Name: 기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 광범위 형광 현미경을 이용한 배양 해마 신경세포에서 덴스 코어 소포의 라이브 영상 방법입니다. 이 프로토콜은 다른 세포소기관 연구에도 적용 가능하며 신경세포 소기관 운동 역학 이해에 활용됩니다.

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우리는이 원고들의주의 읽기위한 해럴드 허터과 헬레나 데커 감사드립니다. 우리는 또한 자신의 전문 지식에 대한 Leica Microsystems에서 등록 Sidhu 감사합니다. 이 연구는 국립 과학 및 캐나다 공학 협의회, 수상 # 327100-06, 과학의 사이몬 프레 이저 대학의 학부에 의해 지원되었다.

1 부 : Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 뉴런의 Transfection 장비 설정 : 쥐 또는 마우스 hippocampal 뉴런은 Kaech와 뱅커, 2006에 따라 양식은 [4]. transfections에 사용되는 전형적인 세포 밀도는 250,000 cells/6-cm 요리입니다. 필요한 시약 및 장비 50 MM kynurenic 산성, 일반 benchtop 튜브 홀더, benchtop 쿨러를 (최고 Lipofectamine 시약의 추위를 유지하는) 포함 Lipofectamine 시약, 멤, microfuge 튜브, micropipetters 및 멸균 포셉. 절차 : <ol><li> 각 transfection 레이블을위한 두 1.5 ML 튜브, 플라스미드 DNA의 transfection 시약을 포함 한를 포함 하나. 다음 incubations은 실온에서 진행할 수 있습니다. <ol><li> 한 튜브 100 μL 멤와 플라스미드 DNA를 1.0 μg을 결합 (모든 종류의 보충없이, 멤은 equilibrated 산도의 온도가 필요하지 않습니다.) </li><li> 다른 1.5 ML 튜브 100 μL 멤와 6.0 μL Lipofectamine을 결합합니다. <ol><li> DNA 비율이 같은 경우에 halved됩니다 이중 transfections에 대한 조정은 Lipofectamine이 경우에도 필요하지 않습니다. Lipofectamine의 비율 : DNA는 제조 업체의 제안 이내에 아직도있다. 최적의 표현을위한 각각의 플라스미드에 대한 0.5-1.0 μg을 테스트하는 것이 좋습니다. </li><li> Lipofectamine 시약의 수명을 유지하려면, 그것은 가능 한한 짧은 시간 동안 냉장고에서 제거되어야하며 사용하지 않을 때는 benchtop 쿨러에 배치. 냉장고에서 꺼내 총 시간은 최소로 보관해야합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 상온에서 5 분 튜브를 품어. </li><li> 지질 관에 DNA 인 멤 솔루션을 전송하고, 부드럽게 실온에서 30 분 부화 후, 피펫과 함께 섞는다. </li><li> 25분 후 틀지 coverslips 전에 교양 뉴런의 접시에 excitoxic 피해를 최소화하기 위해 50 MM kynurenic 산 60 μL를 추가합니다. <ol><li> 조심스럽게 플립 coverslips는 피트 쪽 접속 살균 집게를 사용하여, 그들이 중복되지 않도록 조정. coverslip의 신경 세포 - 표면 코팅 또는 접시의 glia - 코팅 표면을 긁어하지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 6 cm 요리에서 매체의 약 0.5 ML를 타고 부드럽게 튜브의 DNA와 혼합, 매체의 표면에 균일하게 떨어지는 접시에 다시 DNA 솔루션을 전송할 수 있습니다. </li><li> 아니 소용돌이지만, 부드럽게 한 방향으로 앞뒤로 요리를 슬라이드를 나서 중지하고 골고루 DNA - Lipofectamine의 단지를 배포하는 수직 방향으로 반복합니다. 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2)에 90 분간 품어. </li><li> 그들이 중복되지 않도록 뒤집기 coverslips는 피트 사이드 다운, 그리고 준비. 