해부 및 C. 엘레간스 신경근육학 융티온에서 레코딩

유리 위에 소가(sogar) 한 방울을 펴 바르고 하룻밤 동안 경화시켜 만든 소가 코팅 커버슬립을 미리 제작된 기록 챔버의 원형 공동에 배치하고 기록 용액으로 덮습니다. 중앙에 배치한 벌레의 머리 또는 꼬리부터 시작하여, 글루 피펫을 이용해 벌레의 등 쪽에 접착제를 도포함으로써 실 가드(sill guard) 표면에 고정합니다. 접착이 완료되면, 유리 바늘을 사용하여 큐티클과 접착제 사이의 경계면에서 외음부 인접 부위에 절개를 가하고, 체강에서 내장과 알을 추출한 후 머리 방향으로 절개선을 확장합니다.

절개 부위의 절단면을 접착제로 소가(sogar)에 점용접하여 복측 신경과 체벽 근육을 노출시킵니다. 질(vulva) 앞쪽의 복측 내측 근육에 패치 클램프를 적용하고, 자극 전극을 신경삭의 상류 쪽에 배치합니다. 안녕하세요, 저는 일리노이 대학교 시카고 캠퍼스 생물과학과의 부교수인 Janet Richmond입니다.

오늘은 전기생리학적 기록을 위해 바다 민달팽이의 신경근 접합부를 노출시키는 해부 기술을 보여드리겠습니다. 시냅스 전달을 연구하기 위해 이 표본을 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 선충 실험을 시작하기 전, 최소 하루 전에 몇 가지 도구를 제작해야 합니다. 해부 기록 챔버, S 가드 코팅 글라스 커버슬립, 오래된 피펫, 접착제 도포기 및 추출 피펫이 필요합니다.

먼저 챔버를 제작합니다. 현미경 스테이지 크기에 맞게 1/16인치 두께의 플렉시글라스를 자릅니다. 플렉시글라스의 중앙 부분에서 기록을 수행합니다.

지름 22 millimeter의 원형 커버 글라스 접착제를 수용할 수 있을 만큼 충분한 크기의 원형 구멍을 뚫습니다. 커버 글라스의 각 모서리에 저융점 파라플라크 조직 매립 왁스(low melt para plaque tissue embedding wax) 펠릿을 사용하여, 구멍 아래 챔버의 바닥 면에 48 by 60 millimeter 커버 글라스를 부착합니다. 핫플레이트에서 왁스를 빠르게 녹이면 냉각 후 플렉시글라스와 커버 글라스 슬라이드 사이에 얇은 왁스 층이 형성되며, 이때 남은 과잉 왁스는 칼날로 제거합니다.

챔버에 맞는 커버슬립은 22 millimeter S guard 코팅 커버글라스입니다. SARD가 제대로 작동하려면 제조사의 지침에 따라 새로 제조해야 합니다. 준비가 완료되면, 소량의 SARD를 각 커버글라스 위에 떨어뜨리고 블레이드를 사용하여 고르게 펴 발라 평평한 표면을 만듭니다.

코팅된 커버슬립을 덮개가 있는 용기에 넣고 65 °C 오븐에서 밤새 경화시킵니다. 다음 날이면 프로토콜 전반의 해부 과정에 사용할 준비가 됩니다. 팁의 저항이 약 4 MΩ이 되도록 뽑아낸 외경 1 mm의 실리케이트 유리 피펫이 필요하므로, 이를 보관하는 병을 준비해 두는 것이 좋습니다.

Miriam Goodman이 작성한 프로그래밍 가능한 폴라를 이용한 패치, 피펫 및 샤프 전극 제작에 관한 JoVE 논문을 참조하십시오. 전기생리학 실험을 수행하기 위한 기술적 세부 사항으로, 선충을 제자리에 고정시키기 위해 접착제로 붙여야 합니다. 이를 위해서는 글루 어플리케이터가 필요합니다.

접착제 도포기는 내경이 1 mm인 2 mm 플라스틱 튜브로 간단하게 제작됩니다. 튜브의 한쪽 끝은 입에 물게 되며, 마우스피스를 장착할 수 있습니다. 튜브의 반대쪽 끝에는 접착제가 채워진 1 mm 피펫을 고정합니다.

해부 과정에서는 특수 추출 피펫도 사용됩니다. 이는 접착제 도포기와 마찬가지로 튜브와 피펫으로 구성되어 있으나, 알과 내장을 수용할 수 있도록 피펫 끝부분을 약간 뭉툭하게 처리한 것이 특징입니다. 먼저 챔버의 둘레를 따라 왁스 라인을 그려 작업을 시작하십시오.

이제 Sylgard가 코팅된 커버슬립을 Sylgard 면이 위로 향하게 하여 누르며 배치합니다. 왁스 라인은 커버글라스를 고정시켜 박리 및 기록 과정 중에 기록액이 아래로 스며들어 커버슬립이 이탈하는 것을 방지합니다. 그 다음 챔버를 세포외 기록액으로 채웁니다. 챔버가 준비되면 동봉된 텍스트에서 배합법을 확인하십시오.

