우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 1.

백시니아 바이러스를 사용한 헬라 세포의 시간 경과 감염은 바이러스 감염을 설정하고 세포를 감염시킨 다음 감염 후 여러 시점에서 감염된 세포에서 RNA를 수확하는 것으로 시작됩니다. 이 RNA는 나중에 유전자 발현 분석을 위해 마이크로어레이로의 혼성화를 위해 증폭될 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 화이트헤드 생물의학 연구소(Whitehead Institute for Biomedical Research)의 케이트 어빈스(Kate Irvins) 실험실에서 근무하는 주디 앤(Judy Ann)입니다.

오늘 우리는 포유류 세포에서 백시니아 바이러스에 의한 시간 경과 감염 및 감염 후 다른 시점에서 감염된 세포에서 후속 RNA 추출에 대한 절차를 보여 드리겠습니다. 이 기술은 감염 중 바이러스의 유전자 발현을 평가하기 위해 RNA를 추출하고 증폭하는 것을 목표로 하는 더 큰 프로토콜의 시작 단계이며, 이는 두 개의 다른 JoVE 비디오에서 완료될 것입니다. 이제 시작하겠습니다.감염에 대비하기 위해 헬라 세포와 플라스크를 성장시키고 세포가 약 80% 융합될 때까지 기다립니다.

다음으로, 실험을 위해 충분한 바이러스 성장 배지를 준비해야 합니다. 항생제를 첨가하지 않고 2%FBS를 함유한 일반 DMEM을 사용하면 알려진 역가를 가진 모집된 백시니아 바이러스 재고 또는 알려진 역가를 가진 자당 정제 바이러스로 감염을 수행할 수 있습니다. 숙주 유전자 발현이 걱정되는 경우, 자당 정제 바이러스를 사용하는 경우 다음 세션으로 건너뜁니다.

조잡한 백시니아 바이러스를 사용하는 경우 감염 직전에 바이러스의 비축염 및 분취액을 비축하고 컵을 대부분 얼음과 약간의 물로 20초 동안 약 30W로 초음파 처리합니다. 튜브를 소용돌이치고 초음파 처리를 세 번 반복하여 컵에 얼음을 가득 채우고 식힌 상태로 유지하기 위해 필요한 경우 더 많은 얼음을 추가하고 각 초음파 처리 단계 사이에 소용돌이를 계속하십시오. 컵 테이터가 없는 경우 동일한 부피의 미처리 바이러스 스톡을 밀리리터당 25밀리그램 단위로 혼합하십시오.

트립신 와류는 바이러스를 격렬하게 배양하고 트립을 저장하며 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 혼합합니다. 세포를 감염시키기 위해 5분에서 10분 간격으로 소용돌이. 먼저, 원하는 감염 다중성에서 단층을 감염시키는 데 필요한 바이러스 입자의 양을 계산합니다.

또는 MOI. 일반적으로 5에서 10 사이의 높은 MOI가 감염 시간 경과에 사용됩니다. 다음으로, 섭씨 37도의 바이러스 성장 배지에 원하는 양의 자당 정제 바이러스 또는 트립 조잡 바이러스를 첨가하고 잘 혼합합니다.

플라스크 바닥을 덮을 수 있을 만큼 충분한 매체를 사용해야 합니다. 10ml의 매체는 T 1 75 플라스크에 충분합니다. 세포에서 매체를 제거하고 실온으로 헹굽니다. PBS입니다.

바이러스 또는 바이러스 성장 배지를 각 플라스크에 추가하여 0시간 모의 시점을 표시합니다. 바이러스가 첨가되지 않은 바이러스 성장 배지만 추가하고 부드럽게 소용돌이치며 섭씨 37도의 5%CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 배양한 플레이트를 기울입니다. 15분마다 플레이트를 기울이고 소용돌이치면 바이러스가 균일하게 퍼지고 세포가 촉촉하게 유지됩니다.

배양 후. 바이러스가 들어있는 매체를 제거하고 실온에서 세 번 헹굽니다. PBS입니다. 각 플라스크에 최대량의 바이러스 성장 배지를 추가합니다.