표현식이 48 시간 일반적으로 하룻밤, 원하는 시간에 진행하도록 허용합니다. </li></ol> 2 부 : 교양 hippocampal 뉴런에 GFP - 태그 고밀도 코어 vesicles의 라이브 영상 장비 설정 : <ol><li> 라이브 세포 영상은 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경을 요구, 우리는 Leica 변수, 형광등 장착된 Leica DMI 6000B 거꾸로 현미경을 사용합니다. 또한 온도 컨트롤러와 객관적인 히터와 영상 챔버가 필요합니다. 우리는 워너 인스 트루먼 트의 RC - 21BR이 (cat. # TC324B) 플랫폼 히터 이외에 18 mm coverslip에 대한 수정 (cat. # PH2) 및 온도 컨트롤러 사용합니다. 챔버는 열려있는 포트, 챔버 주문시 포함될 수있는 수정을 포함하지 않습니다. 객관적인 히터는 높은 coverslip의 온도를 유지하고 온도 변동에 의한 초점의 변화를 최소화하는 것이 좋습니다. 이미지 수집의 &#39;스트리밍&#39;모드 드롭 포함한 Metamorph (분자 장치) 소프트웨어를 사용하여 하마 오카 - ER과 함께 찾았습니다. 참고 - 우리는 전체 현미경을 encloses 기후 챔버를 사용하지 마십시오. 이것은 또한 비용과 여기에서 설명한 단기 이미지가 필요하지 않습니다. </li><li> 기타 장비 및 시약은 신선한 라이브 영상 매체 (1X 칼슘 2 행크스 +와 MG 2 +, 0.6 %의 포도당과 10mM HEPES), 추가 18 mm 유리 coverslips, 살균 포셉, 비 멸균 포셉, Kimwipes, 진공 그리스를 포함 , 그리고 그리스를 적용하는있는 주사기 (바늘없이 또는 수정 넓은 구멍 바늘로). </li></ol> 절차 : <ol><li> (1X 칼슘 2 행크스 +와 MG 2 +, 0.6 %의 포도당과 10mM HEPES) 신선한 라이브 영상 매체를 준비합니다. 사용하지 않을 때 우리는 일반적으로 4 O C에서 시간과 가게에서 50mls 준비합니다. 한 번에 한 병 이상은 안된다 주일 동안 충분한 준비를하는 것이 좋습니다. 약 50-10 ML은 뉴런의 요리마다 사용됩니다. </li><li> 현미경, 카메라, 형광 램프 및 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다. 또한 챔버 플랫폼과 객관적인 히터에 전원을 켭니다. </li><li> 상상 준비g 챔버. <ol><li> 워너 챔버는 coverslips의 장착을위한 테플론 삽입을 포함합니다. 영구 마커로 삽입 &quot;최고&quot;의 조작, 라벨 한쪽의 용이성을 위해. </li><li> &quot;맨&quot;이라는 챔버의 측면에있는 구멍을 둘러싼 홈으로 그리스의 반지를 적용합니다. 그것은 챔버를 입력하고 관찰할 수있는 영역을 줄일 수로 초과 사용을 피하십시오. </li><li> 포셉 사용, 챔버의 &quot;최상위&quot;쪽으로 깨끗하고, 사용하지 않은 18 cm coverslip을 첨부 챔버의 recessed 홈 안에 단단히 밀봉을 만들 수의 가장자리에있는 coverslip에 부드러운 압력을 적용합니다. </li><li> 챔버 뒤집어과 챔버의 반대 (아래쪽) 측면에있는 홈에 기름과 비슷한 반지를 적용합니다. </li><li> 이상적인 챔버 소유자가 50 - ML 튜브의 뚜껑까지 -에 대한 준비 챔버 바닥 사이드를 놓습니다. </li><li> 실로 영상 매체의 750 μL를 추가합니다. 이것은 과도한 금액이지만, 그리스를 통해 밝혀 지던에서 매체를 방지해야하며 초과가 휴대 대상 coverslip이 적용되었을 때 갇혀에서 거품을 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 필요한까지 조직 문화 인큐베이터에서 준비 챔버를 유지합니다. 영상 매체 증발과 조성의 변화하므로 장기간 incubations는 ~ 1 시간은 피해야한다. </li></ol></li><li> 최종 챔버 어셈블리 및 라이브 셀 이미징을 수행합니다. <ol><li> 조직 문화 후드로 인큐베이터에서 준비 챔버와 transfected coverslips의 요리를 이동합니다. </li><li> 최종 챔버 어셈블리는 세포가 중간에서 ° C 연속적으로 37 포장되어 유지하기 위해 신속하게 수행하여야한다. </li><li> 멸균 집게를 사용하면, 조심스럽게 transfected 접시에서 한 coverslip을 제거, 성장 매체를 떼어 놓으 Kimwipe로 coverslip의 가장자리를 만져. </li><li> 준비 챔버에 신경 쪽 다운 coverslip를 놓습니다. 