Name: 우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 학습하세요 HeLa 세포에 vaccinia virus를 감염시키고 다양한 시간대별 RNA를 추출하여 바이러스 유전자 발현을 분석하는 방법을. 이 기술은 바이러스-숙주 상호작용 연구의 기초가 됩니다.

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1 부 : 감염을 설정 <ol><li> flasks의 헬라 세포 성장과 세포가 약 80 % 합류 때까지 기다립니다. </li><li> 2퍼센트 FBS와 정기 DMEM없이 추가 항생제 : 실험에 대한 충분한 바이러스성 성장 매체를 준비합니다. </li><li> 감염이 중 원유 알려진 titer와 우두 바이러스 재고, 또는 당신이 호스트 유전자 발현이 염려되는 경우에는 알려​​진 titer와 바이러스를 정화 자당과 함께 수행할 수 있습니다. </li><li> 당신이 자당 정화 바이러스를 사용하는 경우, 2 부 직접 진행합니다. </li><li> 방금 전에 감염, 원유 우두 바이러스 주식을 사용하는 경우 대부분 얼음 목욕과 약간의 물과 컵 sonicator에 바이러스의 나누어지는을 sonicate. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 20 초 동안 30W 주변에 Sonicate. </li><li> 소용돌이 튜브를 얼음과 추위로 가득한 컵을 유지하기 위해 필요할 경우 더 많은 얼음을 추가 sonication에게 3 번 반복합니다. </li><li> 각 sonication 단계 사이에 소용돌이. </li><li> 2 부 진행합니다. </li></ul></li><li> 또는, 당신이 컵 sonicator을 가지고하지 않으면 원유 바이러스 주식 및 0.25mg/mL의 트립신의 동일한 음량을 섞는다. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 노골적인 소용돌이. </li><li> 30 분 37 ° C waterbath에 바이러스 재고 / 트립신 믹스를 품어. </li><li> 5-10분 간격으로 소용돌이. </li><li> 2 부 진행합니다. </li></ul></li></ol> 2 부 : 감염 세포 <ol><li> 감염의 원하는 다중성 (뫄)에서 monolayer를 감염하는 데 필요한 바이러스 입자의 양을 계산합니다. 일반적으로, (5 사이 10) 뫄 높은가 감염 timecourses에 사용됩니다. </li><li> 37 자당 정화 바이러스 또는 trypsinized 원유 바이러스의 원하는 금액을 추가 ° C 바이러스성 성장 매체와 잘 섞는다. 당신은 술병의 바닥을 감추기에 충분 할만큼 미디어를 사용해야합니다. 예를 들어, T - 175 플라스크 미디어 10 ML. </li><li> 세포에서 미디어를 제거하고 객실 온도 PBS로 씻어. </li><li> 각 플라스크에 바이러스 / 바이러스 성장 미디어를 추가합니다. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 부드럽게 소용돌이, 37에서 틸트 접시 품어 ° 1 시간 동안 5 % CO2 배양기에서 C. </li><li> 기울기와 소용돌이 접시는 15 분 간격으로 균일하게 바이러스를 확산하고 세포 촉촉한 유지합니다. </li><li> 0hr/Mock의 시점 들어, 바이러스가 추가되지 않는 상태로, 오직 바이러스성 성장 미디어를 추가합니다. </li></ul></li><li> 1 시간 부화 후, 바이러스가 들어있는 미디어를 제거하고 객실 온도 PBS로 세 번 씻어. </li><li> 각 플라스크에 바이러스성 성장 매체의 최대 금액을 추가합니다. 예를 들어, T - 175 플라스크에 대한 미디어의 30 ML. 