Name: 우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 학습하세요 HeLa 세포에서 백신 바이러스 감염 후 RNA 분리 및 역전사를 통한 cDNA 합성 방법을. 이 프로토콜은 바이러스와 숙주 유전자 발현을 마이크로어레이 분석으로 연구하는 데 활용됩니다.

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1 부 : RNA로부터 cDNA 합성 <ol><li> 앰비온 아미노 알릴 MessageAmp II 키트를 사용하기 전에, 세척 버퍼에 100 % 에탄올의 권장 볼륨을 추가합니다. </li><li> PCR 반응 관에서 T7 oligo (DT) 프라이머 총 RNA 및 1μl의 5μg을 100ng 사이를 추가합니다. nuclease 무료 물로 12μl에 볼륨을 가져와. </li><li> 70 샘플을 품어 ° C thermocycler 10 분. </li><li> ° C와 원심 분리기 간략 70 RNA 샘플을 제거합니다. 얼음 놓습니다. </li><li> 1 일 스트랜드 합성 마스터 믹스를 준비하고 (오류 pipetting 10 % 없더군요)를 실온에서 보관. (표 1) </li><li> 부드럽게 피펫 마스터 믹스이나 제스처는 혼합 후 간단히 원심 분리기. </li><li> 각 RNA 샘플을 마스터 믹스 8μl을 전송합니다. 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다. </li><li> thermocycler 2 시간 동안 42 ° C에서 알을 품다. </li><li> 얼음 원심 분리기 샘플의 잠시 장소. 즉시 dsDNA 합성의 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 얼음 2 차 스트랜드 합성 마스터 믹스 (오류를 pipetting 10 % 없더군요 포함). (표 2)를 준비 </li><li> 부드럽게 피펫 마스터 믹스이나 제스처는 혼합 후 간단히 원심 분리기. </li><li> 각 샘플에 80μl를 전송하고 부드럽게 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다. </li><li> thermocycler 2 시간 동안 16 ° C에서 알을 품다. </li><li> 2 시간 부화 후 cDNA 정리 단계로 진행 또는 -20 ° C. 즉시 동결 </li></ol> 2 부 : 두 번 좌초 cDNA 청소 <ol><li> 냉장고에서 cDNA 순수를 제거하고 사용하기 전에 30 분 방 온도로 평형 수 있습니다. 완전히 사용하기 전에 자기 cDNA 바인딩 구슬을 resuspend 수있는 병을 흔들어. </li><li> 1.5mL 튜브와 50-60에서 품어 ° C 이전의 2 시간 배양 기간 동안 적어도 10 분 동안에 나누어지는 nuclease없는 물. </li><li> 각 샘플에 cDNA 순수의 180μl를 추가하고, 철저하게 최대 pipetting 아래로 섞는다. 96 - 잘 왕복 하단 플레이트에 샘플을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 최소한 2 분 동안 궤도 쉐이크에 대한 번호판을 흔들어하여 샘플을 섞어 계속합니다. </li><li> 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 약 6 분 동안 증언대에 접시를 남겨 또는 혼합물이 투명하게되고 바인딩 비즈가 pelleted 때까지. </li><li> 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 각 잘하는 150μl cDNA 씻으 버퍼를 추가하고 중간 속도로 궤도 쉐이크에서 1 분 접시를 흔들. 구슬은 세척 버퍼의 낮은 표면 장력으로 인해,이 단계에서 분산 않을 것입니다. </li><li> 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 세차에게 150μl cDNA 씻으 버퍼와 함께 2 차 시간을 반복합니다. </li><li> 2 차 세척 후, 최대 속도로 궤도 쉐이크 2 분 동안 접시를 흔들어하여 비즈를 건조. overdry하지 마! </li><li> 각 샘플에 preheated nuclease없는 물 18μl를 추가하여 비즈에서 cDNA를 Elute. </li><li> 적극적으로 궤도 쉐이크 3 분 동안 접시를 흔들 다음 자성 비즈가 완전히 분산되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않다면, 계속 떨고. </li><li> 자기 비즈가 완전히 분산이되면, 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 (~ 16μl) eluted cDNA는 새로운 PCR 플레이트 (또는 PCR 튜브)로 전송할 수 있습니다. </li><li> 다음 단계로 바로 진행, 또는 -20 ° C.에서 cDNA를 동결 </li></ol> 제 3 부 : 시험 관내 전사의 (IVT) <ol><li> 상온에서 IVT 마스터 섞는다. (표 3) 준비 </li><li> 부드럽게 마스터 믹스 또는 혼합에 영화를 피펫, 그리고 짧게 원심 분리기. </li><li> 각 샘플에 24μl에 추가하고, 부드럽게 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다. </li><li> thermocycler 14 시간 동안 37 ° C에서 품어, 다음 단계에 대한 ° C까지 준비 4 만요. </li></ol> 4 부 : 아르나 청소 IVT 후 <ol><li> 소용돌이 RNA 바인딩 비즈 간단히 사용하기 전에도 혼합물을 얻을 수 있습니다. </li><li> 상온에서 아르나 바인딩 믹스를 준비 (표 4) 이것은 미리 할 수 있습니다 -. 