraperitoneal 캐비티에 주입합니다. 이 혼합하기 위해, 우리는 explantation 절차 동안 혈액 응고 및 심근 국소 빈혈을 방지하기 위해 500 U / kg 헤파린을 추가합니다. </li><li> 마음과 큰 혈관에 쉽게 접근할 경우, 흉부 앞쪽에 벽이 제거됩니다. 그 후, 주변 조직은 신중하게 해부하고 pericardial 자루가 열립니다. </li><li> 하부 대정 맥의 식별 다음,이 배는 5-0 실크 (Ethicon)와 전체 심장 폐 블록이 explanted이다와 함께 출혈도 잡았입니다. 조직은 즉시 얼음에 50 ML의 비커에 들어있는 얼음처럼 차가운 크렙스 - Henseleit 솔루션에 배치됩니다. </li><li> 오름차순 대동맥은 신속하게 식별 및 주변 조직의 해부합니다. 적절한 규모의 정맥 (하버드 장치)가 너무 멀리 대동맥 루트에 정맥을 삽입하여 관상 동맥 재관류 의무를 방해하지 않도록주의한다, 대동맥에 삽입됩니다. 정맥은 5-0 실크 (Ethicon)로 상승 대동맥을 확보합니다. </li><li> 쥐 심장은 다음 정맥에 공기 방울을 도입하지 않고 Langendorff 장치에 배치됩니다. 역행 관상 동맥 혈관 재관류 지금 단계 1.6에서 설명한 압력 머리에서 따뜻한 산소 크렙스 - Henseleit 솔루션으로 설정됩니다. </li><li> 폐를 포함하여 추가 조직은, 지금은 제거하고 심장 기능의 회복을 허용하고 리듬을 안정화하기 위해 20 분 perfused입니다. 이 시간 동안 매우 얇은 열전대 온도 프로브 (콜 - 파머)은 왼쪽 심실 캐비티에 도입하고 5-0 Prolene 봉합사 (Ethicon)와 장소에서 봉합. 프로브는 심장의 온도를 보장하기 위해 온도 컨트롤러 (Digi - 센스)에 연결된 것은 37 유지 ° 물 순환 펌프의 설정을 조정하여 C. 심장 아펙스 떨어지는 perfusate에서 모션이 유출 용기 거즈 조각을 삽입하여 최소화합니다. </li></ol> 파트 3 : potentiometric 염료와 분산 마음과 electrographic 및 광학 신호를 획득 <ol><li> DI - 8 - ANEPPS (Invitrogen)는 꼭지를 사용하여 형광 염료와 크렙스 - Henseleit 혼합을 포함하는 재관류 라인으로 전환하여 마음에로드됩니다. 또한, 18G 정맥들은 충분히 관상 동맥을 통해 도입 염료와 perfused되지 않기 때문에 천천히 이러한 챔버의 각으로 관리합니다이 염료 용액의 왼쪽 및 / 또는 마우스 오른쪽 아트리움 및 추가 50 ML에 배치됩니다. </li><li> 로딩 절차를 수행하는 동안, 3 ECG 리드 (하버드 장치)는 부드럽게 매핑에 사용되는 광학 직면하지 않는 마음의 표면에 게재됩니다. 전극 N O 1 사후 혀끝의 좌심실 부분, N 좌심방에서 O 2, N에 위치합니다 <su> 대동맥 루트 (그림 1) 참조 전극으로 P&gt; O 3. 심방과 심실 electrographic 신호는 이후, 디지털 증폭 및 소프트웨어 (레드셔트 영상) (그림 2)를 사용하여 광 신호를 함께 표시됩니다. 오실로 스코프 (TDS 1002 텍트로닉스 모델)도 실시간으로 표면 ECG S를 시각화하고 적절한 서성 거려을 보장하는 데 사용됩니다. </su></li><li> ECG 증폭기 (휴고 삭스 Elektronik) 설정 : 하이 패스 필터 : 0.1 Hz에서 저역 통과 필터 : 150 Hz에서 </li><li> CMOS 카메라 (레드셔트 이미징)와 macroscope은 마음의 표면에 초점이고 인수 프레임에 중심 있도록 XYZ 조정을 사용하여 배치됩니다. 카메라와 광학은 공진 주파수를 최소화하기 위해 진동 절연 테이블 (마이너스 K 기술)에 탑재하고 있습니다. 동시에, 동축 서성 거려 전극 (하버드 장치)는, 고립, S48 전기 - 자극 장치 (그라스)와 제어 오른쪽 아트리움에 배치되고 심장이 분당 300 비트 (그림 1)에서 진행됩니다. </li><li> 전기 자극 (그라스) 설정 : 속도 : 초당 5 펄스 지연 : 0.2 MS 소요 시간 : 2 MS 볼트 : 6-12 V 모드 : 반복 펄스 : 싱글 </li><li> 수축에서 모션 아티팩트를 부족 광학 녹음 들어, 마음 electromechanically uncoupled해야합니다. 우리는 다시 11 mMol / L의 BDM을 포함 크렙스 - Henseleit 솔루션 재관류 라인을 전환하여이 작업을 수행. 