네마토드 픽을 사용하여 여러 마리의 네마토드를 용액에 넣습니다. 숙련되면, 추가적인 절차 없이도 헤엄치는 네마토드를 고정시켜 움직임을 방지할 수 있습니다. 왁스나 모델링 점토로 고정한 PCR 캡으로 만든 접착제 용기에 Sano 아크릴 접착제 작동 스톡을 채워 사용하십시오.

기록용 피펫을 접착제 도포기의 끝부분에 부착하여 접착제 도포기 제작을 완료하십시오. 그 다음, 해부 현미경 하에서 입을 이용한 흡입 방식으로 접착제 도포기를 채웁니다. 접착제가 세포 외 기록 용액과 접촉하면 중합되기 때문에, 선충에 접착제를 부착하는 것은 까다로우며 숙련이 필요합니다.

이를 해결하려면 접착제가 계속해서 밖으로 흐르도록 유지하십시오. 그렇지 않으면 접착제가 굳어 피펫이 막힐 수 있습니다. 피펫이 막힌 경우, 팁 끝을 커버슬립에 가볍게 두드려 막힌 부분을 뚫을 수 있습니다. 접착제 사용법을 충분히 연습하십시오.

sil guard 위에 접착제로 이름을 쓸 수 있게 되면, 아마도 네마토드 큐티클을 고정하여 네마토드를 접착할 준비가 된 것입니다. 먼저, 조작 공간이 충분한 챔버 중앙 근처에서 개체를 하나 선택하십시오. 둘째, 네마토드의 머리 또는 꼬리 부분에 소량의 접착제를 바른 후, 네마토드를 sil guard 표면으로 빠르게 끌어내려 고정하십시오.

그런 다음 선충 큐티클의 등쪽 가장자리를 따라 접착제를 얇게 도포합니다. 이렇게 하면 선충이 벌부가 안쪽을 향하는 C자 모양이 됩니다. 선충과 syl guard의 접착력을 극대화하기 위해 접착제 라인에 빈틈이 없도록 채워주어야 합니다.

이 과정은 까다로우므로 저운동성 변이체(hypo motil mutants)를 대상으로 연습하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 31번과 마찬가지로, 바로 오른쪽에 구형 부분이 있습니다. 이제 준비물을 원형으로 이동시킨 다음, 유리 바늘을 가져와 절개를 시작하겠습니다. 큐티클 절개를 하려면 수동 해부 피펫으로 교체하십시오.

이 피펫은 glue recording 피펫보다 더 날카로워야 하며, 최고 배율을 사용했을 때 짧고 견고한 샤프트를 가져야 합니다. 해부 현미경 하에서 피펫을 선충의 세로축과 평행하게 맞춘 다음, 큐티클 glue 인터페이스의 vulva 근처에 팁을 삽입하십시오. 이 절개는 선충의 정수압을 해제하여, 절개 지점을 통해 알과 장이 밖으로 밀려 나오게 합니다.

편지를 뜯는 것과 유사한 슬라이싱 동작으로 인두까지 도달할 때까지 선충의 머리 방향으로 큐티클을 계속해서 절개합니다. 이제 추출 피펫으로 전환하여 선충의 내부 장기를 진공 흡입하여 제거합니다. 절개 부위를 깨끗이 비우면, 열린 큐티클은 원통형 모양을 유지하게 됩니다.

다음으로, 새로운 글루잉 피펫을 준비합니다. 이를 사용하여 절개 부위 가장자리의 큐티클을 syl guard 표면에 점용접합니다. 이 단계에서는 njs가 손상되거나 가려지는 것을 방지하기 위해 접착제 점을 최소한으로 사용하는 것이 중요합니다.

이제 복측 신경삭과 체벽 근육이 노출되었으나, NMJ를 덮고 있는 기저막을 여전히 제거해야 합니다. 이를 위해 챔버에서 세포외 기록액을 흡입하여 제거하고, 0.4 mg/mL 농도의 collagenase가 포함된 세포외 기록액을 처리합니다. 10~20초 후, collagenase를 제거하고 신선한 기록액으로 시료를 여러 번 세척합니다.

이제 선충의 전기생리학적 기록 준비가 완료되었습니다. 정립 현미경 스테이지의 기록 챔버 내 NMJ 위치에서 10배 대물렌즈를 사용하여 선충을 중앙에 맞춘 다음, DIC 광학계가 장착된 40배 수침 대물렌즈로 교체하여 체벽 근육과 신경삭이 온전한지 확인합니다. 전극을 좌우 양측에서 삽입할 수 있도록 선충을 수평으로 배치합니다.

일반적으로 우리는 vulva 내측의 muscles interior to the vulva가 있는 ventral medial body 부위를 패치하지만, 벌레의 dorsal side와 ventral side 양쪽 모두에 있는 근육을 쉽게 패치할 수 있습니다. 근육에 밀착되어 반원형으로 보이는 몇 개의 뉴런이 있습니다. 이제 표준 패치 클램프 기법을 사용하여 근육을 패치하고 gig seal을 형성하십시오. 당사의 경험상 약 4 MΩ 저항의 기록 전극이 whole cell voltage clamp 기록 모드에 적합합니다.