귀하의 공 인사 시점으로 이것을 계산 시작합니다. </li></ol> 파트 3 : 착취 세포 <ol><li> 현미경 세포를 확인하고 cytopathic 효과 (CPE)를 적어 둡니다. </li><li> 미디어를 제거하고 객실 온도 PBS의 30 ML로 세포를 씻어. </li><li> 세포에 트립신 15 ML을 추가하고 37 2 5 분 대한 품어 ° C. </li><li> 세포 분리에 대한 현미경으로 확인하고 세포를 이동시키다을 부드럽게 휴대용 술병을 누릅니다. </li><li> 50 ML 원뿔 관에 멸균 피펫 serological와 세포를 전송합니다. </li><li> 세포 성장 매체의 동일한 볼륨으로 술병을 세척하고, 원뿔 튜브 trypsinized 세포에 미디어를 추가합니다. </li><li> 상온에서 5 분 300 x g에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 세포 펠렛에서 트립신 / 미디어를 제거합니다. </li><li> 원하는 RNA 격리 키트에서 TRIzol 시약 또는 용해 버퍼 중 하나의 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 당신이 TRIzol를 사용하는 경우 -80에서 1.5mL 표시 Eppendorf 튜브 및 동결 1 ML aliquots에 샘플을 나누어 ° C. </li><li> 시점 당 하나의 휴대용 술병을 수확 모든 시간 지점 반복합니다. </li></ol> 4 부 : TRIzol에서 샘플 RNA 추출 <ol><li> 이 시점에서 당신의 샘플을 처리할 수 준비 TRIzol 시약에 resuspended하고 있어야합니다. </li><li> 각각의 튜브에 TRIzol의 모든 1 ML에 대한 BCP 단계 분리 시약의 200μL를 추가합니다. 당신은 TRIzol 많은 양의와 함께 시작하는 경우 큰 튜브에 샘플을 전송해야 할 수도 있습니다. </li><li> 소용돌이 또는 적극적으로 악수 후 2-3 분 동안 상온에서 알을 품다. </li><li> 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 새로운 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 수성 단계 상단에있는 명확한 계층입니다. 당신은 당신이 밖으로 시작 TRIzol의 모든 1mL 약 600μL 회복해야합니다. </li><li> 대신 BCP의 두 번째 페놀 / 클로로포름 추출, 1 ML TRIzol 당 클로로포름의 500μL를 사용하여이 시간을 마십시오. </li><li> 소용돌이 또는 적극적으로 악수 후 2-3 분 동안 상온에서 알을 품다. </li><li> 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 새로운 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 수성 단계 상단에있는 명확한 계층입니다. </li><li> 각 샘플에 선형 아크릴 아미드의 20μg을 추가합니다. 선형 아크릴 아미드는 항공사로서 역할을하고 RNA을 촉진하는 데 도움이됩니다. </li><li> 추가 500 &amp; MICRO, 이소프로판올의 L은 TRIzol 1 ML 당 당신은 각각의 샘플을 함께 시작 잘 섞는다. </li><li> 10 분 실온에서 샘플을 품어. </li><li> 10-15분에 대해 최대 속도 microcentrifuge에 원심 분리기. </li><li> RNA 펠렛은 튜브의 하단에 표시됩니다. 아주 조심스럽게, 진공 흡인기로하거나, 튜브의 표면에 뜨는를 제거하거나, 수동으로 pipettor로. 펠렛을 방해하지 마십시오. </li><li> 70 % 에탄올 1 ML로 펠렛을 씻으십시오. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 펠렛에 70 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. </li><li> 최고 속도 5-7분에 대한 14,000g을 원심 분리기. </li><li> 아주 조심스럽게, 진공 흡인기로하거나, 튜브에서 에탄올을 제거하거나, 수동으로 pipettor로. 펠렛은 튜브의 하단에 표시되었는지 확인합니다. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li></ul></li><li> 세척 단계를 반복합니다. 뜨는이 삭제되면 펠렛은 튜브에 어디에, 마크. </li><li> 오분 이상 더 이상 공기 건조 펠릿. overdry하지 마십시오, 또는 RNA는 reconstitute하기 어려울 것입니다! </li><li> 이 예제에서 남아있는 DNA를 제거하는 옵션 DNase 처리를 수행하려는 경우 nuclease없는 물을 17μL의 펠렛을 resuspend. 그렇지 않으면, nuclease없는 물을 20μL의 펠렛을 resuspend 22 단계로 진행합니다. </li><li> (옵션 DNase 처리) Qiagen RNase 무료 DNase 세트를 사용하여 2μL 버퍼 RDD와 1μL가 resuspended RNA에 RNase 무료 DNase I을 재구성 추가합니다. 