인수 사이에, 마음 준비의 생존을 유지 수 있도록 완전한 크렙스 - Henseleit와 perfused 있습니다. </li><li> 녹음 매개 변수는 다음과 같은 인수 설정 소프트웨어 (레드셔트 이미징)을 사용하여 설정됩니다 : 구성 : 2,000 Hz에서, 128x128 픽셀 어레이 프레임 간격 : 0.5 MS 카메라 앰프 게인 : 5 배 온 - 칩 이득 : 8 배속 - 12Me - 글쎄요 셔터 : 500 MS 지연 프레임 수 : 4,000 기간 : 2000 MS </li><li> 모든 객실과 장비 조명이 꺼져 있거나 촬영 중에 배경 잡음을 제거하기 위해 차폐된 수 있습니다. LED 불빛이 사진 표백과 염색 독성을 줄이기 위해서만 광학 녹음하는 동안 마음을 조명. 광원의 셔터는 컴퓨터의 D -에 - A 보드 (레드셔트 이미징)의 방법으로 제어판을 통해 전달되는 5 V 펄스로 제어됩니다. </li></ol> 4 부 : 레드셔트 이미징 소프트웨어를 사용하여 수집 정보를 분석 <ol><li> 취득 후, 데이터가 서로 다른 필터 설정을 사용하여 처리됩니다. 우리는 일반적으로 밴드 / 스톱 44.0에서 왼쪽 경계와 98.0의 오른쪽 경계로 설정 필터를, 패스 조절 경우를 제외하고 기본 설정을 사용합니다. 나중에 기록된 정보가 처리되고 영화는 (레드셔트 이미징) 생성됩니다. </li><li> 한 인수의 데이터는 2 초 동안 심장 표면에 16,384 사이트에서 현지 전기 활성화에 해당합니다. 이 소프트웨어는이 지역의 신호가 직접적으로 서로와 심방과 심실 electrographic 음반에 비해 수 있습니다. 데이터는 색상 지방 전기 정품 인증을 매핑하고 심장 표면에 spatiotemporal 전기 활성을 보여주는 애니메이션으로이 정보를 렌더링하여 시각입니다. 이러한 애니메이션을 만들려면, 우리는 소프트웨어를 사용 : <ul><li> temporally 및 / 또는 공간 데이터를 필터링 </li><li> 애니메이션의 시작과 끝 시간을 선택 </li><li> 각 픽셀의 휴식 광 강도에 따라 색상지도 광학 신호 </li><li> 마음의 그림과 함께 나타나는 색상 데이터를 오버레이 </li><li> 애니메이션을 생성 </li></ul></li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 perfused 심장 준비가 녹음 도중에 움직이지 경우, 광 신호는 DI - 8 - ANEPPS의 방출 강도의 변경과 관련된 모든 픽셀에 대해 하나 별개의 절정을 보여줍니다. 해당 영화 (그림 3, 4)는 심장뿐만 아니라 동시에 취득 electrographic 기록 (그림 2)의 epicardial 표면에 걸쳐 전파 여기 웨이브 프론트를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="심장 조율 연구를 위한 Langendorff 심장 설정 다이어그램, 번호가 매겨진 구성 요소를 강조 표시합니다." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Langendorff - perfused 심장 준비 사진 오른쪽 아트리움에서 서성 거려 전극의 위치를 묘사하고 ECG는 단계 3.2에서 설명한 연결됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="신호가 있는 생물학적 공정 다이어그램; 형광 현미경 결과의 데이터 분석." border="0" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="그림 2"> 그림 2. perfused 루이스 쥐 심장에서 대표 광학 신호와 electrographic 녹음. 패널 A는 광학 이미징에 사용되는 epicardial 표면의 이미지를 보여줍니다. 패널 B에서 시간이 지남에 따라 형광 방출에 변경 내용을 증명하기 위해 선택한 픽셀의 위치는 색의 화살표로 표시됩니다. Electrographic 신호는 심방 활성화 및 심실 신호에 해당하는 하늘색 라인을 나타내는 빨간색 라인 패널 C에 표시됩니다. 주시기 바랍니다ve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "&gt;이 수치의 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
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<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