준비 바인딩 조합은 최대 일주일 위해 상온에서 저장할 수 있습니다. </li><li> vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 적어도 10 분 동안 50-60 ° C에서 1.5mL 튜브와 부화로 나누어지는 아르나의 용출 버퍼. </li><li> 아르나 바인딩 믹스 70μl를 추가각 샘플과 3-4 회 위아래로 pipetting과로 잘 섞는다. </li><li> PCR 플레이트에서 96 잘 왕복 하단 플레이트에 샘플을 전송합니다. </li><li> 각 샘플에 이소프로판올 100 % 50μl를 추가하고 3-4 회 위아래로 pipetting과로 잘 섞는다. </li><li> 부드럽게 철저하게 샘플을 혼합하기 위해 최소한 2 분 동안 궤도 쉐이크에 접시를 흔들. </li><li> 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 혼합물이 투명하게되고 바인딩 비즈가 pelleted 때까지 법정에 접시를 남겨주세요. </li><li> 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 각 잘하는 100μl 아르나 와시 솔루션을 추가하고 중간 속도로 궤도 쉐이크에서 1 분 접시를 흔들. 구슬 완전히이 단계에서 분산되지 않을 수 있습니다. </li><li> 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 세차에게 100μl 아르나 와시 솔루션 2 차 시간을 반복합니다. </li><li> 2 차 세척 후, 최대 속도로 궤도 쉐이크 1 분에 대한 번호판을 흔들어하여 비즈를 건조. 샘플을 overdry하지 마! </li><li> 각 샘플에 40μl preheated 아르나의 용출 버퍼를 추가하여 비즈에서 아르나을 Elute. </li><li> 강력 3 분 궤도 쉐이크에 번호판을 흔들 다음 마그네틱 비즈가 완전히 분산되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않다면, 계속 떨고. </li><li> 자기 비즈가 완전히 분산이되면, 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 뜨는은 청소 접속 아미노 알릴 통합의 아르나가 포함되어 있습니다. </li><li> 조심스럽게 새로운 PCR 플레이트 (또는 PCR 튜브)로 eluted 아르나를 전송합니다. </li><li> (선택 단계) NanoDrop 분광 광도계에 1.5μl를 측정하여 시료의 RNA 농도를 확인합니다. </li><li> 바로 다음 단계에 계속하거나, -80에서 아르나를 저장 ° C. </li></ol> 표 1 : cDNA 1 일 스트랜드 합성 마스터 믹스 <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 한 반응에 대한 금액 </td></tr><tr><td> 10X 먼저 스트랜드 버퍼 </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> dNTP 믹스 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> Ribonuclease 억제제 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 배열 스크립트 </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table> 표 2 : cDNA 2 차 스트랜드 합성 마스터 믹스 <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 한 반응에 대한 금액 </td></tr><tr><td> Nuclease 무료로 물 </td><td> 63 μl </td></tr><tr><td> 10X 둘째 스트랜드 버퍼 </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> dNTP 믹스 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> DNA 효소 </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> RNase H </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table> 표 3 : IVT 마스터 믹스 <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 한 반응에 대한 금액 </td></tr><tr><td> aaUTP 솔루션 (75 ㎜) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP 믹스 (25 ㎜) </td><td> 12 μl </td></tr><tr><td> T7 UTP 솔루션 (75 ㎜) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> T7 10X 반응 완충액 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> T7 효소 믹스 </td><td> 4 μl </td></tr></tbody></table> 표 4 : 아르나 바인딩 믹스 <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 한 반응에 대한 금액 </td></tr><tr><td> RNA 바인딩 비즈 * </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 비드 Resuspension 솔루션 * </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 백퍼센트 이소프로판올 ** </td><td> 6 μl </td></tr><tr><td> 아르나 바인딩 버퍼 컨센트레이트 </td><td> 50 μl </td></tr></tbody></table> * 먼저 비드 resuspension 솔루션 RNA 바인딩 비즈를 섞습니다. ** 이소프로판올를 추가하고 아르나 바인딩 버퍼 집중을 추가하기 전에 잘 섞는다.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
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<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
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<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

