Name: 우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 학습하세요 HeLa 세포에 vaccinia virus를 감염시키고 다양한 시간대별 RNA를 추출하여 바이러스 유전자 발현을 분석하는 방법을. 이 기술은 바이러스-숙주 상호작용 연구의 기초가 됩니다.

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1 부 : 감염을 설정 <ol><li> flasks의 헬라 세포 성장과 세포가 약 80 % 합류 때까지 기다립니다. </li><li> 2퍼센트 FBS와 정기 DMEM없이 추가 항생제 : 실험에 대한 충분한 바이러스성 성장 매체를 준비합니다. </li><li> 감염이 중 원유 알려진 titer와 우두 바이러스 재고, 또는 당신이 호스트 유전자 발현이 염려되는 경우에는 알려​​진 titer와 바이러스를 정화 자당과 함께 수행할 수 있습니다. </li><li> 당신이 자당 정화 바이러스를 사용하는 경우, 2 부 직접 진행합니다. </li><li> 방금 전에 감염, 원유 우두 바이러스 주식을 사용하는 경우 대부분 얼음 목욕과 약간의 물과 컵 sonicator에 바이러스의 나누어지는을 sonicate. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 20 초 동안 30W 주변에 Sonicate. </li><li> 소용돌이 튜브를 얼음과 추위로 가득한 컵을 유지하기 위해 필요할 경우 더 많은 얼음을 추가 sonication에게 3 번 반복합니다. </li><li> 각 sonication 단계 사이에 소용돌이. </li><li> 2 부 진행합니다. </li></ul></li><li> 또는, 당신이 컵 sonicator을 가지고하지 않으면 원유 바이러스 주식 및 0.25mg/mL의 트립신의 동일한 음량을 섞는다. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 노골적인 소용돌이. </li><li> 30 분 37 ° C waterbath에 바이러스 재고 / 트립신 믹스를 품어. </li><li> 5-10분 간격으로 소용돌이. </li><li> 2 부 진행합니다. </li></ul></li></ol> 2 부 : 감염 세포 <ol><li> 감염의 원하는 다중성 (뫄)에서 monolayer를 감염하는 데 필요한 바이러스 입자의 양을 계산합니다. 일반적으로, (5 사이 10) 뫄 높은가 감염 timecourses에 사용됩니다. </li><li> 37 자당 정화 바이러스 또는 trypsinized 원유 바이러스의 원하는 금액을 추가 ° C 바이러스성 성장 매체와 잘 섞는다. 당신은 술병의 바닥을 감추기에 충분 할만큼 미디어를 사용해야합니다. 예를 들어, T - 175 플라스크 미디어 10 ML. </li><li> 세포에서 미디어를 제거하고 객실 온도 PBS로 씻어. </li><li> 각 플라스크에 바이러스 / 바이러스 성장 미디어를 추가합니다. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 부드럽게 소용돌이, 37에서 틸트 접시 품어 ° 1 시간 동안 5 % CO2 배양기에서 C. </li><li> 기울기와 소용돌이 접시는 15 분 간격으로 균일하게 바이러스를 확산하고 세포 촉촉한 유지합니다. </li><li> 0hr/Mock의 시점 들어, 바이러스가 추가되지 않는 상태로, 오직 바이러스성 성장 미디어를 추가합니다. </li></ul></li><li> 1 시간 부화 후, 바이러스가 들어있는 미디어를 제거하고 객실 온도 PBS로 세 번 씻어. </li><li> 각 플라스크에 바이러스성 성장 매체의 최대 금액을 추가합니다. 예를 들어, T - 175 플라스크에 대한 미디어의 30 ML. 귀하의 공 인사 시점으로 이것을 계산 시작합니다. </li></ol> 파트 3 : 착취 세포 <ol><li> 현미경 세포를 확인하고 cytopathic 효과 (CPE)를 적어 둡니다. </li><li> 미디어를 제거하고 객실 온도 PBS의 30 ML로 세포를 씻어. </li><li> 세포에 트립신 15 ML을 추가하고 37 2 5 분 대한 품어 ° C. </li><li> 세포 분리에 대한 현미경으로 확인하고 세포를 이동시키다을 부드럽게 휴대용 술병을 누릅니다. </li><li> 50 ML 원뿔 관에 멸균 피펫 serological와 세포를 전송합니다. </li><li> 세포 성장 매체의 동일한 볼륨으로 술병을 세척하고, 원뿔 튜브 trypsinized 세포에 미디어를 추가합니다. </li><li> 상온에서 5 분 300 x g에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 세포 펠렛에서 트립신 / 미디어를 제거합니다. </li><li> 원하는 RNA 격리 키트에서 TRIzol 시약 또는 용해 버퍼 중 하나의 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 당신이 TRIzol를 사용하는 경우 -80에서 1.5mL 표시 Eppendorf 튜브 및 동결 1 ML aliquots에 샘플을 나누어 ° C. </li><li> 시점 당 하나의 휴대용 술병을 수확 모든 시간 지점 반복합니다. </li></ol> 4 부 : TRIzol에서 샘플 RNA 추출 <ol><li> 이 시점에서 당신의 샘플을 처리할 수 준비 TRIzol 시약에 resuspended하고 있어야합니다. </li><li> 각각의 튜브에 TRIzol의 모든 1 ML에 대한 BCP 단계 분리 시약의 200μL를 추가합니다. 