우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부
April 10th, 2009
호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 2.
안녕하세요, 저는 화이트헤드 생물의학 연구소(Whitehead Institute for Biomedical Research)의 케이트 루빈스(Kate Rubins) 연구실의 주디 옌(Judy Yen)입니다. 헬라 세포를 백시니아 바이러스로 감염시키고 이전 Joe 비디오 프로토콜 포스트에 표시된 총 RNA를 분리한 후 역 및 체외 전사를 사용하여 바이러스 RNA를 분리 및 증폭할 수 있으며, 증폭된 RNA는 나중에 바이러스 및 숙주 유전자 발현의 마이크로어레이 분석에 사용됩니다. 시작하겠습니다.
RNA에서 이 c cd NA 합성을 시작하려면 PCR 반응 튜브에서 주변 아미노 대립유전자 메시지 AMP 2 키트를 사용하기 전에 권장 부피의 100% 에탄올을 세척 버퍼에 추가하고, 총 RNA 5마이크로그램에 100나노그램 사이와 T 7 올리고 프라이머 1마이크로리터를 추가합니다. 뉴클레아제가 없는 물로 부피를 최대 12마이크로리터까지 가져옵니다. 샘플을 섭씨 70도에서 열순환기에서 10분 동안 배양합니다.
다음으로, 원심분리기에서 섭씨 70도의 RNA 샘플을 제거합니다. 간단히 말해서, 원심분리 후 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 파이프 편집 오류를 커버하기 위해 10% 볼륨 초과로 첫 번째 strand synthesis master mix를 준비합니다.
실온에 그것을 온화하게 피펫 주된 혼합을 남겨두거나 섞기 위하여 튕기고, 그 후에 원심분리, 주된 믹스의 8 마이크로리터를 thermocycler에 있는 2 시간 동안 42 섭씨 온도 배양된 관에 의해 섞인 관에 의해 섞인 각 RNA 견본에 8 마이크로리터를 옮깁니다. 배양 후 샘플을 얼음 위에서 잠시 원심분리합니다. 즉시 DS dsd A 합성의 다음 단계로 진행합니다.
두 번째 가닥 합성 마스터 믹스를 10% 부피 초과율로 얼음 위에서 준비하여 피펫팅 오류를 보상하고 마스터 믹스를 부드럽게 피펫팅하거나 튕긴 다음 원심분리 후 잠시 원심분리를 합니다. 80 마이크로리터를 각 샘플에 옮기고 3-4회 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 써모사이클러에서 섭씨 16도에서 2시간 동안 배양합니다.
2시간 배양 후 CDNA 정제 단계를 진행하거나 즉시 섭씨 영하 20도로 동결합니다. 이중 가닥 CD NA 정리를 시작합니다. 먼저, 냉장고의 cDNA를 제거하고 사용하기 전에 30분 동안 실온과 평형을 이루도록 한 후, 분취 뉴클레아제 자유수를 1.5ml 튜브에 사용하기 전에 병을 흔들어 자기 CD NA 결합 비드를 완전히 재현탁시키고 섭씨 50도에서 60도 이상에서 최소 10분 동안 배양합니다.
이전 2 시간의 배양 동안 각 샘플에 180 마이크로 리터의 CD NA pure를 첨가하고 파이프를 위아래로 완전히 혼합합니다. 샘플을 96웰 원형 바닥 플레이트로 옮깁니다. 샘플을 플레이트로 옮긴 후 오비탈 셰이커에서 플레이트를 최소 2분 동안 부드럽게 흔들어 샘플을 계속 혼합합니다.
플레이트를 마그네틱 스탠드로 이동하여 마그네틱 비드를 캡처합니다. 플레이트를 약 6분 동안 또는 혼합물이 투명해지고 바인딩 비드가 펠릿화될 때까지 스탠드에 그대로 두십시오. 자성 비드를 방해하지 않고 진공 흡입기로 상등액을 조심스럽게 흡인합니다.
또는 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 상층액을 버립니다. 상등액을 버린 후 자기에서 플레이트를 제거합니다. 다음으로 150마이크로리터에 서서 각 웰에 대한 CDNA 세척 버퍼를 선택하고 적당한 속도로 궤도 셰이커에서 플레이트를 1분 동안 흔듭니다.
비드는 세척 버퍼의 낮은 표면 장력으로 인해 이 단계에서 분산되지 않습니다. 흔든 후 플레이트를 마그네틱 스탠드에 다시 넣습니다. 마그네틱 비드를 캡처하려면 마그네틱 비드를 방해하지 않고 진공 흡입기로 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
또는 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 상층액을 버리십시오. 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 150 마이크로 리터, CDNA 세척 버퍼로 두 번째 세척을 반복하십시오.
두 번째 세척 후 최대 속도로 오비탈 셰이커에서 플레이트를 2분 동안 흔들어 비드를 건조시킵니다. 구슬이 너무 건조되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 다음으로, 예열된 뉴클레아제 자유수 18마이크로리터를 각 샘플에 격렬하게 첨가하여 비드에서 CDNA를 용리합니다.
오비탈 셰이커에서 플레이트를 3분 동안 흔듭니다. 그런 다음 마그네틱 비드가 완전히 분산되어 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 계속 흔들십시오.
마그네틱 비드가 완전히 분산되면 플레이트를 마그네틱 스탠드로 이동합니다. 마그네틱 비드를 포착하려면 방출된 cd NA를 새 PCR 플레이트 또는 PCR 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 당신은 약 16 마이크로 리터의 elucian per을 복구해야합니다.