중요 단계 배열 데이터에 편견이 관찰되었습니다로서 증폭의 두 번째 라운드는 권장되지 않습니다. 각 효소 단계 (1 일 및 2 차 가닥 cDNA 합성, IVT)에서 신중하게 혼합하는 것은 각 단계의 효소 배양은 적절한 온도는 좋은 증폭 수율을 얻는 것이 중요합니다. 도 편차를 공기 하이브 리다이 제이션 오븐이나 물 목욕 하이브 리다이 제이션에서 IVT 중 2-3 도까지처럼 작고 크게 증폭 제품의 수율에 영향을 줄 수 있습니다 - 온수 조절 뚜껑이있는 PCR의 자전거 타는 사람이 좋습니다. 신청 / 의의 이 프로토콜에서 발생하는 분류 RNA는 문화에 감염된 세포에 유전자 표현 반응을 평가하기 위해 인간, 바이러스, 또는 사용자 정의 microarrays에 hybridized 수 있습니다. Microarray 플랫폼 다양하므로 표시된 프로브에서 하...

<table><tbody><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA 증폭 키트</td><td>시약</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>20회 반응용</td></tr><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA 증폭 키트</td><td>시약</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>100회 반응용, 96-well 포맷</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS 분광광도계</td><td>기타</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>또는 동등한 성능의 분광광도계</td></tr></tbody></table>

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

가족<em&gt; Poxviridae</em&gt; 감염된 세포의 세포질에서 독점적으로 복제 바이러스를 포함하는 대형 더블 - 좌초된 DNA로 구성되어 있습니다. 회원<em&gt; orthopox</em&gt; 속 포함 천연두, 인간 작은 수두의 원인이되는 대리인, monkeypox, 그리고 우두 (VAC), 바이러스 제품군의 prototypic 회원. 비교적 큰 (~ 2백킬로바이트) 우두 게놈 내에서 유전자의 세 클래스가 인코딩됩니다 : 초기, 중간, 그리고 늦었어요. 세 클래스가 virally 인코딩 RNA의 polymerases에 의해 베꼈는데 있지만, 각 클래스는 바이러스의 생활주기에서 다른 기능을 제공합니다. Poxviruses 감염 동안에 호스트 세포 환경의 변조에 대해 여러 전략을 활용합니다. 두 호스트 및 바이러스 유전자 발현의 조절을 이해하기 위해서, 우리는 바이러스와 호스트 세포 모두에서 사본의 풍요로움을 분석하는 게놈 차원의 접근법을 활용했습니다. 여기서 우리는 몇 시간이 지점 후 감염에 우두 바이러스와 샘플링 RNA와 헬라 세포의 시간 코스 감염을 보여줍니다. 두 호스트 및 바이러스 총 RNA는 격리 및 유전자 발현 분석을 위해 microarrays에 하이브 리다이 제이션에 대한 증폭됩니다.

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 2.