동물 실험은 어린이 병원 보스톤에있는 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

anesthetized 쥐에서 마음의 제거는 심근 국소 빈혈을 피하기 위해 빠르게 수행되어야합니다. 국소 빈혈 또는 불충분 관상 동맥 재관류가 발생하면 심장은 가능성이 arrhythmias을 개발하고 infarcted 될 수 있습니다. 또한 이러한 마음 유익 레코딩 및 후속 분석을 위해 충분하지 형광 방출 표시됩니다. 염료를로드하기 전에, 심근 세포 전기 자극의 안정성에 대한 physiologic 전해질 환경을 설정하고 유지하기 위해 충분히 크렙스 - Henseleit 솔루션 perfused해야합니다. perfusate의 정확한 준비는 적절한 장기 생존과 기능을 유지하기 위해 필요합니다. 전해질 농도 또는 perfusate의 불충 분한 필터링의 차이는 아마도 치명적인 심근 부전 및 심장 리듬 장애로 이어질 것입니다. 광학 녹음의 경우 심장이 완전히 전압에​​ 민감한 염료로로드해야합니다. 이 챔버는 관상 동맥에 의해 잘 perfused되지 않는 이것은 심방 myocardium 특히 중요합니다. 우리는 심방의 추가 내부 cavit...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>장비</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CardioPlex 소프트웨어</td><td>장비</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUXEON LED 광원 460-490 nm </td><td>장비</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>ECG 증폭기 Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>장비</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>이색 거울 505 nm</td><td>장비</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터 605 nm 롱패스</td><td>장비</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>측면 THT (THT Sideways)</td><td>장비</td><td>사이미디어</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>미니 볼 조인트 홀더</td><td>장비</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>소형 자극 전극 세트</td><td>장비</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>BM-6 벤치탑 진동 격리 플랫폼</td><td>장비</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>단극 심전도 전극</td><td>장비</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>롤러 펌프 SCI 400</td><td>장비</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>롤러 펌프 MasterFlex Easy Load II</td><td>장비</td><td>Cole-Parmer</td><td>모델 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>Marprene 튜빙 #14</td><td>장비</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex 튜빙</td><td>장비</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>S48 사각 펄스 자극기</td><td>장비</td><td>그라스 테크놀로지스(Grass Technologies)</td><td>모델 S48</td><td></td></tr><tr><td>SIU5 RF 변압기 절연 장치</td><td>장비</td><td>그래스 테크놀로지스</td><td>모델 SIU5</td><td></td></tr><tr><td>5리터 워터 재킷 저장조</td><td>장비</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>2리터 워터 재킷 저장조</td><td>장비</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>0.5 리터 워터 재킷 저장조</td><td>장비</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>0.25리터 워터 재킷 리저버</td><td>장비</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 가열 코일</td><td>장비</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>컴플라이언스 버블 트랩</td><td>장비</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>루어 분리형 캐뉼라</td><td>장비</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>3방향 스톱콕, FLL-MLT, 포트 커버 없음</td><td>장비</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>열전대 온도계</td><td>장비</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Fine IT-시리즈 플렉시블 마이크로프로브 </td><td>장비</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>오실로스코프 Tektronix TDS 1002</td><td>장비</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-부탄디온 모노옥심 </td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl</td><td>시약</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>자일라진</td><td>시약</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

