기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

라이브 셀 이미징은 소기관 수송의 역동성을 연구할 때 특히 유용합니다. 이 영상에서는 배양된 해마 뉴런에서 dense core vesicles를 이미징하는 데 사용되는 절차를 중점적으로 다룹니다. 먼저 DMEM 배지와 lipectomy transfection 시약을 혼합하여 transfection 복합체를 얻습니다.

해마 뉴런은 글리아 단층을 마주보고 도립된 커버슬립 위에서 배양되므로, transfection 시약에 노출시키기 위해서는 이 커버슬립을 뒤집어야 합니다. GFP 태그가 부착된 dense core viscal 단백질이 충분히 발현될 때까지 기다린 후, 이미징 챔버를 구축합니다. 배양된 뉴런 내 dense core ICAL의 이미징은 광시야 형광 현미경(wide field fluorescence microscopy)을 사용하여 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜은 유연하게 적용 가능하며 미토콘드리아, 엔도솜 및 퍼옥시좀과 같은 다른 세포 소기관을 이미징하는 데에도 맞게 조정될 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 사이먼 프레이저 대학교의 세포 신경과학 연구실의 마이클 실버맨입니다. 저희 연구실은 신경 세포 내에서 세포 소기관들이 어떻게 이동하는지에 관심을 두고 있습니다.

이 질문에 접근하기 위해, 우리는 배양된 해마 뉴런 내의 막 결합 소기관, 특히 조밀 핵 소낭(dense core vesicles)을 표지합니다. 이를 수행하는 방법을 보여드리기 위해 데이비드에게 마이크를 넘기겠습니다. 안녕하세요, Silverman 연구실의 데이비드입니다.

오늘은 광시야 웨스턴 현미경을 사용하여 조밀심 소포(dense core vesicles)와 배양된 뉴런의 살아있는 세포 이미징을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 시작하겠습니다. 대부분의 실험에서, 우리는 각 형질전환당 6cm 디시에 250,000 cells의 세포 밀도로 배양된 쥐 해마 뉴런 디시를 사용합니다. 1.5 milliliter 튜브 두 개에 각각 플라스미드 DNA용과 형질전환 시약용으로 라벨을 붙이십시오.

층류 깨끗한 작업대(laminar flow hood)에서, 상온의 튜브 하나에 1 µg의 plasmid DNA와 100 µL의 MEM을 혼합합니다. 이때 MEM은 보충제가 포함되지 않은 것을 사용하십시오. 다른 튜브에는 6 µL의 lip과 100 µL의 MEM을 혼합합니다. 이중 transfection의 경우에도 동일한 양을 사용할 수 있으나, 이 경우 lip DNA 비율은 절반으로 줄어듭니다.

지질 시약의 유효 기간을 유지하려면 항상 냉장 보관하거나 벤치탑 쿨러에 보관하고, 튜브를 실온에서 5분 동안 배양하십시오. MEM 내의 DNA 혼합물을 지질 튜브로 옮기고 APE와 함께 가볍게 섞은 후, 실온에서 30분 동안 배양하십시오. 25분 후, 배양된 뉴런의 세포 독성 손상을 최소화하기 위해 50 millimolar K neuronic acid 60 microliters를 첨가하십시오.

GL 단층 위에 매달린 커버슬립 하단에서 뉴런을 배양하므로, 커버슬립을 뒤집어 뉴런이 transfection 용액에 노출되도록 해야 합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 커버슬립의 아래쪽 면이 위를 향하도록 조심스럽게 뒤집으십시오. 커버슬립들이 서로 겹치지 않게 배치하십시오.

커버슬립의 뉴런 코팅 표면이나 디쉬의 ggl 코팅 표면을 긁지 않도록 주의하십시오. 30분간의 배양 후, 6cm 디쉬에서 약 0.5 milliliters의 배지를 취해 튜브 내의 DNA와 부드럽게 혼합합니다. DNA 용액을 다시 디쉬로 옮기며, 배지 표면에 골고루 떨어뜨려 줍니다.

디쉬를 한 방향으로 부드럽게 앞뒤로 밀어주되, 배지가 부풀어 오르지 않도록 주의하십시오. 한 방향으로 혼합한 후, 멈추고 수직 방향으로 반복하여 DNA 리포좀 복합체가 디쉬 전체에 고르게 분포되도록 합니다. 37°C, 5% carbon dioxide 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 90분 동안 배양하십시오.

배양 후, 커버슬립을 발 부분이 아래로 향하도록 뒤집어 겹치지 않게 배치합니다. 마지막으로, DNA 발현이 원하는 시간 동안 진행되도록 하며, 이는 일반적으로 인큐베이터 내에서 하룻밤부터 48시간까지입니다. 배양된 해마 뉴런에서 GFP가 표지된 조밀핵 소포(dense core vesicles)의 라이브 이미징을 위해서는 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경이 필요합니다.

온도 조절기와 대물렌즈 히터가 장착된 이미징 챔버가 필요합니다. 챔버에는 개방된 포트가 없어야 하며, 이는 챔버 주문 시 수정 사항으로 포함할 수 있습니다. 그다음, 현미경 카메라, 형광 램프 및 이미지 획득 소프트웨어를 실행하십시오.

챔버 플랫폼과 대물렌즈 히터의 전원을 켭니다. 이때 대물렌즈에 오일을 한 방울 도포하는 것이 좋습니다. 이제 가열 플랫폼과 이미징 챔버를 준비하십시오.