예를 들어, T 1 75 플라스크에 대한 30밀리리터의 매체가 있습니다. 원하는 시점에서 이를 0시 시점으로 계산하기 시작할 수 있습니다. 감염 후. 현미경으로 세포를 확인하고 세포병성 효과 또는 CPE를 기록하십시오.

매체를 제거하고 실온 PBS 30ml로 셀을 헹굽니다. 다음으로, 15ml의 트립신을 세포에 첨가하고 2-5분 동안 배양합니다. 섭씨 37도에서 현미경으로 세포 분리 여부를 확인하고 플라스크를 부드럽게 두드려 세포를 제거합니다.

멸균 혈청학적 피펫으로 세포를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 동일한 부피의 세포 성장 배지로 플라스크를 세척하고 배지를 원뿔형 튜브의 트립신 세포에 추가합니다. 실온에서 500Gs로 5분 동안 셀을 원심분리합니다.

원심분리 후 세포 펠렛 재현탁액, 세포 펠렛, 트리올 시약 또는 원하는 RNA 분리 키트의 용해 완충액에서 tryin 배지를 제거합니다. 트리올을 사용하는 경우 샘플을 1ml 쿼트와 1.5mL 라벨이 붙은 eend dwarf tubes로 나누고 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 모든 시점에 대해 반복합니다.

시점당 하나의 플라스크를 수확합니다. 이 시점에서 샘플을 재현탁하고 트리올 시약을 처리하여 처리할 준비를 해야 합니다. 200마이크로리터의 BCP 상 분리 시약을 추가합니다.

각 튜브에 트리올 1밀리리터당 페놀 대신 BCP 또는 1개의 브로모 3클로로 프로판이 사용됩니다. 게놈 DNA 오염을 줄이려면 샘플을 더 큰 튜브로 옮겨야 할 수도 있습니다. 다량의 triol vortex로 시작하거나 격렬하게 흔들고 배양 후 2-3분 동안 실온에서 배양하는 경우 원심분리 후 15분 동안 12, 000GS에서 샘플을 원심분리하십시오.

획득 단계는 맨 위에 명확한 레이어로 표시되어야 합니다. 무심 단계를 새 튜브로 옮깁니다. 처음 시작한 트리아졸 1밀리리터당 약 600마이크로리터를 회수해야 합니다.

두 번째 페놀 클로로포름 추출을 수행합니다. 이번에는 BCP 대신 1밀리리터 트리아졸당 500마이크로리터의 클로로포름을 사용합니다. 두 번째 클로로포름 추출은 미량이라도 후속 증폭 단계를 억제할 수 있으므로 추출에서 미량의 유기 용매를 제거하는 데 사용됩니다.

소용돌이치거나 세게 흔든 다음 2-3분 동안 실온에서 배양합니다. 12, 000 GS에 표본을 분리기 후에 15 분 동안 원심 분리하십시오. 무심 단계를 새 튜브로 옮깁니다.

수성상(aqueous phase)은 맨 위에 있는 투명한 층이라는 것을 기억하십시오. 다음으로, 각 샘플에 20마이크로그램의 선형 아크릴아미드를 추가합니다. 선형 아크릴아미드는 운반체 역할을 하며 RNA를 침전시키는 데 도움이 됩니다.

처음 사용한 트리올 1ml당 500마이크로리터의 이소프로판올을 각 샘플에 첨가하고 혼합합니다. 원심분리기를 배양한 후 10분 동안 실온에서 샘플을 잘 배양하고 마이크로 원심분리기를 10-15분 동안 최대 속도로 배양합니다. RNA 펠릿은 원심분리 후 튜브 바닥에서 볼 수 있습니다.

매우 조심스럽게 진공 흡입기를 사용하거나 피펫터를 사용하여 수동으로 튜브에서 상등액을 제거합니다. 펠릿을 방해하지 마십시오. 1ml의 70% 에탄올로 펠릿을 세척하고 5-7분 동안 최고 속도로 원심분리기를 세척합니다.