전압에 민감한 형광 염료로 심장 표면의 광학 매핑은 실험 모델에서 전기 자극을 조사하기위한 중요한 도구가 될 것을 셀 문화 전체 - 장기 규모 범위<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. 정상적인 심장 리듬 동안이나 arrhythmias의 개시 및 유지 보수 전반에 걸쳐 사용 최첨단 광 이미징 시스템 생성 및 행동 잠재력의 전파는 거의 즉시 시각 수 있습니다<sup&gt; [1]</sup&gt;. 최신 상용 - 가능한 시스템은 매우 높은 spatiotemporal 해상도에서 정보를 제공할 수 있으며 더 많은 기존의 방법으로 부과 electrophysiological 장애물을 극복하기 위해 처음 개발된 맞춤식 장비를 기반으로했다<sup&gt; [1]</sup&gt;. 고해상도 및 고속 상보성 금속 - 산화물 - 반도체 (CMOS) 카메라와 강렬한 밝은, 발광 다이오드 (LED가)뿐만 아니라 전압에 민감한 염료, 광학, 및 필터의 발전은 전기 신호 수집을하기 시작했습니다 현미경 작업에 더 익숙한 아르 심장 혈관 세포 생물학을위한 실용. CMOS 카메라의 최신 세대 샘플 준비의 종류에 따라 16,384 픽셀 배열에서 초당 10,000 프레임을 수집할 수 있지만, 같은 photodiode 배열, 레이저 스캐닝 시스템, 냉각 한 - 설립 형광 수집 기술은 충전 - 결합 소자 (CCD ) 카메라는 여전히 다이나믹 범위에 대하여, 신호 대 잡음 비율 몇 가지 뚜렷한 장점을 가지고 있고, 양자 효율<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. 현재 연구에서는 루이스 랫 마음은 perfused되었습니다<em&gt; 예 생체내</em&gt; 37 정질 perfusate (크렙스 - Henseleit 솔루션) · 수정 Langendorff 기기에 C와 함께. 20 분 안정화 기간 후, 마음이 간헐적으로 이미지를 수집하는 동안 수축 - 관련 운동을 제거하기 위해 11 mMol / L 2,3 - butanedione의 monoxime와 perfused되었습니다. 광학 매핑을 위해, 우리는 빠른 속도로 응답 potentiometric 프로브 DI - 8 - ANEPPS로 마음을 읽어<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 μMol / L)와 짧게는 475 ± 15 나노미터 여기 라이트로 준비를 조명. 조명의 전형적인 이초 기간 동안 심장에서 방출 준비&gt; 605의 NM 라이트는 수평 macroscope에 연결된 고속 CMOS 카메라와 함께 몇 군데했다. 이 예제의 경우, 마음 절연 전기 자극 장치에 연결된 동축 전극과 분당 300 비트에서 진행되었다. 동시 양극성 electrographic 녹음은 즉시 - 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전압 신호와 함께 인수하고 분석했다. 이러한 방법으로 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 작업 잠재력은 시각과 electrographic 신호로 등록하실 수 있습니다.

이 문서 potentiometric 염료 (DI - 8 - ANEPPS)를 사용 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 광학 이미지 조치 가능성이 운동에 높은 시간적 및 공간적 해상도 기법을 설명합니다.

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

전압 민감성 형광 염료를 이용한 심장 표면의 광학 매핑은 ...의 전기적 흥분을 조사하는 중요한 도구가 되었습니다.