먼저 그리스에 coverslip의 한쪽을 터치하고 트래핑 거품없이 평면 coverslip을 가져 가장자리 주변에 압력을 적용합니다. 초과 영상 매체는 예상대로 밖으로 유출됩니다. </li><li> 초과 이미징 매체를 닦아지만, 위치에서 벗어나 coverslips을 슬라이드하지 않도록주의합니다. </li><li> 사전 온수 플랫폼 히터로 챔버를 이동과 장소에 챔버를 고정. </li><li> 무대에 챔버를 전송합니다. </li><li> photobleaching 및 photoxicity을 줄이기 위해, transfected 세포를 찾기 위해 필요한 강도의 최소 금액에 램프를 조정합니다. </li><li> 낮은 배율 오일 목적 (40X)와 관심의 세포를 찾아보십시오. 그것은 최대한의 coverslip 보험을 보장하고 오른쪽에있는 작업을 아래로 중복 이미지 인수, coverslip의 예를 들어, 왼쪽 위, 최대 스캔 및 방지 계획의 검색 패턴에 충실하기 위해 유용합니다. </li><li> 원하는 필드가 위치되고 나면 높은 배율 오일 목표 (60 - 100x)로 전환합니다. </li><li> 찬란 - 표시 단백질 역학의 동영상을 기록하려면 &quot;스트림 인수&quot;또는 이미징 소프트웨어의 비교 기능을 사용하십시오. </li><li> 나중에 분석 및 프리젠 테이션을위한 단계 이미지와 다른 이미지를 동반 (예 : 가용성식이 GFP) 가져가라. </li><li> 더욱 coverslip을 탐구하고 다음 비디오를 녹화하기 전에 모든 이미지를 저장합니다. </li><li> 통상 coverslip 3-5 동영상이 성공적으로 간주됩니다. 교통이 손상된 세포의 감소로 Phototoxicity와 일반 세포의 건강은 염두에 보관해야합니다. 세포 건강 위상 현미경을 사용하여 관찰하여 모니터링할 수 있습니다. 일반적으로 녹음이 coverslip 당 약 30 분 동안 수행됩니다. </li></ol></li></ol> 파트 3 : 대표 결과 : 라이브 셀 이미징 관찰은 일반적으로 뷰 (그림 1A)의 분야 내에서 찬란 - 태그 organelles의 움직임을 보여주 비디오 (또한, 이미지의 &quot;스택&quot;으로 함)로 이루어져 있습니다. 각각의 동영상을 동반하는 것은 종종 단백질 발현 및 / 또는 세포의 건강의 세포 기관, 레벨에 관한 전망 분야의 방향을 보여주는 이미지를 지원하고 있습니다. 교통 동영상 kymographs (그림 1B)로 변환하여 정량 분석​​을 받게 될 수 있습니다. Kymographs는 각 시점이 kymograph의 열에 의해 표현 라인 스캔 juxtaposing하여 입자의 움직임을 보여주는 이미지입니다. 그림 2는 반대 방향으로 이동이 입자가 kymograph로 표현하는 방법을 보여줍니다. kymographs의 자세한 분석은 입자 유량, 속도, 실행 길이, reversals, 그리고 고정 입자에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1144/fig1.jpg" alt="" /> 그림 1. 대표 라이브 셀 이미징었습니다. mCherry - 태그 티슈 Plasminogen 활성제 (TPA) 교통의 동영상 (A)을 선택 프레임. anterograde 이사 개별 입자 (녹색 화살표)와에 역행 (빨간색 화살표) 방향이 표시됩니다. (B) 해설 Kymographs은 TPA - mCherry 운동축삭. 대각선 라인은 세포 본체에서 (긍정적인 경사) 또는 (음수 경사) 방향으로 멀어 organelles를 대표하면서 kymographs의 수평 라인, 고정된 개체를 나타냅니다. 긴 녹색과 빨간색 화살표는가 (A)의 입자에 해당하는 실행 보여줍니다. 미세 소관 depolymerizing 시약, nocodazole로 인해 교통의 변화는 또한 kymograph와 그림입니다. 대각선 라인의 부재에 의해 움직이는 organelles의 감소에 유의하십시오.