부드럽게 섞는다. </li><li> (옵션 DNase 처리) 37에서 품어 ° C를 30 분. </li><li> (옵션 DNase 처리) 65 2.5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화의 2μL 추가 ° 5 분 C는 DNase를 inactivate 수 있습니다. 더 이상 시간 / 높은 온도는 RNA의 저하를 일으킬 수 있으므로 불활 성화 시간 또는 온도를 초과하지 마십시오. </li><li> 분광 광도계에 의해 RNA 농도를 확인합니다. </li><li> -80 ° C.에서 RNA 샘플을 저장 </li><li> (선택 사항 QC) 애질런트 BioAnalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 확인하거나, denaturing 젤에서 샘플을 실행 OD 판독을 선택하여. (260nm 및 280분의 260 비율) </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

중요 단계 파트 1 &amp; 2 동기 우두 감염을 설정하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다, 바이러스의 첫번째 목표가되어주의 sonication (또는 trypzinizing), 바이러스 입자를 disaggregate하기 위해서. 우두는 통합으로 높은 경향이 있으며, 바이러스 입자의 장애는 세포도 감염을 보장하는 것이 중요합니다. 동기 감염을 달성하기 위해, (2보다 큰) 뫄 높은 각 세포가 감염되었는지 확인하는 데 사용해야합니다. 감염과 감염되지 않은 세포의 혼합 감염의 여러 회진 시간 지점의 이기종 혼합물, 그리고 비동기 바이러스성 및 호스트 transcriptional 반응으로 이어질 것입니다. 감염은 세포에 바이러스의 최대 흡착을 허용하는 미디어의 최소 금액에 실시해야합니다. 또한, flasks 또는 문화 요리 (10 분 간격)의 정기적인 흔들림은 술병에 걸쳐 바이러스의 배포를 가능하게하고 세포가 건조하지 않도록 보장합니다....

<table><tbody><tr><td>TRIzol 시약</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Roche의 TriPure와 같은 유사한 시약도 사용 가능합니다.</td></tr><tr><td>BCP 상분리 시약</td><td>시약</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase 세트</td><td>시약</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNase 처리는 선택 사항입니다.</td></tr></tbody></table>

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

가족<em&gt; Poxviridae</em&gt; 감염된 세포의 세포질에서 독점적으로 복제 바이러스를 포함하는 대형 더블 - 좌초된 DNA로 구성되어 있습니다. 회원<em&gt; orthopox</em&gt; 속 포함 천연두, 인간 작은 수두의 원인이되는 대리인, monkeypox, 그리고 우두 (VAC), 바이러스 제품군의 prototypic 회원. 비교적 큰 (~ 2백킬로바이트) 우두 게놈 내에서 유전자의 세 클래스가 인코딩됩니다 : 초기, 중간, 그리고 늦었어요. 세 클래스가 virally 인코딩 RNA의 polymerases에 의해 베꼈는데 있지만, 각 클래스는 바이러스의 생활주기에서 다른 기능을 제공합니다. Poxviruses 감염 동안에 호스트 세포 환경의 변조에 대해 여러 전략을 활용합니다. 두 호스트 및 바이러스 유전자 발현의 조절을 이해하기 위해서, 우리는 바이러스와 호스트 세포 모두에서 사본의 풍요로움을 분석하는 게놈 차원의 접근법을 활용했습니다. 여기서 우리는 몇 시간이 지점 후 감염에 우두 바이러스와 샘플링 RNA와 헬라 세포의 시간 코스 감염을 보여줍니다. 두 호스트 및 바이러스 총 RNA는 격리 및 유전자 발현 분석을 위해 microarrays에 하이브 리다이 제이션에 대한 증폭됩니다.

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 1.

