라이브를 떠올리 Drosophila Glial - 신경근육학 융티온

이 절차는 초파리 유충을 전시냅스 뉴런 말단에 대한 형광 염색, 신경교세포 및 시냅스후 근육 세포막을 표적으로 하는 GFP 및 DS red의 내인성 발현, 파라스 시냅스 공간의 시각화를 결합하여 체벽, 근육 세포 표면 관련 운동 뉴런 및 ggl 세포를 노출시키기 위해 뒤집어 노출되도록 준비하는 것으로 시작합니다. 신경교신경근접합부(glial neuromuscular junction)에서 발생하는 구조적 변화에 대한 명확한 그림은 실제 제제에서 관찰할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교(University of British Columbia)의 동물학과 바네사(Vanessa)의 ALS 연구실에서 근무하는 D 브링크(D Brink)입니다. 오늘은 컨포칼 현미경 검사를 위해 살아있는 al 유충 조직을 이미징하기 위한 조직 준비와 두 가지 세포 라벨링 기술을 보여드리겠습니다.

우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 신경근 시냅스에서 신경교세포를 연구합니다. 이제 완전히 다른 것을 위해, 인사이드 아웃 조직 준비는 유충의 스테이징으로 시작됩니다. 이 절차는 방황하는 세 번째 유충에서 시연될 것입니다.

다음으로, 이중 증류수가 담긴 페트리 접시에 매우 부드러운 붓으로 유충 표면을 청소하십시오. 유충을 청소하는 것은 더 나은 광학 효과를 얻고 박테리아를 줄이기 때문에 중요합니다. 유충을 청소한 후 얼음처럼 차가운 HL 6 3 밀리리터와 5 밀리몰 글루타메이트가 있는 작은 페트리 접시에 옮깁니다.

동물이 움직임을 멈추고 긴장을 풀 때까지 접시를 얼음 위에 올려 놓는데, 보통 약 2분 정도 걸립니다. 유충이 움직임을 멈추면 주로 사용하는 손에 스프링 가위와 매우 미세한 집게를 들고 해부 현미경을 사용하여 조직 해부를 시작할 수 있습니다. 다른 한편으로, 가위로 체벽에 작은 구멍을 뚫어 체벽을 가로지르는 압력의 평형을 이루면서 동물을 접시 바닥에 부드럽게 잡습니다.

집게로 뒤쪽 두 부분을 잘라내고 내장을 절개합니다. 일부 뚱뚱한 몸은 절개 부위를 통해 체강 밖으로 이동할 수 있습니다. 이 조직도 잘라냅니다.

가는 집게로 유충을 접시 바닥에 부드럽게 계속 잡습니다. 다른 손으로 뭉툭한 끝 번호 0 곤충 핀을 잡고 유충의 입 부분에 밀어 넣습니다. 주먹으로 양말을 뒤집는 것처럼 입 부분을 체강을 통해 밀어 넣습니다.

안쪽 바깥쪽 조직은 다음과 같아야 합니다. 초미세 해부 스프링 가위를 사용하여 체벽에서 지방체와 기관을 해부합니다. 가능한 한 많은 지방을 제거하십시오.

기관을 당기거나 신경계를 분리하지 않도록 매우 열심히 노력하십시오. 기관을 뜯어내면 체벽 근육에 구멍이 뚫립니다. 해부를 마치면 근육이 불투명하거나 수축되지 않고 반투명하고 이완되어야 합니다.

실온에서 글루타메이트가 없는 HL six에 근육을 넣으면 리드미컬하게 수축할 수 있습니다. 중추신경계의 운동 패턴 생성기가 활성화되어 있기 때문에 온전한 내부 외부 체벽은 등쪽 및 복부 정중선을 따라 반으로 접히는 경향이 있습니다. 따라서 준비는 왼쪽 또는 오른쪽 반쪽 동물을 시각화할 수 있도록 합니다.

마지막으로, 브리지가 있는 커버 슬립 배열이 있는 현미경 슬라이드에 조직을 장착합니다. 조직을 장착하는 절차는 나중에 보여줍니다. 뉴런 배턴에 라벨링을 시작하려면 HL 6에 형광 라벨링된 1차 항 HRP 항체 용액 30마이크로리터를 피펫팅하고 페트리 접시에 한 방울 떨어뜨립니다.

다음으로, 몸 벽 준비를 안쪽으로 담그십시오. 거푸집 목욕에서. 약 5분 후에 뉴런 말단 표지를 볼 수 있지만, 완전하고 밝은 표지를 위해 10-20분 동안 배양합니다.

과도한 HRP 라벨을 헹구려면 조직을 HL 6 반 밀리리터에 실온에서 10-30초 동안 넣습니다. 결합되지 않은 염료는 빠르게 헹궈내므로 헹굼 주기가 길거나 격렬할 필요가 없습니다. 이제 라벨링된 조직을 장착하고 현미경으로 시각화할 준비가 되었습니다.