<ol><li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li>
<li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li>
<li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

라이브 셀 이미징은 교양 뉴런의 organelle 운송의 직접 관찰하기 위해 도전하지만, 강력한 기술입니다. 어려움 문화 합병증으로 인해 가난한 사람의 신경 세포 건강과 절차의 상류 발생할 수 있습니다. 따라서, 세포 건강 (예제 심판을 참조하십시오. 4) 성장 매체의 조직 문화 라이트 현미경을 사용하는 동안 coverslips을 준수하여 transfection 이전과 이후 평가해야합니다. 전송의 과정을 신경 세포를 포함하고있는 영상 실로 coverslips하면 세포에 스트레스, 따라서 그것은 coverslips을 조작하면주의를 운동하는 것이 중요합니다. 건강 보이는 세포가 프로 시저에서 지연이나 영상 매체의 장비 또는 평균의 불완전한 미리 가열로 인해 어떤 교통 수단을 표시하지하는 것은 일반적인 수 있습니다. 교통 분석을위한 axonal와 돌기 방향을 알 수 있어야합니다, anterograde과 역행 수송을 구별 즉. 그것은 따라서 세포 기관의 위치 결정 및 연속의 연결 세그먼트는 세포 기관에의 관심 지역을 연결하는 볼 수 ...

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David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

A correction to author names has been made for article Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

<table><tbody><tr><td>Earle salts 및 L-glutamine 함유 MEM-Eagle</td><td>시약</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>형질전환 시약</td></tr><tr><td>Ca2+ 및 Mg2+ 함유 10X Hanks</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185-052</td><td>실시간 이미지 촬영 배지</td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630-130</td><td>실시간 이미지 촬영 배지</td></tr></tbody></table>

기본 교양 hippocampal 신경에 덴스 코어 vesicles의 라이브 영상

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

관찰하고 역동적인 세포 과정을 특성화하는 것은 정적인 이미지에서 얻은 수없는 세포 활동에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 바이탈 형광 프로브, 특히 녹색 형광 단백질 (GFP)은 특정 세포내 구획과 세포 구조를 분류하는 능력에서 형태소 분석 세포 생물학 혁명을했습니다. 예를 들어, GFP (및 그 변종 스펙트럼) chimeras의 라이브 영상이 생물과 세포 유형 [1-3]는 수많은에 cytoskeleton, organelle 전송 및 멤브레인 역학의 동적 분석을 위해 사용할 수있다. 라이브 영상이 널리 사용되고 있지만,이 방법은 여전히​​ 특히 기본 교양 뉴런에서 많은 기술적인 도전, 포즈. 하나의 문제는 사후 mitotic의 뉴런에 GFP - 태그 단백질의 표현이며, 다른 하나는 photobleaching, 일반 세포의 건강을 유지, phototoxicity을 최소화하면서 형광 이미지를 캡처하는 능력입니다. 여기 우리는 그러나 완전히 양극 뉴런의 이미징에 이상적입니다, 상대적으로 낮은 transfection 속도 (~ 0.5 %) 산출 지질 기반 transfection 방법을 설명하는 프로토콜을 제공합니다. 단일 axons과 dendrites가 anterograde 대 역행 교통, 즉의 방향을 확인하는 세포 기관에 자신의 방향으로 특성화 할 수 있도록 낮은 transfection 속도가 필수적이다. 뉴런을 표현하는 영상 GFP에 대한 우리의 접근 방식은 CCD 카메라, 이미지 캡처 소프트웨어 및 온수 영상 챔버와 복 표준 넓은 필드 형광 현미경에 의존합니다. 우리는 특별한 광학이나 형광등 광원 이외의 여기 조건없이 예를 들어, 고밀도 코어 vesicles, mitochondria, 성장 콘, 그리고 굴지 organelles 또는 구조의 다양한 몇 군데 있습니다. 또한 spectrally - 별개의, 찬란 표시된 단백질, 예를 들면, GFP 및 dsRed - 태그 단백질은, 공동 운송 또는 다른 조정 세포 이벤트를 특성화 동시에 가까운 시각하실 수 있습니다. 여기에 설명된 이미징 접근 이미징 어플 리케이션의 다양한 유연하고 상대적으로 작은 비용 실험실 채택 수있는 것은 현미경을 사용할 수있는 제공됩니다.

organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

역동적인 세포 과정을 관찰하고 특성화하면 정적인 이미지로는 얻을 수 없는 세포 활동에 관한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다.

라이브 셀 이미징은 소기관 수송의 역동성을 연구할 때 특히 유용합니다. 이 영상에서는 배양된 해마 뉴런에서 dense core vesicles를 이미징하는 데 사용되는 절차를 중점적으로 다룹니다. 먼저 DMEM 배지와 lipectomy transfection 시약을 혼합하여 transfection 복합체를 얻습니다.해마 뉴런은 글리아 단층을 마주보고 도립된 커버슬립 위에서 배양되므로, transfection 시약에 노출시키기 위해서는 이 커버슬립을 뒤집어야 합니다. GFP 태그가 부착된 dense core viscal 단백질이 충분히 발현될 때까지 기다린 후, 이미징 챔버를 구축합니다. 배양된 뉴런 내 dense core ICAL의 이미징은 광시야 형광 현미경(wide field fluorescence microscopy)을 사용하여 수행할 수 있습니다.이 프로토콜은 유연하게 적용 가능하며 미토콘드리아, 엔도솜 및 퍼옥시좀과 같은 다른 세포 소기관을 이미징하는 데에도 맞게 조정될 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 사이먼 프레이저 대학교의 세포 신경과학 연구실의 마이클 실버맨입니다. 저희 연구실은 신경 세포 내에서 세포 소기관들이 어떻게 이동하는지에 관심을 두고 있습니다.이 질문에 접근하기 위해, 우리는 배양된 해마 뉴런 내의 막 결합 소기관, 특히 조밀 핵 소낭(dense core vesicles)을 표지합니다. 이를 수행하는 방법을 보여드리기 위해 데이비드에게 마이크를 넘기겠습니다. 안녕하세요, Silverman 연구실의 데이비드입니다.오늘은 광시야 웨스턴 현미경을 사용하여 조밀심 소포(dense core vesicles)와 배양된 뉴런의 살아있는 세포 이미징을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 시작하겠습니다. 대부분의 실험에서, 우리는 각 형질전환당 6cm 디시에 250,000 cells의 세포 밀도로 배양된 쥐 해마 뉴런 디시를 사용합니다. 1.5 milliliter 튜브 두 개에 각각 플라스미드 DNA용과 형질전환 시약용으로 라벨을 붙이십시오.층류 깨끗한 작업대(laminar flow hood)에서, 상온의 튜브 하나에 1 µg의 plasmid DNA와 100 µL의 MEM을 혼합합니다. 이때 MEM은 보충제가 포함되지 않은 것을 사용하십시오. 다른 튜브에는 6 µL의 lip과 100 µL의 MEM을 혼합합니다. 이중 transfection의 경우에도 동일한 양을 사용할 수 있으나, 이 경우 lip DNA 비율은 절반으로 줄어듭니다.지질 시약의 유효 기간을 유지하려면 항상 냉장 보관하거나 벤치탑 쿨러에 보관하고, 튜브를 실온에서 5분 동안 배양하십시오. MEM 내의 DNA 혼합물을 지질 튜브로 옮기고 APE와 함께 가볍게 섞은 후, 실온에서 30분 동안 배양하십시오. 