당신은 TRIzol 많은 양의와 함께 시작하는 경우 큰 튜브에 샘플을 전송해야 할 수도 있습니다. </li><li> 소용돌이 또는 적극적으로 악수 후 2-3 분 동안 상온에서 알을 품다. </li><li> 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 새로운 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 수성 단계 상단에있는 명확한 계층입니다. 당신은 당신이 밖으로 시작 TRIzol의 모든 1mL 약 600μL 회복해야합니다. </li><li> 대신 BCP의 두 번째 페놀 / 클로로포름 추출, 1 ML TRIzol 당 클로로포름의 500μL를 사용하여이 시간을 마십시오. </li><li> 소용돌이 또는 적극적으로 악수 후 2-3 분 동안 상온에서 알을 품다. </li><li> 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 새로운 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 수성 단계 상단에있는 명확한 계층입니다. </li><li> 각 샘플에 선형 아크릴 아미드의 20μg을 추가합니다. 선형 아크릴 아미드는 항공사로서 역할을하고 RNA을 촉진하는 데 도움이됩니다. </li><li> 추가 500 &amp; MICRO, 이소프로판올의 L은 TRIzol 1 ML 당 당신은 각각의 샘플을 함께 시작 잘 섞는다. </li><li> 10 분 실온에서 샘플을 품어. </li><li> 10-15분에 대해 최대 속도 microcentrifuge에 원심 분리기. </li><li> RNA 펠렛은 튜브의 하단에 표시됩니다. 아주 조심스럽게, 진공 흡인기로하거나, 튜브의 표면에 뜨는를 제거하거나, 수동으로 pipettor로. 펠렛을 방해하지 마십시오. </li><li> 70 % 에탄올 1 ML로 펠렛을 씻으십시오. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 펠렛에 70 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. </li><li> 최고 속도 5-7분에 대한 14,000g을 원심 분리기. </li><li> 아주 조심스럽게, 진공 흡인기로하거나, 튜브에서 에탄올을 제거하거나, 수동으로 pipettor로. 펠렛은 튜브의 하단에 표시되었는지 확인합니다. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li></ul></li><li> 세척 단계를 반복합니다. 뜨는이 삭제되면 펠렛은 튜브에 어디에, 마크. </li><li> 오분 이상 더 이상 공기 건조 펠릿. overdry하지 마십시오, 또는 RNA는 reconstitute하기 어려울 것입니다! </li><li> 이 예제에서 남아있는 DNA를 제거하는 옵션 DNase 처리를 수행하려는 경우 nuclease없는 물을 17μL의 펠렛을 resuspend. 그렇지 않으면, nuclease없는 물을 20μL의 펠렛을 resuspend 22 단계로 진행합니다. </li><li> (옵션 DNase 처리) Qiagen RNase 무료 DNase 세트를 사용하여 2μL 버퍼 RDD와 1μL가 resuspended RNA에 RNase 무료 DNase I을 재구성 추가합니다. 부드럽게 섞는다. </li><li> (옵션 DNase 처리) 37에서 품어 ° C를 30 분. </li><li> (옵션 DNase 처리) 65 2.5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화의 2μL 추가 ° 5 분 C는 DNase를 inactivate 수 있습니다. 더 이상 시간 / 높은 온도는 RNA의 저하를 일으킬 수 있으므로 불활 성화 시간 또는 온도를 초과하지 마십시오. </li><li> 분광 광도계에 의해 RNA 농도를 확인합니다. </li><li> -80 ° C.에서 RNA 샘플을 저장 </li><li> (선택 사항 QC) 애질런트 BioAnalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 확인하거나, denaturing 젤에서 샘플을 실행 OD 판독을 선택하여. (260nm 및 280분의 260 비율) </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