Poxviridae과는 감염된 세포의 세포질에서만 복제되는 대형 이중 가닥 DNA 함유 바이러스들로 구성됩니다. ...의 구성원은

백시니아 바이러스를 이용한 HeLa 세포의 시간 경과 감염 실험은 바이러스 감염 환경 조성, 세포 감염, 그리고 감염 후 여러 시점에서 감염된 세포로부터 RNA를 회수하는 과정으로 시작됩니다. 이렇게 얻은 RNA는 이후 증폭 과정을 거쳐 마이크로어레이 하이브리다이제이션에 사용되며, 이를 통해 유전자 발현을 분석할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 화이트헤드 생물의학 연구소의 Kate Irvins 실험실 소속 Judy Ann입니다.오늘은 포유류 세포에서 백시니아 바이러스(vaccinia virus)를 이용한 시계열 감염 절차와 감염 후 각 시간대별로 감염된 세포에서 RNA를 추출하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 기술은 감염 중 바이러스의 유전자 발현을 평가하기 위해 RNA를 추출하고 증폭하는 더 큰 프로토콜의 시작 단계이며, 전체 과정은 다른 두 개의 JoVE 비디오에서 마무리될 예정입니다. 그럼 시작하겠습니다. 감염 준비를 위해 HeLa 세포를 플라스크에서 배양하고, 세포의 밀도가 약 80% confluency에 도달할 때까지 기다립니다.다음으로, 실험에 충분한 양의 바이러스 성장 배지를 준비하십시오. 2% FBS가 포함되고 항생제가 첨가되지 않은 일반 DMEM을 사용하여, 역가를 알고 있는 확보된 백시니아 바이러스 스톡 또는 역가를 알고 있는 수크로스로 정제된 바이러스를 이용해 감염을 수행할 수 있습니다. 숙주 유전자 발현이 우려되며 수크로스로 정제된 바이러스를 사용하는 경우에는 다음 세션으로 넘어가십시오.정제되지 않은 vaccinia virus를 사용하는 경우, 감염 직전에 바이러스 스톡을 초음파 처리하여 분주하십시오. 얼음과 소량의 물이 담긴 비이커에서 약 30 W로 20초 동안 초음파 처리합니다. 튜브를 볼텍싱하고, 필요에 따라 얼음을 더 추가하여 비이커를 계속 채우고 냉각 상태를 유지하면서 초음파 처리를 총 3회 반복하십시오. 이때 각 초음파 처리 단계 사이에 반드시 볼텍싱을 수행해야 합니다. cup ator가 없는 경우에는 정제되지 않은 바이러스 스톡과 0.25 mg/mL의 동일한 부피를 혼합하십시오.바이러스 stock을 Trypsin과 함께 강하게 vortexing하여 혼합한 후 37 °C 항온수조에서 30분 동안 배양합니다. 세포를 감염시키기 위해 5~10분 간격으로 vortexing합니다. 먼저, 원하는 감염다중도(multiplicity of infection)로 단층 세포를 감염시키는 데 필요한 바이러스 입자 수를 계산합니다.또는 MOI를 사용합니다. 일반적으로 감염 시간 경과 관찰(time courses)에는 5에서 10 사이의 높은 MOI가 사용됩니다. 다음으로, 원하는 양의 sucrose 정제 바이러스 또는 tryp 조바이러스(crude virus)를 37 °C의 바이러스 성장 배지에 넣고 잘 섞어줍니다.플라스크 바닥을 겨우 덮을 정도의 충분한 배지를 사용해야 합니다. T 1 75 플라스크의 경우 10 milliliters의 배지로 충분합니다. 세포에서 배지를 제거하고 상온의 PBS로 헹구어 줍니다.0시간째의 모의 대조군 시점을 위해 각 플라스크에 바이러스 또는 바이러스 배양액을 첨가합니다. 바이러스 없이 바이러스 배양액만 첨가한 후, 조심스럽게 흔들어 섞어주고 플레이트를 기울인 상태로 5% CO2 배양기 내 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 바이러스가 균일하게 퍼지고 세포가 건조해지지 않도록 15분마다 플레이트를 기울여 흔들어 줍니다.배양 후, 바이러스가 포함된 배지를 제거하고 상온의 PBS로 3회 세척하십시오. 