방금 보여준 살아있는 항체 라벨링 프로토콜의 변형은 형광 접합 덱스트린을 사용하여 액체로 채워진 세포 외 공간을 강조하는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 HL six에 형광 접합 덱스트린 염료를 밀리리터당 0.001mg으로 희석합니다. 세포 외 공간으로의 di 축의 정확한 타이밍에 대해 걱정하지 않는 경우 덱스트린 농도를 변경해야 할 수도 있습니다.

20마이크로리터의 염료를 브리지된 덮개에 떨어뜨려 피펫팅하고 티슈 준비물을 염료 수조에 넣습니다. 인사이드 아웃 조직을 관류할 필요가 없거나 HL 6의 부피를 작게 유지해야 하는 경우 이중 브리지 슬라이드에 장착할 수 있습니다. 두 개의 정사각형 18mm 커버 슬립을 매우 깨끗한 현미경 슬라이드에 접착하는 것으로 시작합니다.

덮개 미끄러짐의 가장자리 사이에 2mm의 간격을 두고 간격을 중앙에 놓습니다. 대략 미끄럼틀 중간에 있습니다. 접착제를 완전히 건조시키지 않으면 조직 준비 주위의 수성 매체 위에 필름을 형성합니다.

다음으로, 커버 슬립 사이의 틈새에 HL 6을 30 마이크로 리터 방울 넣으십시오. HL 6의 드롭에 내부 외부 조직을 놓습니다. 유충이 크고 이미지 획득 시스템의 픽셀 배열이 제한된 경우 조직을 대각선으로 배치해야 할 수도 있습니다.

세 번째 18mm 커버 슬립의 가장자리에 소량의 바셀린을 바르고 두 개의 접착 커버 위에 그리스 면이 아래로 향하게 놓습니다. 티슈 위로 미끄러지고 부드럽게 누릅니다. 다음은 회전 디스크 컨포칼 현미경으로 얻은 내부 유충 제제의 급성 형광 표지에 대한 두 가지 방법의 결과입니다. 첫 번째는 살아있는 항 HRP로 표지된 Buton 말단이 있는 신경교신경 근육 시냅스의 광학 스택 이미지입니다.

근육 세포의 표면에서 우리는 파란색으로 pseudo 색상으로 표시된 밝게 표시된 뉴런 부톤 유형 말단을 볼 수 있습니다. 이미지 스택의 중간에는 녹색으로 표시된 GFP 라벨이 붙은 신경교 확장과 파란색 HRP 라벨이 붙은 바톤이 있습니다. 배턴을 돌면 SSR, 서브, 시냅스 소포체와 같은 포켓의 단면을 볼 수 있으며, 이는 중간 스택에서도 빨간색으로 표시되고 스택 깊숙한 곳에는 SSR로 표시된 DS 빨간색이 있습니다.

SSR은 근육 세포의 전문화된 시냅스 영역입니다. bns는 녹색 신경교세포 확장의 일부와 마찬가지로 근육 세포의 주머니 내부에 둥지를 틀고 있습니다. 신경교세포 확장은 BNS와 SSR 주위를 삽입하지만 스택의 가장 깊은 층에 있는 담요처럼 시냅스 표면을 덮지 않습니다.

우리는 녹색 신경교세포 확장과 빨간색 SSR을 발견하지만 부톤 말단은 많지 않습니다. 우리는 또한 근육에 신경을 분포시키는 운동 신경의 단면을 찾을 수 있습니다. 신경교세포(glial cell)는 운동 신경을 감싸고 있기 때문에 녹색입니다.

인사이드 아웃 유충 제제의 급성 형광 표지의 두 번째 결과는 시냅스로 표지된 형광 덱스트린입니다. 여기서, paras 시냅스 공간 또는 시냅스 틈새의 유체는 빨간색으로 표시됩니다. 광학 스택 이미지의 표면층에는 빨간색 덱스트린 염료의 유체 층이 있으며, 근육 원형질막의 잔물결 함몰부에서 이 염료가 축적되는 위치를 볼 수 있습니다.

스택의 더 깊은 층에서 형광 덱스트린 염료는 시냅스 틈새로 스며들었고, 뉴런 말단과 파란색으로 표시된 SSR 포켓 사이에 작은 도넛 모양의 풀 염료 고리가 형성됩니다. 이것은 염료로 강조 표시된 시냅스 틈새입니다. 녹색 신경교세포(glial lamella)는 이미지 스택의 더 깊은 층에서 갈라진 틈으로 염료가 침투하는 것을 차단하지 않습니다.

가장 두드러진 특징은 파란색으로 표시된 근육의 SSR 또는 시냅스 영역과 녹색인 편평한 신경교 신전입니다. 마찬가지로, 깊은 층에서 볼 수 있는 불안한 축삭돌기 주위의 신경교초는 녹색입니다. 신경교초는 덱스트린 염료를 배제하는 것으로 보입니다.

저는 방금 초파리 유충의 인사이드 아웃 조직 준비에서 신경교신경 근육 시냅스를 시각화하는 새로운 방법을 보여드렸습니다. 조직을 준비할 때 조직을 조심스럽게 다루고 근육이 이완되고 말초 신경이 손상되지 않도록 노력하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 마르크스의 말을 인용하며 결론을 맺

시간은 화살처럼 날아갑니다. 두려움은 바나나처럼 날아간다.