Poxviridae과는 감염된 세포의 세포질에서만 복제되는 거대 이중 가닥 DNA 함유 바이러스들로 구성됩니다. ...의 구성원들은

안녕하세요, 저는 화이트헤드 생물 의학 연구소(Whitehead Institute for Biomedical Research)의 Kate Rubins 연구실 소속 Judy Yen입니다. 이전 JoVE 비디오 프로토콜 게시물에서 보여드린 것과 같이 HeLa 세포에 vaccinia virus를 감염시키고 총 RNA를 분리한 후, 역전사 및 시험관 내 전사(in vitro transcription)를 통해 바이러스 RNA를 분리하고 증폭할 수 있으며, 이렇게 증폭된 RNA는 이후 바이러스 및 숙주 유전자 발현의 마이크로어레이 분석에 사용될 것입니다. 그럼 시작해 보겠습니다.RNA로부터 cDNA 합성을 시작하려면, ambient amino allele message AMP two 키트를 사용하기 전 세척 버퍼에 권장 부피의 100% 에탄올을 첨가하십시오. PCR 반응 튜브에 100 ng에서 5 µg 사이의 총 RNA와 1 µL의 T7 올리고 프라이머를 넣습니다. nuclease free water를 사용하여 최종 부피를 12 µL로 맞춥니다. 써모사이클러(thermocycler)에서 샘플을 70 °C로 10분 동안 배양합니다.다음으로, 원심분리기에 있는 RNA 샘플을 70 °C에서 꺼냅니다. 원심분리 직후 샘플을 얼음에 놓습니다. 피펫팅 오차를 고려하여 10%의 추가 부피를 포함한 제1가닥 합성 마스터 믹스를 준비합니다.실온에 둔 상태에서 마스터 믹스를 가볍게 피펫팅하거나 톡톡 쳐서 혼합한 다음, 짧게 원심분리합니다. 원심분리 후, 마스터 믹스 8 µL를 각 RNA 샘플에 옮기고 피펫으로 3~4회 상하로 섞어준 뒤, 써모사이클러에서 42 °C로 2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플을 짧게 원심분리하여 얼음 위에 놓습니다. 즉시 다음 단계인 dsDNA 합성을 진행하십시오.피펫팅 오차를 보정하기 위해 10%의 여유 부피를 두어 2차 가닥 합성 마스터 믹스를 얼음 위에서 준비합니다. 마스터 믹스를 부드럽게 피펫팅하거나 톡톡 쳐서 섞은 후, 잠시 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 각 샘플에 80 µL씩 분주하고 피펫으로 3~4회 부드럽게 섞어줍니다. 써모사이클러에서 16 °C로 2시간 동안 배양합니다.2시간의 배양 후, cDNA 정제 단계를 진행하거나 즉시 -20 °C에서 냉동 보관하십시오. 이중 가닥 cDNA 정제를 시작하려면, 먼저 냉장고에서 cDNA pure를 꺼내 사용 전 30분 동안 실온에서 평형을 맞추십시오. 사용 전 병을 흔들어 자성 cDNA 결합 비드를 완전히 재현탁하십시오. nuclease-free water를 1.5 mL 튜브에 분주하고 50~60 °C에서 최소 10분 동안 배양하십시오.이전의 2시간 배양 과정 동안, 각 샘플에 180 µL의 CD NA pure를 첨가하고 파이펫팅을 통해 충분히 혼합합니다. 샘플을 96-웰 라운드 바텀 플레이트로 옮깁니다. 샘플을 플레이트로 옮긴 후, 오비탈 쉐이커에서 플레이트를 최소 2분 동안 부드럽게 흔들어 샘플을 계속 혼합합니다.플레이트를 자석 스탠드로 옮겨 자성 비드를 포집합니다. 혼합물이 투명해지고 결합 비드가 펠렛 형태로 뭉칠 때까지 약 6분 동안 플레이트를 스탠드 위에 둡니다. 자성 비드가 흐트러지지 않도록 진공 흡입기로 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.또는, 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거한 후 폐기합니다. 상층액을 제거한 후, 플레이트를 마그네틱 스탠드에서 분리합니다. 각 웰에 150 microliters의 CDNA wash buffer를 넣고, 오비탈 셰이커에서 중간 속도로 1분 동안 플레이트를 흔들어 줍니다.세척 버퍼의 낮은 표면 장력으로 인해 이 단계에서는 비드가 분산되지 않습니다. 흔든 후, 플레이트를 다시 자석 스탠드에 놓으십시오. 자성 비드가 흐트러지지 않도록 진공 흡입기로 상층액을 조심스럽게 흡입하여 자성 비드를 포집합니다.또는 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 분리합니다. 150 µL의 CDNA wash buffer를 사용하여 세척 과정을 한 번 더 반복합니다.두 번째 세척 후, 오비탈 쉐이커를 최대 속도로 2분간 흔들어 비드를 건조시킵니다. 비드가 과하게 건조되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 다음으로, 각 샘플에 미리 가열한 nuclease free water 18 µL를 넣고 강하게 섞어 비드로부터 cDNA를 용출합니다.오비탈 셰이커에서 플레이트를 3분 동안 흔들어 줍니다. 그런 다음 마그네틱 비드가 완전히 분산되었는지 확인하십시오. 분산되지 않았다면 계속해서 흔들어 줍니다.자성 비드가 완전히 분산되면, 플레이트를 자성 스탠드로 옮깁니다. 자성 비드를 포집하기 위해, 용출된 cd NA를 새로운 PCR 플레이트 또는 PCR 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 샘플당 약 16 µL의 용출액을 회수해야 합니다.