각 플라스크에 바이러스 성장 배지를 최대량으로 추가하십시오.예를 들어, T 1 75 플라스크용 배지 30 milliliters를 사용합니다. 원하는 시점에서 이를 0시간 시간점으로 설정하여 카운트를 시작할 수 있습니다. 감염 후, 현미경으로 세포를 관찰하여 세포변성효과 또는 CPE가 있는지 확인하십시오.배지를 제거하고 실온의 PBS 30 milliliters로 세포를 헹굽니다. 다음으로, 세포에 trypsin 15 milliliters를 첨가하고 2~5분 동안 배양합니다. 37 °C에서 현미경으로 세포의 박리 여부를 확인하고, 플라스크를 가볍게 두드려 세포를 떼어냅니다.멸균된 세롤로지컬 피펫을 사용하여 세포를 50 milliliter 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 플라스크를 동일한 부피의 세포 성장 배지로 세척하고, 이 배지를 원심분리관 내의 트립신 처리된 세포에 첨가합니다. 실온에서 500 Gs로 5분 동안 세포를 원심분리합니다.원심분리 후, 세포 펠렛에서 트라이psin 배지를 제거하고 세포 펠렛을 재현탁하며, 원하는 RNA 분리 키트의 TRIzol 시약 또는 용해 버퍼를 첨가합니다. TRIzol을 사용하는 경우, 샘플을 1 mL씩 나누어 라벨이 부착된 1.5 mL 마이크로 튜브에 넣고 -80 °C에서 냉동 보관합니다. 모든 시간대에 대해 이 과정을 반복합니다.시간대별로 플라스크 하나씩을 수확합니다. 이 시점에서 샘플은 재부유 및 triol 시약 처리가 완료되어 분석 준비가 되어 있어야 합니다. BCP 상분리 시약 200 µL를 첨가합니다.각 튜브의 triol 1 mL당 phenol 대신 BCP 또는 1-bromo-3-chloropropane을 사용합니다. 게놈 DNA 오염을 줄이기 위해 샘플을 더 큰 튜브로 옮겨야 할 수도 있습니다. 많은 양의 triol로 시작하는 경우, 볼텍싱하거나 격렬하게 흔든 후 실온에서 2~3분 동안 배양하십시오. 배양 후 샘플을 12,000 ×g에서 15분 동안 원심 분리하십시오.상층부에 투명한 층으로 수층이 보여야 합니다. 수층을 새 튜브로 옮깁니다. 처음 사용한 triazole 1 mL당 약 600 µL를 회수하게 됩니다.두 번째 페놀 클로로포름 추출을 수행합니다. 이번에는 BCP 대신 triazole 1 mL당 500 µL의 클로로포름을 사용합니다. 두 번째 클로로포름 추출은 추출 과정에서 남은 유기 용매의 흔적을 제거하기 위해 수행하며, 극미량의 용매라도 이후의 증폭 단계를 억제할 수 있기 때문입니다.볼텍스 처리하거나 격렬하게 흔든 후, 상온에서 2~3분 동안 배양합니다. 12,000 g에서 15분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.수성층이 상단의 투명한 층임을 기억하십시오. 다음으로, 각 샘플에 20 micrograms의 선형 아크릴아마이드를 첨가합니다. 선형 아크릴아마이드는 운반체 역할을 하여 RNA의 침전을 돕습니다.시작 시 사용한 triol 1 mL당 500 µL의 isopropanol을 각 샘플에 첨가하고 혼합합니다. 샘플을 상온에서 10분 동안 배양한 후, 마이크로 원심분리기를 사용하여 최대 속도로 10~15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브 바닥에서 RNA 펠릿을 확인할 수 있습니다.진공 흡입기나 피펫을 사용하여 튜브에서 상층액을 매우 조심스럽게 제거합니다. 이때 펠렛이 섞이지 않도록 주의하십시오. 1 mL의 70% ethanol로 펠렛을 세척한 후, 최고 속도로 5~7분 동안 원심분리합니다.매우 주의하여 수행하십시오. 진공 흡입기나 피펫을 사용하여 튜브에서 에탄올을 제거합니다. 상층액은 폐기하십시오.튜브 바닥에 펠렛(pellet)이 보이는지 확인하십시오. 상층액을 제거한 후 이 세척 단계를 반복하십시오. 