조작의 편의를 위해, 챔버 상단 한쪽 면에 영구 마커로 표시하십시오. 챔버 상단이 위를 향하도록 50 milliliter 튜브 뚜껑 위에 놓으십시오. 이 튜브 뚜껑은 이상적인 챔버 홀더 역할을 합니다.

top이라고 표시된 챔버 측면의 구멍 주변 홈에 그리스를 링 모양으로 도포합니다. 그리스가 챔버 내부로 들어가 관찰 영역이 좁아질 수 있으므로 과하게 사용하지 않도록 주의하십시오. 이때 핀셋을 사용합니다.

깨끗한 미사용 18 centimeter 커버슬립을 챔버의 상단에 부착하십시오. 커버슬립의 가장자리에 가볍게 압력을 가하여 챔버의 오목한 홈 내부에 밀착되도록 합니다. 챔버를 뒤집어 반대편 또는 챔버 하단의 홈에 동일하게 그리스 링을 도포하십시오.

이미징 배지 750 µL를 챔버로 옮깁니다. 이는 다소 많은 양이지만, 그리스가 배지가 넘치는 것을 방지하며, 세포가 도포된 커버 슬립을 덮을 때 기포가 갇히는 것을 방지해 줍니다. 준비된 챔버는 필요할 때까지 조직 배양 인큐베이터에 보관하십시오.

이미징 배지가 증발하여 조성이 변할 수 있으므로 1시간 이상의 장시간 배양은 피해야 합니다. 라이프스타일 이미징을 위한 최종 챔버 조립을 위해, 준비된 챔버와 형질전환된 커버슬립이 담긴 디쉬를 인큐베이터에서 조직 배양 후드로 옮깁니다. 멸균 핀셋을 사용하여 형질전환된 디쉬에서 커버슬립 하나를 조심스럽게 꺼냅니다.

그 다음, 커버슬립의 가장자리를 킴와이프(kim wipe)에 살짝 대어 배양액을 흡수시킵니다. 이어서, 준비된 챔버 위에 커버슬립의 뉴런 면이 아래로 향하게 놓습니다. 커버슬립의 한쪽 면을 그리스에 먼저 접촉시킨 후, 가장자리를 따라 압력을 가해 기포가 생기지 않도록 커버슬립을 평평하게 밀착시킵니다.

과잉의 이미징 배지가 흘러넘칠 것으로 예상되므로, 커버슬립이 위치에서 벗어나지 않도록 주의하며 여분의 이미징 배지를 닦아냅니다. 챔버를 예열된 플랫폼 히터로 옮겨 고정합니다. 다음으로, 광퇴색(photobleaching)과 광독성(phototoxicity)을 줄이기 위해 챔버를 스테이지로 이동시킵니다.

형질전환된 세포를 찾는 데 필요한 최소한의 세기로 램프를 조절하십시오. 이제 분석 대상 세포를 찾습니다. 40x와 같은 저배율 오일 렌즈를 사용할 때는 계획된 탐색 패턴을 따르는 것이 커버슬립 전체 영역을 최대한 훑고 중복된 이미지 획득을 방지하는 데 유리합니다.

원하는 시야를 찾았으면, 관심 있는 형광 표지 단백질의 채널로 전환하십시오. 60~100배율과 같은 고배율 오일 렌즈로 전환하고 램프 강도를 다시 높은 설정으로 되돌리십시오. 빠르게 이동하는 소기관의 형광 표지 단백질 동역학을 기록하려면 스트림 획득(stream acquisition) 또는 이미지 분석 소프트웨어의 유사한 기능을 사용하십시오. 높은 프레임 속도로 기록물을 생성하기 위해 노출 시간과 노출 간 간격을 최소화해야 합니다.

온스크린 미리보기에서 관찰되는 초점 드리프트는 수동 초점 조절을 통해 실시간으로 교정할 수 있습니다. 위상차 이미지 및 추후 분석과 발표에 필요한 기타 관련 이미지들을 반드시 촬영하십시오. 커버슬립을 더 탐색하고 다음 녹화를 진행하기 전에 모든 이미지를 저장하십시오.

통상적으로 하나의 커버슬립에서 3~5개의 녹화 영상을 얻으면 성공적인 것으로 간주하며, 각 커버슬립은 30~60분 동안 이미징합니다. 손상된 세포에서는 운송체(transporter)의 기능이 감소하므로, 일반적인 세포 건강 상태 및 광독성에 유의해야 합니다. 살아있는 세포 이미징 관찰은 일반적으로 시야 내에서 형광 표지된 세포소기관의 이동을 보여주는 이미지 스택(stacks of images) 형태의 녹화 영상으로 구성됩니다. 다음은 조밀심 과립(dense core) iCal 운송의 대표적인 영상입니다.

더 쉬운 관찰을 위해 색상을 반전시켰습니다. 움직이는 입자들에 주목하십시오. CH 그래프는 각 시간 지점이 그래프의 열로 표시되는 라인 스캔을 병치하여 입자의 움직임을 보여주는 이미지입니다.

이 그림은 서로 반대 방향으로 이동하는 두 입자가 CH 그래프에 어떻게 표시되는지를 보여줍니다. 크로노그래프(chronograph)를 추가로 분석하면 입자 플럭스 속도, 주행 길이 반전 및 정지된 입자에 관한 정보를 얻을 수 있습니다. 지금까지 배양된 하마 피질 뉴런에서 dsco 소낭 수송의 고속 녹화 영상을 획득하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, 세포가 배양기에서 스테이지로 이동하는 동안 받는 스트레스를 줄이기 위해 이미징 챔버와 플랫폼의 모든 구성 요소를 미리 가열하는 것이 중요합니다. 신속하면서도 주의 깊게 작업하십시오. 이것으로 모두입니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.