25분 후, 배양된 뉴런의 세포 독성 손상을 최소화하기 위해 50 millimolar K neuronic acid 60 microliters를 첨가하십시오.GL 단층 위에 매달린 커버슬립 하단에서 뉴런을 배양하므로, 커버슬립을 뒤집어 뉴런이 transfection 용액에 노출되도록 해야 합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 커버슬립의 아래쪽 면이 위를 향하도록 조심스럽게 뒤집으십시오. 커버슬립들이 서로 겹치지 않게 배치하십시오.커버슬립의 뉴런 코팅 표면이나 디쉬의 ggl 코팅 표면을 긁지 않도록 주의하십시오. 30분간의 배양 후, 6cm 디쉬에서 약 0.5 milliliters의 배지를 취해 튜브 내의 DNA와 부드럽게 혼합합니다. DNA 용액을 다시 디쉬로 옮기며, 배지 표면에 골고루 떨어뜨려 줍니다.디쉬를 한 방향으로 부드럽게 앞뒤로 밀어주되, 배지가 부풀어 오르지 않도록 주의하십시오. 한 방향으로 혼합한 후, 멈추고 수직 방향으로 반복하여 DNA 리포좀 복합체가 디쉬 전체에 고르게 분포되도록 합니다. 37°C, 5% carbon dioxide 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 90분 동안 배양하십시오.배양 후, 커버슬립을 발 부분이 아래로 향하도록 뒤집어 겹치지 않게 배치합니다. 마지막으로, DNA 발현이 원하는 시간 동안 진행되도록 하며, 이는 일반적으로 인큐베이터 내에서 하룻밤부터 48시간까지입니다. 배양된 해마 뉴런에서 GFP가 표지된 조밀핵 소포(dense core vesicles)의 라이브 이미징을 위해서는 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경이 필요합니다.온도 조절기와 대물렌즈 히터가 장착된 이미징 챔버가 필요합니다. 챔버에는 개방된 포트가 없어야 하며, 이는 챔버 주문 시 수정 사항으로 포함할 수 있습니다. 그다음, 현미경 카메라, 형광 램프 및 이미지 획득 소프트웨어를 실행하십시오.챔버 플랫폼과 대물렌즈 히터의 전원을 켭니다. 이때 대물렌즈에 오일을 한 방울 도포하는 것이 좋습니다. 이제 가열 플랫폼과 이미징 챔버를 준비하십시오.조작의 편의를 위해, 챔버 상단 한쪽 면에 영구 마커로 표시하십시오. 챔버 상단이 위를 향하도록 50 milliliter 튜브 뚜껑 위에 놓으십시오. 이 튜브 뚜껑은 이상적인 챔버 홀더 역할을 합니다.top이라고 표시된 챔버 측면의 구멍 주변 홈에 그리스를 링 모양으로 도포합니다. 그리스가 챔버 내부로 들어가 관찰 영역이 좁아질 수 있으므로 과하게 사용하지 않도록 주의하십시오. 이때 핀셋을 사용합니다.깨끗한 미사용 18 centimeter 커버슬립을 챔버의 상단에 부착하십시오. 커버슬립의 가장자리에 가볍게 압력을 가하여 챔버의 오목한 홈 내부에 밀착되도록 합니다. 챔버를 뒤집어 반대편 또는 챔버 하단의 홈에 동일하게 그리스 링을 도포하십시오.이미징 배지 750 µL를 챔버로 옮깁니다. 이는 다소 많은 양이지만, 그리스가 배지가 넘치는 것을 방지하며, 세포가 도포된 커버 슬립을 덮을 때 기포가 갇히는 것을 방지해 줍니다. 준비된 챔버는 필요할 때까지 조직 배양 인큐베이터에 보관하십시오.이미징 배지가 증발하여 조성이 변할 수 있으므로 1시간 이상의 장시간 배양은 피해야 합니다. 라이프스타일 이미징을 위한 최종 챔버 조립을 위해, 준비된 챔버와 형질전환된 커버슬립이 담긴 디쉬를 인큐베이터에서 조직 배양 후드로 옮깁니다. 멸균 핀셋을 사용하여 형질전환된 디쉬에서 커버슬립 하나를 조심스럽게 꺼냅니다.그 다음, 커버슬립의 가장자리를 킴와이프(kim wipe)에 살짝 대어 배양액을 흡수시킵니다. 