아주 조심스럽게. 진공 흡입기를 사용하거나 피펫터를 사용하여 수동으로 튜브에서 에탄올을 제거합니다. 상등액을 버리십시오.

펠릿이 튜브 바닥에 보이는지 확인하십시오. 상층액을 버린 후 이 세척 단계를 반복합니다. 튜브에서 펠릿이 있는 위치를 표시하십시오.

펠릿을 5분 이상 자연 건조하지 마십시오. 과도하게 건조하지 마십시오 그렇지 않으면 RNA가 재구성되기 어려울 수 있습니다. 다음으로, DNA의 처리가 계획된 소생제인 경우, 펠릿을 17마이크로리터의 뉴클레아제 자유수에 현탁시킵니다.

D'S 치료가 계획되지 않은 경우 20마이크로리터에서 회복을 중단합니다. D'S 치료를 위해 KaiGen RNA free DNA set를 사용하십시오. 2개의 마이크로리터 완충액, RDD 및 1개의 마이크로리터 재구성된 RNA를 무료로 추가합니다.

DNA는 재현탁된 RNA와 1개씩 혼합되어 섭씨 37도에서 30분 동안 부드럽게 배양되었습니다. 다음으로, 2.5 밀리몰 EDTA 2 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 65도에서 5 분 동안 배양합니다. DNA를 비활성화하려면 더 긴 시간과 더 높은 온도가 RNA의 분해를 유발할 수 있으므로 비활성화 시간이나 온도를 초과하지 마십시오.

이제 DNA 처리가 완료되었습니다. 분광 광도계로 RNA 농도를 확인합니다. 미량의 페놀 또는 BCP는 260나노미터의 표준 피크를 넘어 270나노미터에서 스파이크로 검출할 수 있습니다.

추출 후 total RNA의 흡광도를 측정할 때 이러한 오염이 나타나면 증폭을 진행하기 전에 필터 또는 컬럼 기반 RNA 추출 방법을 사용하여 RNA를 후퇴시킵니다. RNA 샘플은 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 원하는 경우 애질런트 바이오분석기를 사용하거나 변성 겔에서 시료를 실행하고 바이오분석기에서 OD 판독값을 확인하여 RNA 품질을 확인할 수 있습니다.

우수한 RNA 품질은 RNA 무결성 번호 또는 RIN으로 표시됩니다. RIN은 1부터 10까지의 번호 매기기 시스템을 기반으로 하며, 1은 가장 성능이 저하된 프로필이고 10은 가장 손상되지 않은 프로필입니다. 방금 백시니아 바이러스로 시간 경과 감염을 수행하는 방법과 감염 후 다양한 시점에서 감염된 세포에서 RNA를 추출하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 동기성 백시니아 감염을 설정하는 데 몇 가지 중요한 단계가 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 먼저 바이러스의 신중한 초음파 처리 또는 트립신 화. 백시니아는 응집되기 쉽기 때문에 바이러스 입자를 분해하는 것이 중요하며, 이는 세포의 균일한 감염을 방지할 수 있습니다.

둘째, 비동기식 감염을 달성하려면 2 이상의 높은 MOI를 사용하여 각 세포가 감염되었는지 확인해야 합니다. 감염된 세포와 감염되지 않은 세포가 혼합되면 여러 차례의 감염, 이질적인 시점 혼합, 비동기식 바이러스 및 숙주 전사 반응이 발생합니다. 셋째, 바이러스가 세포에 최대한 흡수될 수 있도록 최소한의 배지에서 감염이 수행되어야 합니다.

또한 10분마다 플라스크 또는 배양 접시를 정기적으로 흔들면 플라스크 전체에 바이러스가 분포할 수 있고 세포가 건조해지지 않도록 할 수 있습니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.

RNA 샘플의 선형 증폭 절차와 형광 표지된 RNA의 준비 및 정제를 보여주는 이 시리즈의 다른 비디오를 시청하십시오.