안녕하세요, 저는 어린이 병원 및 하워드 의과대학 마취과학과 Cohen 박사 연구실의 Yon Ziv입니다. 오늘은 랄(Lal) 관류 적심(red hearts)에서의 광학 매핑 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 심장 표면의 전기적 활동 확산을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. 실험 당일 아침에 Krebs Hensel light 용액 4L를 제조하십시오. 용액을 혼합한 후, 진공 여과법과 200 micron 필터를 사용하여 녹지 않은 입자들을 제거하십시오.먼저, 준비된 Krebs Henzel lite 용액 1 L를 사용하여 BDM 11 mmol을 용해합니다. 그 다음, Krebs Henzel lite 100 mL를 추가로 취하여 DMSO에 녹인 10 mM D8-NFS를 최종 농도가 5 µM D8-NFS가 되도록 혼합합니다. 여기서 사용된 워터 재킷 유리 저장조, 버블러 및 유리 기구는 모두 red.Naughty 제품입니다.두 용액을 41 °C로 예열된 저장조로 옮깁니다. 침전식 버블러 펌프를 사용하여 0.2 µm 필터링된 가스로 용액에 산소를 공급하고, 연동 펌프와 저흡착 실리콘 튜브가 연결된 벽걸이형 Ling Endorf 시스템을 통해 3개의 스톡 저장조로부터 용액을 펌핑하여 쥐의 심장을 적출합니다. 먼저 200 ~ 250 g의 Lewis 쥐에게 케타민과 자일라진을 복강 내 주사하여 깊은 전신 마취를 유도하고, 적출 중 혈액 응고 및 심근 허혈을 방지하기 위해 헤파린을 주사합니다.쥐가 완전히 마취되어 발가락 꼬집기 자극에 반응하지 않으면, 심장 적출을 진행합니다. 먼저 심장과 대혈관에 쉽게 접근할 수 있도록 전흉벽을 제거하여 수술을 시작합니다. 그런 다음 주변 조직을 조심스럽게 박리하고 심낭을 절개합니다.하대정맥을 확인한 후, 5-0 Proline 봉합사로 이 혈관을 결찰하고 심폐 블록 전체를 적출합니다. 즉시 얼음 위에 놓인 50 milliliter 비커의 차가운 Krebs Henzel light 용액에 조직을 넣고, 상행 대동맥을 빠르게 찾아 주변 조직으로부터 박리합니다. 적절한 크기의 캐뉼라를 대동맥에 삽입합니다.캐뉼라가 대동맥근(aortic root)에 너무 깊게 삽입되어 관상동맥의 필수적인 관류를 방해하지 않도록 주의하십시오. 캐뉼라를 상행 대동맥에 고정합니다. 그다음, 캐뉼라 내부로 기포가 유입되지 않도록 주의하며 쥐의 심장을 Ling Endorf 장치에 거치하십시오.따뜻하게 산소화된 Krebs Hensel lite 용액을 사용하여 역행성 관상동맥 혈관 관류를 설정합니다. Ling Endorf 장치의 압력 헤드에서, 세척 후 폐를 포함한 여분의 조직을 제거하고, 심장 기능을 회복시키고 관류 중 리듬을 안정화하기 위해 심장을 20분 동안 관류합니다. 매우 가는 열전대 온도 프로브를 좌심실강 내로 삽입합니다.5-0 prolene 봉합사로 프로브를 제자리에 봉합하고, 심장 온도를 유지하기 위해 수중 순환 펌프의 설정을 조정합니다. 37 °C에서 심첨부에서 떨어지는 Perfuse eight의 움직임을 최소화합니다. 유출물 수집 용기에 거즈 한 조각을 배치하면, 이제 전위 측정 염료를 주입하여 전기생리학적 및 광학적 신호를 획득할 준비가 된 것이며, 전위 측정 염료 dye eight NEPs를 심장에 주입합니다.Krebs 용액과 형광 염료가 혼합된 관류 라인으로 전환합니다. 관상동맥을 통해 주입된 염료만으로는 심방에 충분한 관류가 이루어지지 않으므로, 좌심방 또는 우심방에 18 gauge 캐뉼라를 삽입합니다. 그런 다음 각 심방에 염료 용액 50 milliliters를 천천히 추가로 투여합니다.로딩 과정 동안, 심장 표면에 세 개의 ECG 리드를 조심스럽게 배치하십시오. 이때 매핑에 사용되는 광학 장치와 마주보지 않도록 합니다. 첫 번째 전극은 좌심실의 후측 심첨부에 위치시킵니다.두 번째 전극은 좌심방에 배치하고, 세 번째 전극은 대동맥근의 기준 전극으로 사용합니다. 이후 심방 및 심실의 전기신호를 증폭 및 디지털화하여 소프트웨어를 통해 광학 신호로 표시합니다. 