이어서, 준비된 챔버 위에 커버슬립의 뉴런 면이 아래로 향하게 놓습니다. 커버슬립의 한쪽 면을 그리스에 먼저 접촉시킨 후, 가장자리를 따라 압력을 가해 기포가 생기지 않도록 커버슬립을 평평하게 밀착시킵니다.과잉의 이미징 배지가 흘러넘칠 것으로 예상되므로, 커버슬립이 위치에서 벗어나지 않도록 주의하며 여분의 이미징 배지를 닦아냅니다. 챔버를 예열된 플랫폼 히터로 옮겨 고정합니다. 다음으로, 광퇴색(photobleaching)과 광독성(phototoxicity)을 줄이기 위해 챔버를 스테이지로 이동시킵니다.형질전환된 세포를 찾는 데 필요한 최소한의 세기로 램프를 조절하십시오. 이제 분석 대상 세포를 찾습니다. 40x와 같은 저배율 오일 렌즈를 사용할 때는 계획된 탐색 패턴을 따르는 것이 커버슬립 전체 영역을 최대한 훑고 중복된 이미지 획득을 방지하는 데 유리합니다.원하는 시야를 찾았으면, 관심 있는 형광 표지 단백질의 채널로 전환하십시오. 60~100배율과 같은 고배율 오일 렌즈로 전환하고 램프 강도를 다시 높은 설정으로 되돌리십시오. 빠르게 이동하는 소기관의 형광 표지 단백질 동역학을 기록하려면 스트림 획득(stream acquisition) 또는 이미지 분석 소프트웨어의 유사한 기능을 사용하십시오. 높은 프레임 속도로 기록물을 생성하기 위해 노출 시간과 노출 간 간격을 최소화해야 합니다.온스크린 미리보기에서 관찰되는 초점 드리프트는 수동 초점 조절을 통해 실시간으로 교정할 수 있습니다. 위상차 이미지 및 추후 분석과 발표에 필요한 기타 관련 이미지들을 반드시 촬영하십시오. 커버슬립을 더 탐색하고 다음 녹화를 진행하기 전에 모든 이미지를 저장하십시오.통상적으로 하나의 커버슬립에서 3~5개의 녹화 영상을 얻으면 성공적인 것으로 간주하며, 각 커버슬립은 30~60분 동안 이미징합니다. 손상된 세포에서는 운송체(transporter)의 기능이 감소하므로, 일반적인 세포 건강 상태 및 광독성에 유의해야 합니다. 살아있는 세포 이미징 관찰은 일반적으로 시야 내에서 형광 표지된 세포소기관의 이동을 보여주는 이미지 스택(stacks of images) 형태의 녹화 영상으로 구성됩니다. 다음은 조밀심 과립(dense core) iCal 운송의 대표적인 영상입니다.더 쉬운 관찰을 위해 색상을 반전시켰습니다. 움직이는 입자들에 주목하십시오. CH 그래프는 각 시간 지점이 그래프의 열로 표시되는 라인 스캔을 병치하여 입자의 움직임을 보여주는 이미지입니다.이 그림은 서로 반대 방향으로 이동하는 두 입자가 CH 그래프에 어떻게 표시되는지를 보여줍니다. 크로노그래프(chronograph)를 추가로 분석하면 입자 플럭스 속도, 주행 길이 반전 및 정지된 입자에 관한 정보를 얻을 수 있습니다. 지금까지 배양된 하마 피질 뉴런에서 dsco 소낭 수송의 고속 녹화 영상을 획득하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때, 세포가 배양기에서 스테이지로 이동하는 동안 받는 스트레스를 줄이기 위해 이미징 챔버와 플랫폼의 모든 구성 요소를 미리 가열하는 것이 중요합니다. 신속하면서도 주의 깊게 작업하십시오. 이것으로 모두입니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 고도로 피더 glial 세포 레이어를 사용하지 않고 태아 쥐 두뇌의 hippocampal 뉴런을 정화의 문화에 대한 프로토콜을 제공합니다.