흡입력을 더 높여 gigo 씰이 파열될 때까지 자극하십시오. 앞서 4 MΩ의 저항을 갖추는 것에 대해 이야기했습니다. 저곳을 보시면, 네, 4.9 MΩ이라고 되어 있습니다.

더 크고 정상적입니다. 우리가 사용하는 범위 내에 있습니다. 좋습니다. 이제 본격적으로 시도해 보겠습니다.

뭐라고요? 끝까지 내려오게 하고 싶어요. 네. 알겠습니다. 좋아요.

양질의 기록에서 야생형 성체 선충의 체벽 근육은 일반적으로 약 70 pF의 세포막 커패시턴스를 가지며, 약 50 pA의 최소 유지 전류와 -60 mV의 유지 전위에서 최소 10분 동안 안정적으로 기록될 수 있습니다. 근육 세포의 패치 클램프가 완료되면, 두 번째 전극을 통한 자극, 광활성화 채널인 Rodin의 활성화 또는 고삼투압 용액의 첨가 시 모두 측정 가능한 반응이 생성됩니다. 전기적으로 유도된 반응을 이끌어내기 위해, 일반적으로 패치된 근육의 내측 복측 신경삭 위에 세포외액이 포함된 자극 전극을 배치합니다.

이러한 루즈 패치(loose patch) 구성에서는 10~40V 사이의 전류로 1~2ms의 펄스를 가해야 합니다. 안타깝게도 몇 번의 유발 반응 이후에는 신경삭이 가역 불가능하게 손상되며, 알려지지 않은 이유로 이 구성에서는 콜린성 유발 반응만 이끌어낼 수 있습니다. 대안적으로, 서로 다른 신경세포 집단에서 dosin 트랜스진(transgene) 형태의 빛 활성 채널을 발현하는 선충을 사용하여 방출을 유도할 수 있습니다.

이 방법을 준비하기 위해, 본 실험에 사용되는 선충은 레티놀이 첨가된 박테리아에서 배양되어야 함을 유의하십시오. 본 준비 과정에서는 450~490 nm의 GFP 여기 필터를 통해 여과된 고출력 470 nm LED를 사용하여 채널 옵신을 반복적으로 활성화하며, 이는 채널을 발현하는 세포 유형에 따라 서로 다른 신경전달물질의 유발 방출을 일으킵니다. 마지막으로 검토할 기술은 기록 중인 근육으로 전달되는 여러 뉴런의 시냅스 소포 중 즉각 방출 가능 풀(readily releasable pool)의 크기를 측정하는 데 사용될 수 있습니다.

이는 고삼투성 세포외 용액을 패치된 근육에 1~3초 동안 압력 펄싱하여 수행합니다. 그 결과 비동기적인 시냅스 후 이벤트가 다수 발생하게 됩니다. 위에서 설명한 세 가지 자극 프로토콜인 전기 유도, 빛 유도 및 고삼투성 반응에 대한 전체 세포 전압 고정 체벽 근육 기록이 제시되어 있습니다.

모든 경우에서, 복측 내측 체벽 근육(ventral medial body wall muscle)은 -60 mV로 클램프됩니다. 야생형 근육 세포는 일반적으로 높은 비율의 내인성 내향 미세 시냅스 전류(endogenous inward miniature synaptic currents)를 나타냅니다. 표준 기록 용액 내에서, 전방 복측 신경삭(anterior ventral nerve cord)에 2 ms 동안 탈분극을 가하면 여러 시냅스에서 동시다발적인 방출이 일어나 약 2~2.5 nA의 큰 유발 반응이 나타납니다.

야생형 벌레의 경우, A와 B의 야생형 트레이스 오른쪽에 있는 대표 트레이스는 severely uncoordinated 돌연변이체의 시냅스 방출을 보여줍니다. C 패널은 channel red dosin을 발현하는 야생형 벌레의 신경근 접합부에서 나타나는 빛 유발 반응을 보여줍니다. 콜린성 뉴런에서 2 ms의 광 펄스는 일반적으로 1.5에서 1.8 nA의 반응을 생성합니다. 근육에 850 mOsm의 고삼투압 식염수를 1초 동안 압력 분사하면, 즉시 방출 가능한 소포 풀을 나타내는 미세 시냅스 전류의 비동기적 일제 방출이 일어납니다.

지금까지 sea elegance의 신경근 접합부를 노출시키고 전기생리학적 기록을 수행하기 위해 저희가 사용하는 해부 기술을 보여드렸습니다. 이 기술은 매우 까다로우며, 완전히 숙달하기까지는 아마 수개월이 걸릴 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 하지만 일단 익히고 나면, 자전거를 타는 것처럼 자연스럽게 수행할 수 있게 될 것입니다.

이 기술들은 여러분의 자산이 될 것이며, 반복할수록 준비 과정은 더 빠르고 정확해질 것입니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.