다음 단계로 즉시 진행하거나 cDNA를 -20 °C에서 냉동 보관하십시오. IVT 마스터 믹스를 실온에서 준비합니다. 마스터 믹스를 파이펫으로 부드럽게 섞거나 툭툭 쳐서 혼합한 후, 짧게 원심 분리하십시오.원심분리 후, 각 샘플에 24 µL를 첨가하고 피펫팅으로 3~4회 부드럽게 혼합한 다음, 써모사이클러에서 37 °C로 14시간 동안 배양합니다. 그 후 다음 단계 전까지 4 °C에서 보관하며, RNA 결합 비드를 사용하기 전에 가볍게 볼텍싱하여 균일하게 혼합합니다. A RNA 결합 믹스는 상온에서 준비하십시오.이 작업은 미리 수행할 수 있습니다. 준비된 결합 혼합물은 상온에서 최대 1주일 동안 보관 가능합니다. 볼텍싱으로 잘 혼합한 후, RNA 용출 버퍼 A의 일정량을 1.5 milliliter 튜브에 넣고 50 to 60 °C에서 최소 10분 동안 배양합니다.이제 각 샘플에 A RNA binding mix 70 µL를 첨가하고, 피펫팅을 3~4회 반복하여 잘 섞어줍니다. PCR 플레이트에서 96웰 라운드 바텀 플레이트로 샘플을 옮깁니다. 다음으로, 각 샘플에 100% isopropanol 50 µL를 첨가하고, 피펫팅을 3~4회 반복하여 잘 섞어줍니다.오비탈 쉐이커에서 플레이트를 최소 2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 샘플을 충분히 혼합하기 위해 플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮깁니다. 자성 비드를 포집하기 위함입니다.혼합물이 투명해지고 결합 비드가 펠릿화될 때까지 플레이트를 스탠드 위에 둡니다. 비드가 펠릿화되면, 자성 비드가 흐트러지지 않도록 진공 흡입기로 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 또는, 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하여 폐기합니다.플레이트를 마그네틱 스탠드에서 제거합니다. 다음으로, 각 웰에 RNA 세척액 100 µL를 첨가하고 오비탈 셰이커에서 1분 동안 흔들어 줍니다. 중간 속도로 설정하며, 비드가 완전히 분산될 필요는 없습니다. 이 단계에서 플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮깁니다.자기 비즈를 포집합니다. 자기 비즈가 흐트러지지 않도록 진공 흡입기로 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 또는, 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다.상층액을 제거한 후, 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 옮깁니다. 100 µL의 RNA 세척 용액으로 두 번째 세척을 반복합니다. 두 번째 세척 후, 오비탈 쉐이커에서 최대 속도로 1분 동안 플레이트를 흔들어 비즈를 건조시킵니다.샘플을 너무 과하게 건조하지 않도록 주의하십시오. 미리 가열한 A RNA 용출 버퍼 40 µL를 첨가하여 비드로부터 A RNA를 용출합니다. 각 샘플이 담긴 플레이트를 오비탈 셰이커에서 3분 동안 격렬하게 흔들어 줍니다. 그 후 자성 비드가 완전히 분산되었는지 확인하십시오.그렇지 않다면, 계속해서 흔들어 줍니다. 자성 비드가 완전히 분산되면, 플레이트를 자성 스탠드로 옮겨 자성 비드를 포집합니다. 상층액에는 RNA가 삽입된 정제된 아미노 대립유전자가 포함되어 있습니다.용출된 RNA를 새로운 PCR 플레이트 또는 PCR 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 이 단계에서 NanoDrop 분광광도계로 1.5 µL를 측정하여 샘플의 RNA 농도를 확인할 수 있습니다. 즉시 다음 단계로 진행하거나 RNA를 -80 °C에서 보관하십시오.지금까지 마이크로어레이 하이브리다이제이션을 위해 증폭된 immuno allele 도입 RNA 샘플을 형광 표지하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 2차 증폭을 진행하는 것은 권장되지 않는다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 편향 및 어레이 데이터가 관찰되었으므로, 1차 및 2차 가닥 합성 과정의 각 효소 반응 단계에서 주의 깊게 혼합하는 것이 중요하다는 점 또한 유념하시기 바랍니다.cDNA 합성 또는 IVT 단계는 각 효소 반응 단계를 적절한 온도에서 배양하는 것과 마찬가지로 양호한 증폭 수율을 얻는 데 매우 중요합니다. 시험관 내 전사(in vitro transcription) 과정 중 2~3도 정도의 작은 편차만으로도 공기 하이브리다이제이션 오븐 또는 항온수조 하이브리다이제이션에서 증폭 산물의 수율이 크게 영향을 받을 수 있으므로, 가열 덮개 조절이 가능한 PCR 사이클러를 사용하는 것이 권장됩니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. vaccinia virus를 이용한 시계열 감염 수행 방법, 샘플의 RNA 추출, 그리고 형광 표지 RNA의 조제 및 정제 방법을 설명하는 이 시리즈의 다른 영상들도 꼭 시청하시기 바랍니다.

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