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

이 동영상은 신경 소포의 움직임을 시각화하기 위해 특정 형광 단백질로 표지하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 형광 단백질에 대한 플라스미드 코딩을 형질주입(transfection)제와 함께 배양한 다음 뉴런 배양액에 도입합니다. 그 후, 뉴런의 이미지를 획득하고 분석하여 소포의 움직임을 추적합니다.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

출처: Villarreal, S., et. al., 배양된 해마 뉴런에서 시냅스 소포 세포내구증 측정. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 양고추냉이 과산화효소 표지 및 전자 현미경을 통해 배양된 해마 뉴런의 시냅스 소포 세포내이입 분석을 보여줍니다.

투과 전자 현미경 이미징 마우스 해마 뉴런에서 시냅스 소포 세포내이입 

출처: Calvo-Rodríguez, et al. 노화된 해마 뉴런에서 세포 내 Ca2+의 형광 및 생물 발광 이미징.J. Vis. Exp. (2015).  이 비디오는 단기 및 장기 쥐 해마 배양에서 세포질 칼슘 수치를 측정하기 위해 형광 이미징을 사용하는 방법을 보여줍니다. 젊은 뉴런과 노화된 뉴런을 비교함으로써, 노화된 뉴런의 증가된 L형 전위의존성 칼슘 채널 밀도와 장기간의 활성화가 어떻게 뉴런 노화의 특징인 칼슘 과부하를 초래하는지 강조합니다. 형광 칼슘 지표는 자극에 따른 형광 강도의 변화를 통해 이러한 차이를 나타냅니다.

In Vitro Calcium Imaging in Short-Term and Long-Term Rat Hippocampal Cultures

우리는 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 기반의 고정, 배양 신경 세포에있는 소포의 연구를 구현하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 프로토콜의 주요 구성 요소는 초 해상 현미경 시스템 띄엄 샘플링 된 원시 영상을 수집하고, 수퍼 - 해상도 이미지를 생성하는 것의 이미지를 처리​​ photoconvertible 키메라와 라벨링 소포를 포함한다.

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

1차 해마 뉴런의 저밀도 배양은 일반적으로 신경 영양 인자를 공급하고 수명을 유지하기 위해 신경교 공급층을 필요로 합니다. 여기에서는 고밀도 뉴런 공급층(neuronal feeder layer)이 있는 곳에서 유리 커버슬립에서 초저밀도 뉴런을 배양하는 단순화된 방법을 설명하며, 이는 특정 뉴런 자율 메커니즘의 연구를 용이하게 합니다.

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이 문서에서는 아교 세포 단층을 통해 반전 커버 글라스에 성장 저밀도 차 해마 신경 세포를 배양 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 및 아교 층 파라핀 왁스 비드에 의해 분리된다. 이 방법에 의해 성장 된 뉴런 고해상도 광학 이미징 및 기능 분석에 적합하다.

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막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.

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시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

이 프로토콜은 1 차적인 신경 배양에서 단백질 공동 국소화를 공부하기 위하여 초해상도 현미경 검사를 채택하는 방법을 보여줍니다.

1차 뉴런에서 단백질과 시냅스 마커의 공동 국소화를 연구하는 초해상도 이미징

여기에서는 1차 해마 설치류 뉴런의 transfection과 live-cell confocal imaging을 결합하여 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질 유도 효과를 분석하고 이러한 효과를 매개하는 기계론적 경로를 식별하는 방법을 보여줍니다.

일차 해마 뉴런의 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질의 효과를 측정하기 위해 Live-Cell Imaging 사용

배우세요 광범위 형광 현미경을 이용한 배양 해마 신경세포에서 덴스 코어 소포의 라이브 영상 방법입니다. 이 프로토콜은 다른 세포소기관 연구에도 적용 가능하며 신경세포 소기관 운동 역학 이해에 활용됩니다.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

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