라이브를 떠올리 Drosophila Glial - 신경근육학 융티온

본 절차는 형광 염색을 통해 presynaptic 뉴런 말단을 염색하고, glial 및 postsynaptic 근육 세포막을 대상으로 GFP와 DsRed를 내인성으로 발현시키며, 파라시냅스 공간(parasynaptic space)을 시각화함으로써, 초파리 유충을 뒤집어 체벽 근육 세포 표면과 연관된 운동 뉴런 및 glia 세포를 노출시키는 준비 과정으로 시작합니다. 형광 염색약을 사용하여 살아있는 표본에서 glial 신경근 접합부(glial neuromuscular junction)에서 발생하는 구조적 변화를 명확하게 관찰할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 동물학과 Vanessa의 ALS 연구실 소속 D Brink입니다. 오늘은 공초점 현미경으로 살아있는 초파리 유충 조직을 이미징하기 위한 조직 준비 과정과 두 가지 세포 라벨링 기술을 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 신경 근육 접합부의 글리아 세포를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 완전히 다른 단계로 넘어가겠습니다. 내부 노출 조직 표본 제작은 유충의 단계 설정부터 시작됩니다. 이 절차는 크기가 크고 해부하기 쉬운 3령 방황 유충을 대상으로 시연될 예정이므로, 활발하게 기어 다니는 W3 유충만을 사용하십시오.

다음으로, 이중 증류수가 담긴 페트리 접시에서 매우 부드러운 붓으로 유충의 표면을 닦아냅니다. 유충을 세척하는 것은 광학적 상태를 개선하고 박테리아를 감소시키기 때문에 중요합니다. 유충 세척이 완료되면, 5 mM 글루타메이트가 포함된 얼음처럼 차가운 HL6 배지 3 mL가 담긴 작은 페트리 접시로 옮깁니다.

동물이 움직임을 멈추고 이완될 때까지 배양 접시를 얼음 위에 올려둡니다. 이는 보통 약 2분 정도 소요됩니다. 유충이 움직임을 멈추면, 주로 사용하는 손에 스프링 가위와 매우 미세한 팁 핀셋을 들고 해부 현미경을 사용하여 조직 해부를 시작할 수 있습니다. 다른 한 손으로는 동물을 배양 접시 바닥에 살며시 고정한 상태에서, 가위로 체벽에 작은 구멍을 내어 체벽 전반의 압력을 평형 상태로 맞춥니다.

포셉을 사용하여 뒤쪽의 두 마디를 절단하고 내장 기관을 박리합니다. 절개창을 통해 체강 밖으로 일부 지방체가 밀려 나올 수 있습니다. 이 조직 또한 절단하여 제거합니다.

미세 핀셋을 사용하여 유충을 접시 바닥에 계속해서 부드럽게 누릅니다. 다른 한 손으로 끝이 뭉툭한 0번 곤충 핀을 잡고 유충의 구강 부위를 압박합니다. 주먹에 낀 양말을 뒤집는 것처럼 구강 부위를 체강 쪽으로 밀어 넣습니다.

뒤집힌 조직은 이와 같은 모습이어야 합니다. 초미세 해부용 스프링 가위를 사용하여 체벽에서 지방체와 기관을 분리하십시오. 가능한 한 많은 지방체를 제거하십시오.

기관(trachea)을 당기거나 신경계가 분리되지 않도록 각별히 주의하십시오. 기관이 뜯어지면 체벽 근육에 구멍이 생길 수 있습니다. 해부가 완료되었을 때, 근육은 불투명하거나 수축된 상태가 아니라 반투명하고 이완된 상태여야 합니다.

글루타메이트가 없는 HL 6 용액에 근육을 상온에서 넣으면, 근육이 리듬감 있게 수축할 가능성이 높습니다. 중추신경계(CNS)의 운동 패턴 생성기가 활성화되어 있기 때문에, 온전한 상태의 뒤집힌(inside out) 체벽은 등쪽과 배쪽 정중선을 따라 반으로 접히는 경향이 있습니다. 따라서 이 표본을 통해 동물의 왼쪽 또는 오른쪽 반신을 시각화할 수 있습니다.

마지막으로, 브릿지 커버슬립 배열을 사용하여 조직을 현미경 슬라이드에 마운팅합니다. 조직 마운팅 절차는 이후에 설명하겠습니다. 신경 바톤(neuronal baton)의 라벨링을 시작하려면, HL six에 희석된 형광 표지 1차 anti HRP 항체 용액 30 µL를 피펫으로 취해 페트리 접시에 한 방울 떨어뜨립니다.

다음으로, 뒤집어 준비한 체벽 표본을 염색액에 담급니다. 약 5분 후부터 신경 말단 표지가 보일 수 있으나, 완전하고 선명한 표지를 위해 10분에서 20분 동안 배양하십시오.

과량의 HRP 표지물을 씻어내기 위해, 조직을 실온에서 10~30초 동안 0.5 mL의 HL six에 담급니다. 결합되지 않은 염료는 빠르게 씻겨 나가므로, 세척 주기를 길게 하거나 강하게 할 필요는 없습니다. 이제 표지된 조직을 마운팅하여 현미경으로 관찰할 수 있습니다.