또한, 표면 ECG를 실시간으로 시각화하고 적절한 페이싱이 이루어지는지 확인하기 위해 오실로스코프를 사용합니다.ECG 증폭기의 하이 패스 필터를 0.1 hertz로, 로우 패스 필터를 150 hertz로 설정하고 X, Y, Z 조절 장치를 사용하여 CMOS 카메라의 위치를 잡습니다. 카메라의 초점 평면에 위치한 유리 조각을 심장 표면에 배치하여 관심 영역이 초점에 맞고 획득 프레임의 중앙에 오도록 합니다. 공진 주파수를 최소화하기 위해 카메라와 광학 장치는 진동 격리 테이블 위에 설치합니다.동시에, 절연된 S 48 전기 자극 장치로 제어되는 동축 페이싱 전극을 우심방에 배치합니다. 이를 통해 심박수를 분당 300회로 페이싱하며, 전기 자극을 다음과 같이 설정합니다.속도는 초당 5회 펄스, 지연 시간은 0.2 milliseconds, 자극 지속 시간은 2 milliseconds, 강도는 6~12 volts로 설정하며, 모드는 repeat 및 single pulse로 설정해야 합니다. 수축으로 인한 움직임 아티팩트가 없는 광학 기록을 위해서는 심장의 전기-기계적 결합을 해제해야 합니다. 이를 위해 관류 라인을 11 millimolar BDM이 포함된 Krebs Hensel 용액으로 다시 전환하십시오.측정 사이의 간격 동안, 표본의 생존력을 유지하기 위해 순수한 Krebs HENSEL 용액으로 심장을 관류하십시오. 소프트웨어 기록 파라미터를 2000 hertz 및 128 by 128 픽셀 어레이로 설정하십시오.프레임 간격은 0.5 milliseconds로 설정하고, 게인은 카메라 증폭기를 5x, 온칩 게인을 8x로 설정해야 합니다. 또한 온칩 게인은 12로 설정하십시오. 소프트웨어의 카메라 제어에서 셔터 지연 시간을 500 milliseconds로 설정하고, 2000 milliseconds 동안 4,000 프레임을 기록하십시오.녹화 중 배경 노이즈를 제거하기 위해 실내 및 장비의 모든 조명을 끄거나 차단하십시오. LED 조명은 광학 녹화 중에만 심장을 비춥니다. 광퇴색과 염료 독성을 줄이기 위해, 획득 후 컴퓨터의 D two A 보드를 통해 제어 패널로 전달되는 5 V 펄스로 광원 셔터를 제어하십시오. 서로 다른 필터 설정을 사용하여 데이터를 처리하십시오.밴드 스톱 패스 필터를 조정하는 경우를 제외하고는 일반적으로 기본 설정을 사용하며, 해당 필터의 좌측 경계는 44.0으로, 우측 경계는 98.0으로 설정합니다. 이후 기록된 정보는 처리되어 동영상을 생성하는 데 사용됩니다. 1회 획득 데이터는 2초 동안 심장 표면의 16,384개 지점에서 측정된 국소 전기 활성화 상태에 해당합니다.이 소프트웨어는 국소 전기 활성화를 색상으로 매핑하고, 이 정보를 심장 표면의 시공간적 전기 활성화를 보여주는 애니메이션으로 렌더링함으로써, 이러한 국소 신호들을 서로 직접 비교하거나 심방 및 심실 전위 기록 데이터와 비교할 수 있게 합니다. 이러한 애니메이션을 생성하려면, 먼저 소프트웨어를 사용하여 데이터를 시간적 및/또는 공간적으로 필터링하십시오. 그다음, 애니메이션의 시작 시간과 종료 시간을 선택하십시오.셋째, 각 픽셀의 정지 상태 광강도에 따라 광신호를 색상으로 매핑합니다. 넷째, 결과로 얻은 색상 데이터를 심장 이미지 위에 겹쳐 놓고, 마지막으로 관류 심장 표본이 기록 중에 움직이지 않았다면 애니메이션을 생성합니다. 기록 과정에서 광신호는 D eight anep의 방출 강도 변화에 관여하는 모든 픽셀에 대해 하나의 뚜렷한 피크를 보여줍니다. 이러한 실시간 이미징 영상은 심장의 외심장막 표면을 가로질러 전파되는 흥분 파면과 동시에 획득한 전기생리학적 기록을 보여줍니다.저희는 Alanor Perfuse Red Heart 표면에서 활동 전위의 이동을 광학적으로 이미지화하는 고해상도 기술을 방금 시연하였습니다. 이 절차를 수행할 때는 마취된 red에서 심장을 빠르게 분리하는 것이 중요합니다. 심근 허혈을 방지하기 위해 심근 세포에 충분히 관류시켜야 하며, 심장에 수분 민감성 염료가 완전히 충전되어야 합니다.이상입니다. 시청해주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