중요 단계 파트 1 &amp; 2 동기 우두 감염을 설정하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다, 바이러스의 첫번째 목표가되어주의 sonication (또는 trypzinizing), 바이러스 입자를 disaggregate하기 위해서. 우두는 통합으로 높은 경향이 있으며, 바이러스 입자의 장애는 세포도 감염을 보장하는 것이 중요합니다. 동기 감염을 달성하기 위해, (2보다 큰) 뫄 높은 각 세포가 감염되었는지 확인하는 데 사용해야합니다. 감염과 감염되지 않은 세포의 혼합 감염의 여러 회진 시간 지점의 이기종 혼합물, 그리고 비동기 바이러스성 및 호스트 transcriptional 반응으로 이어질 것입니다. 감염은 세포에 바이러스의 최대 흡착을 허용하는 미디어의 최소 금액에 실시해야합니다. 또한, flasks 또는 문화 요리 (10 분 간격)의 정기적인 흔들림은 술병에 걸쳐 바이러스의 배포를 가능하게하고 세포가 건조하지 않도록 보장합니다....

<table><tbody><tr><td>TRIzol 시약</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Roche의 TriPure와 같은 유사한 시약도 사용 가능합니다.</td></tr><tr><td>BCP 상분리 시약</td><td>시약</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase 세트</td><td>시약</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNase 처리는 선택 사항입니다.</td></tr></tbody></table>

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

가족<em&gt; Poxviridae</em&gt; 감염된 세포의 세포질에서 독점적으로 복제 바이러스를 포함하는 대형 더블 - 좌초된 DNA로 구성되어 있습니다. 회원<em&gt; orthopox</em&gt; 속 포함 천연두, 인간 작은 수두의 원인이되는 대리인, monkeypox, 그리고 우두 (VAC), 바이러스 제품군의 prototypic 회원. 비교적 큰 (~ 2백킬로바이트) 우두 게놈 내에서 유전자의 세 클래스가 인코딩됩니다 : 초기, 중간, 그리고 늦었어요. 세 클래스가 virally 인코딩 RNA의 polymerases에 의해 베꼈는데 있지만, 각 클래스는 바이러스의 생활주기에서 다른 기능을 제공합니다. Poxviruses 감염 동안에 호스트 세포 환경의 변조에 대해 여러 전략을 활용합니다. 두 호스트 및 바이러스 유전자 발현의 조절을 이해하기 위해서, 우리는 바이러스와 호스트 세포 모두에서 사본의 풍요로움을 분석하는 게놈 차원의 접근법을 활용했습니다. 여기서 우리는 몇 시간이 지점 후 감염에 우두 바이러스와 샘플링 RNA와 헬라 세포의 시간 코스 감염을 보여줍니다. 두 호스트 및 바이러스 총 RNA는 격리 및 유전자 발현 분석을 위해 microarrays에 하이브 리다이 제이션에 대한 증폭됩니다.