방금 설명한 살아있는 항체 표지 프로토콜의 변형 방법으로는 형광 결합 덱스트린(dextrin)을 사용하여 액체로 채워진 세포 외 공간을 강조하는 방법이 있습니다. 이 절차를 시작하려면 형광 결합 덱스트린 염료를 HL six에 0.001 mg/mL 농도로 희석하십시오. 덱스트린이 세포 외 공간으로 확산되는 정확한 시점에 구애받지 않는다면 덱스트린 농도를 조절해야 할 수도 있습니다.

브릿지 커버슬립 위에 염료 20 µL 한 방울을 피펫으로 분주하고 조직 표본을 염료 욕조로 옮깁니다. 뒤집힌(inside-out) 조직에 관류가 필요 없거나 HL six의 부피를 작게 유지해야 하는 경우, 더블 브릿지 슬라이드에 장착할 수 있습니다. 먼저 매우 깨끗한 현미경 슬라이드 위에 18 mm 정사각형 커버슬립 두 개를 순간접착제로 붙여 고정합니다.

커버 슬립의 가장자리 사이에 2 mm 간격을 두고, 이 간격이 슬라이드의 대략 중앙에 오도록 배치하십시오. 접착제가 완전히 마르도록 두십시오. 그렇지 않으면 조직 준비물 주변의 수성 매질 위에 막이 형성될 수 있습니다.

다음으로, 커버슬립 사이의 간격에 HL six 30 µL 한 방울을 떨어뜨립니다. 뒤집힌 조직을 HL six 방울 위에 배치합니다. 유충의 크기가 크고 이미지 획득 시스템의 픽셀 배열이 제한적인 경우, 조직을 대각선으로 배치해야 할 수도 있습니다.

세 번째 18 millimeter 커버슬립의 가장자리에 바세린을 소량 도포한 후, 조직 위에 접착된 두 개의 커버슬립 위에 그리스가 묻은 면이 아래로 향하게 놓고 가볍게 누릅니다. 다음은 회전 디스크 공초점 현미경으로 얻은 inside-out 유충 표본의 급성 형광 표지 두 가지 방법의 결과입니다. 첫 번째는 live anti HRP로 표지된 Buton 말단이 포함된 신경교-신경-근육 시냅스의 광학 스택 이미지입니다.

근육 세포 표면에서 파란색으로 가상 색상 처리된 밝게 라벨링된 뉴런 bouton 유형의 말단을 확인할 수 있습니다. 이미지 스택의 중간 부분에는 녹색으로 표시된 GFP 라벨링된 글리아 돌기뿐만 아니라 파란색 HRP 라벨링된 baton들이 관찰됩니다. baton들을 둘러싸고 있는 부분에서는 주머니 형태의 SSR(시냅스 망상체, synaptic reticula) 단면을 볼 수 있는데, 이는 중간 스택에서 빨간색으로 표시되며 스택 깊은 곳에는 DS red 라벨링된 SSR이 위치합니다.

SSR은 근육 세포의 특수화된 시냅스 영역입니다. BNS는 근육 세포 내의 포켓에 자리 잡으며, 녹색 글리아 돌기의 일부 또한 마찬가지입니다. 글리아 세포 돌기는 BNS와 SSR 주위에 끼어 들어가지만, 적층의 가장 깊은 층에서처럼 시냅스 표면을 담요처럼 덮지는 않습니다.

초록색의 글리아 돌기와 빨간색의 SSR은 확인되지만, 버튼 말단(buton terminals)은 그만큼 많이 발견되지 않습니다. 또한 근육을 지배하는 운동 신경의 횡단면을 찾을 수 있습니다. 글리아 세포가 운동 신경을 감싸고 있으므로, 이 부분 역시 초록색으로 나타납니다.

inside-out 유충 표본의 급성 형광 표지의 두 번째 결과는 형광 덱스트린으로 표지된 시냅스입니다. 여기에서 시냅스 주변 공간 또는 시냅스 틈의 액체는 빨간색으로 표지됩니다. 광학 스택 이미지의 표면 층에는 빨간색 덱스트린 염료의 액체 층이 있으며, 이것이 근육 세포막의 물결 모양 함몰 부위에 축적되는 것을 확인할 수 있습니다.

스택의 더 깊은 층에서는 형광 덱스트린 염료가 시냅스 틈새로 스며들어, 신경세포 말단과 파란색으로 표지된 SSR 포켓 사이에 작은 도넛 모양의 고리 형태의 염료 풀이 형성됩니다. 이것이 염료로 강조된 시냅스 틈새입니다. 이미지 스택의 더 깊은 층에서 녹색 글리아 라멜라는 틈새로의 염료 침투를 차단하지 않습니다.

가장 두드러진 특징은 파란색으로 표시된 근육의 SSR 또는 시냅스 영역과 초록색의 편평한 글리아 돌기입니다. 마찬가지로, 깊은 층에서 보이는 신경 제거 축삭 주변의 글리아 초(glial sheath)는 초록색입니다. 글리아 초는 덱스트린 염료를 배제하는 것으로 보입니다.

지금까지 초파리 유충의 안팎이 뒤집힌 조직 표본을 통해 글리아-신경-근육 시냅스를 시각화하는 새로운 방법을 보여드렸습니다. 조직을 준비할 때, 조직을 조심스럽게 다루도록 노력하고 근육이 이완된 상태이며 말초 신경이 손상되지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다. 마르크스의 인용구로 마무리하고자 합니다.

시간은 화살처럼 빠르게 흐릅니다. 공포는 바나나처럼 날아갑니다.