튜브의 펠렛 위치를 표시하십시오.펠렛을 5분 이내로 공기 건조하십시오. 과하게 건조하면 RNA를 재용해하기 어려울 수 있습니다. 다음으로, DNA 처리 단계가 계획되어 있다면 펠렛을 17 µL의 nuclease free water에 현탁하십시오.D'S 처리를 계획하지 않은 경우, 20 µL로 재현탁하십시오. D'S 처리를 하려면 KaiGen RNA free DNA set를 사용하십시오. 2 µL의 buffer, RDD와 1 µL의 reconstituted RNAs free를 첨가하십시오.재현탁한 RNA에 DNAse 1을 넣고 가볍게 섞은 후 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로 2.5 mM EDTA 2 µL를 첨가하고 65 °C에서 5분 동안 배양합니다. DNA를 불활성화할 때, 배양 시간이나 온도가 너무 길거나 높으면 RNA가 분해될 수 있으므로 이를 초과하지 않도록 주의하십시오.이제 DNA 처리가 완료되었습니다. 분광광도계를 사용하여 RNA 농도를 확인하십시오. 페놀이나 BCP의 흔적은 표준 피크인 260 nanometers 외에 270 nanometers에서 스파이크 형태로 검출될 수 있습니다.추출 후 총 RNA의 흡광도를 측정했을 때 이러한 오염이 나타나면, 증폭을 진행하기 전에 필터 또는 컬럼 기반의 RNA 추출 방법을 사용하여 RNA를 정제하십시오. RNA 샘플은 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 원할 경우, Agilent bioanalyzer를 사용하거나 샘플을 변성 젤(denaturing gel)로 전기영동하여 bioanalyzer의 OD 측정값을 확인함으로써 RNA의 품질을 확인할 수 있습니다.양호한 RNA 품질은 RNA 무결성 수치(RNA integrity number) 또는 RIN으로 나타냅니다. RIN은 1부터 10까지의 숫자 체계를 기반으로 하며, 1은 가장 분해된 상태를, 10은 가장 온전한 상태를 의미합니다. 지금까지 백시니아 바이러스를 이용한 시간 경과 감염 수행 방법과 감염 후 다양한 시점에서 감염된 세포로부터 RNA를 추출하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때, 동기화된 백시니아(vaccinia) 감염을 설정하는 데 있어 몇 가지 중요한 단계가 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 첫째는 바이러스의 세심한 초음파 처리 또는 트립신 처리입니다. 백시니아는 응집되기 매우 쉬우므로 바이러스 입자를 분산시키는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 세포에 균일하게 감염되는 것을 방해할 수 있습니다.둘째, 비동기적 감염을 방지하기 위해 모든 세포가 확실히 감염되도록 2 이상의 높은 MOI를 사용해야 합니다. 감염된 세포와 감염되지 않은 세포가 섞여 있으면 여러 차례의 감염 단계가 발생하고, 시점별로 불균일한 혼합물이 형성되며, 바이러스 및 숙주의 전사 반응이 비동기적으로 나타나게 됩니다. 셋째, 바이러스가 세포에 최대한 흡수될 수 있도록 최소량의 배지에서 감염을 진행해야 합니다.또한, 10분마다 플라스크나 배양 접시를 정기적으로 흔들어 주면 바이러스가 플라스크 전체에 분산되며 세포가 건조해지는 것을 방지할 수 있습니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.RNA 샘플의 선형 증폭 절차와 형광 표지 RNA의 준비 및 정제 과정을 보여주는 이 시리즈의 다른 영상들도 꼭 시청하시기 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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