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이 보고서는 방법론과 스트레치 유발 심방 세동 동안 Langendorff - perfused 양의 마음을 그대로 좌심방의 전기적 자극을 동시에 endocardial와 epicardial 광학 매핑의 결과에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

스트레치 유도 심방세동 세동의 쉽 모델에서 고해상도 Endocardial 및 Epicardial 광학 매핑

이 문서는 파노라마 영상 시스템을 사용 Langendorff - perfused 토끼 마음에 광학 매핑 실험을 실시하기위한 기본 절차 및 듀얼 (전압과 칼슘) 이미징 양상을 설명합니다.

Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

이 비디오에서는 고립된 쥐 심장의 Langendorff 역행 관류를 수행합니다. 시술 중, 상행 대동맥에 삽입된 캐뉼라를 사용하여 관상 동맥을 통해 관류 용액으로 역행하여 심장의 심장 활동을 유지합니다. 이 모델은 심장의 심장 병리 생리학을 연구하는 데 사용됩니다.

Langendorff 역행성 심장 관류: 고립된 쥐 심장을 관류하는 생체 외 기술

고립된 쥐 심장은 허혈 재관류 손상에 대한 지속적인 모델입니다. 여기에서는 허혈성 모욕의 정도를 확인하기 위해 제자리 대동맥 삽  관술, 심장의 Langendorff 관류, 시뮬레이션된 허혈-재관류 손상 및 경색 염색을 통해 쥐에서 박동하는 심장을 채취하는 과정을 설명합니다.

랑겐 돌프 - 관류 쥐 마음에 유도 및 허혈 - 재관류 손상의 평가

이 문서에서는 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장의 상세한 프로토콜과 횡단 전위 (V 분)의 이중 광학 매핑 및 무료 내 근질 세망 (SR)에 필요한 장비 칼슘을 설명합니다. 이 방법은 그대로 심장에 직접 관찰 및 V (M)의 정량 및 SR 칼슘 역학 수 있습니다.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

여기에, 우리는 높은 공간 및 시간 해상도, 마우스 우심방 특히 중국 - 심방 노드에서 전기 활동의 광학 매핑을위한 프로토콜을 제시한다.

마우스 중국 - 심방 노드의 고해상도 광학 매핑

이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아2 + 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

이 연구의 목적은 번역 동물 모델을 사용하여 심장 역학을 조사하는 방법을 확립하는 것이었습니다. 기술된 실험 접근법은 분리되고 손상되지 않은 돼지 심장 모델에서 전기 적 활동을 평가하기 위한 전기 생리학 연구와 함께 이중 방출 광검을 통합합니다.

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

이 프로토콜은 높은 시간 및 공간 분해능으로 막관통 전압 및 세포 내 Ca2+ 과도 현상의 전기 생리학적 측정을 포함하여 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥의 영향을 받는 야생형 및 녹인 동물에서 얻은 마우스 심장의 이중 염료 광학 매핑을 소개합니다.

Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia의 RyR2R2474S Knock-In 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑

배우세요 Langendorff 관류 랫 하트에서 광학 매핑을 이용한 심장 표면 동작전위 측정 기법. 고해상도 영상으로 심장 전기생리학 연구에 활용할 수 있습니다.

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

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