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 1.

Poxviridae과는 감염된 세포의 세포질에서만 복제되는 대형 이중 가닥 DNA 함유 바이러스들로 구성됩니다. ...의 구성원은

백시니아 바이러스를 이용한 HeLa 세포의 시간 경과 감염 실험은 바이러스 감염 환경 조성, 세포 감염, 그리고 감염 후 여러 시점에서 감염된 세포로부터 RNA를 회수하는 과정으로 시작됩니다. 이렇게 얻은 RNA는 이후 증폭 과정을 거쳐 마이크로어레이 하이브리다이제이션에 사용되며, 이를 통해 유전자 발현을 분석할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 화이트헤드 생물의학 연구소의 Kate Irvins 실험실 소속 Judy Ann입니다.오늘은 포유류 세포에서 백시니아 바이러스(vaccinia virus)를 이용한 시계열 감염 절차와 감염 후 각 시간대별로 감염된 세포에서 RNA를 추출하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 기술은 감염 중 바이러스의 유전자 발현을 평가하기 위해 RNA를 추출하고 증폭하는 더 큰 프로토콜의 시작 단계이며, 전체 과정은 다른 두 개의 JoVE 비디오에서 마무리될 예정입니다. 그럼 시작하겠습니다. 감염 준비를 위해 HeLa 세포를 플라스크에서 배양하고, 세포의 밀도가 약 80% confluency에 도달할 때까지 기다립니다.다음으로, 실험에 충분한 양의 바이러스 성장 배지를 준비하십시오. 2% FBS가 포함되고 항생제가 첨가되지 않은 일반 DMEM을 사용하여, 역가를 알고 있는 확보된 백시니아 바이러스 스톡 또는 역가를 알고 있는 수크로스로 정제된 바이러스를 이용해 감염을 수행할 수 있습니다. 숙주 유전자 발현이 우려되며 수크로스로 정제된 바이러스를 사용하는 경우에는 다음 세션으로 넘어가십시오.정제되지 않은 vaccinia virus를 사용하는 경우, 감염 직전에 바이러스 스톡을 초음파 처리하여 분주하십시오. 얼음과 소량의 물이 담긴 비이커에서 약 30 W로 20초 동안 초음파 처리합니다. 튜브를 볼텍싱하고, 필요에 따라 얼음을 더 추가하여 비이커를 계속 채우고 냉각 상태를 유지하면서 초음파 처리를 총 3회 반복하십시오. 이때 각 초음파 처리 단계 사이에 반드시 볼텍싱을 수행해야 합니다. cup ator가 없는 경우에는 정제되지 않은 바이러스 스톡과 0.25 mg/mL의 동일한 부피를 혼합하십시오.바이러스 stock을 Trypsin과 함께 강하게 vortexing하여 혼합한 후 37 °C 항온수조에서 30분 동안 배양합니다. 세포를 감염시키기 위해 5~10분 간격으로 vortexing합니다. 먼저, 원하는 감염다중도(multiplicity of infection)로 단층 세포를 감염시키는 데 필요한

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연구

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Biology

생물학

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 2.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 파트 3 찬란 염료의 아미노 알릴 결합에 의해 두 호스트 및 바이러스 샘플에서 증폭된 RNA를 라벨링 과정을 설명합니다. 3 부 3.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 제 3

바이러스 감염에 관련된 소설 호스트 요소는 기능 RNAi 심사의 셀 기반의 게놈 전체의 손실을 통해 확인할 수 있습니다.

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

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모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

synaptically 연결 뉴런을 추적하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 관심의 세포 인구가 유전자 정의 셀 유형에서 시냅스 입력을 받고 있는지 여부를 조사하기 위해 상류 세포의 TVA의 특이성을 사용합니다.

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

과도 우세 선택 방법을 이용하여 동시에 형광 태그단백질을 발현하는 재조합 암시니아 바이러스의 생성을 위한 신속하고 모듈식 프로토콜이 여기에 설명되어 있다.

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