글쎄, 다음 단계로 바로 진행하거나 cd NA를 섭씨 영하 20도에서 동결하십시오. 실온에서 IVT 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스를 부드럽게 피펫팅하거나 가볍게 튕겨 믹싱하고 짧게 원심분리합니다.
원심분리 후 각 샘플에 24마이크로리터를 추가하고 열순환기에서 섭씨 37도에서 14시간 동안 3-4회 배양한 후 상하로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 다음 단계가 준비될 때까지 섭씨 4도에서 유지하고 RNA 결합 비드를 짧게 소용돌이하여 사용하기 전에 균일한 혼합물을 얻습니다. 실온에서 A RNA 결합 혼합물을 준비합니다.
이것은 미리 수행할 수 있습니다. 제조된 결합 혼합물은 최대 1주일 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. A RNA 용출 완충액을 1.5ml 튜브에 볼텍싱하여 잘 혼합하여 섭씨 50-60도에서 최소 10분 동안 배양합니다.
이제 각 샘플에 70마이크로리터의 A RNA 결합 혼합물을 추가하고 3-4회 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. PCR 플레이트의 샘플을 96웰 원형 바닥 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 각 샘플에 100% 이소프로판올 50마이크로리터를 첨가하고 3-4회 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다.
오비탈 셰이커로 플레이트를 최소 2분 동안 부드럽게 흔듭니다. 샘플을 철저히 혼합하려면 플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮기십시오. 마그네틱 비드를 캡처합니다.
혼합물이 투명해지고 바인딩 비드가 펠릿화될 때까지 플레이트를 스탠드에 그대로 두십시오. 비드가 펠릿화되면 자기 비드를 방해하지 않고 진공 흡입기로 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 또는 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 상층액을 버립니다.
마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 다음으로, 각 웰에 100마이크로리터의 RNA 세척 용액을 추가하고 안형 쉐이커에서 1분 동안 플레이트를 흔듭니다.적당한 속도로 비드가 완전히 분산될 필요는 없습니다. 이 단계에서 플레이트를 마그네틱 스탠드로 이동합니다.
마그네틱 비드를 캡처합니다. 자성 비드를 방해하지 않고 진공 흡입기로 상등액을 조심스럽게 흡인합니다. 또는 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 상층액을 버립니다.
상등액이 제거되면 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 이동합니다. RNA 세척 용액인 100마이크로리터로 두 번째 세척을 반복합니다. 두 번째 세척 후 최대 속도로 오비탈 셰이커에서 플레이트를 1분 동안 흔들어 비드를 건조시킵니다.
샘플을 과도하게 건조하지 말고 40마이크로리터의 예열된 A RNA 용출 완충액을 추가하여 비드에서 A RNA를 용리하십시오. 각 샘플에 대해 오비탈 셰이커의 플레이트를 3분 동안 세게 흔듭니다. 그런 다음 마그네틱 비드가 완전히 분산되어 있는지 확인하십시오.
그렇지 않은 경우 계속 흔들십시오. 마그네틱 비드가 완전히 분산되면 플레이트를 마그네틱 스탠드로 이동하여 마그네틱 비드를 캡처합니다. 슈퍼 나탄은 RNA를 통합한 청소된 아미노 대립유전자를 포함합니다.
NA를 피한 것을 새 PCR 플레이트 또는 PCR 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 이 시점에서 NanoDrop 분광 광도계에서 1.5마이크로리터를 측정하여 샘플의 RNA 농도를 확인할 수 있습니다. 즉시 다음 단계를 계속하거나 A NA를 섭씨 음의 80도에서 보관하십시오.
마이크로레이 혼성화를 위해 증폭된 면역 대립유전자 통합 RNA 샘플을 형광 라벨링하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 두 번째 증폭을 수행하는 것은 권장되지 않는다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 편향과 배열 데이터가 관찰됨에 따라 각 효소 단계에서 신중하게 혼합하면 첫 번째 및 두 번째 가닥을 암시한다는 점을 기억하는 것도 중요합니다.
CDNA 합성 또는 IVT 단계는 적절한 온도에서 각 효소 단계를 배양하는 것과 마찬가지로 우수한 증폭 수율을 얻는 데 중요합니다. 조절 가능한 가열 뚜껑이 있는 PCR cycler는 체외 전사 중에 2-3도의 작은 편차로 선호됩니다. 공기 혼성화, 오븐 또는 수조에서 혼성화는 증폭된 제품의 수율에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.
그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다. 백시니아 바이러스로 시간 경과 감염을 수행하고 샘플의 RNA 추출과 형광 표지된 RNA의 준비 및 세척을 수행하는 방법을 보여주는 이 시리즈의 다른 비디오를 시청하십시오.
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개요
이 프로토콜은 HeLa 세포의 백신 바이러스 감염 과정과 이후 숙주 및 바이러스 유전자 발현 분석을 설명합니다. 중점은 추가 분석을 위해 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 데 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 바이러스학
- 세포 생물학
- 유전자 발현 분석
배경
- 백신 바이러스는 바이러스 감염을 연구하기 위한 모델 생물입니다.
- HeLa 세포는 생물학 연구에서 널리 사용됩니다.
- 숙주 및 바이러스 유전자 발현을 이해하는 것은 바이러스학에서 중요합니다.
- 마이크로어레이 분석은 포괄적인 유전자 발현 프로파일링을 가능하게 합니다.
연구 목적
- 감염 후 HeLa 세포의 유전자 발현 변화를 조사합니다.
- 분석을 위해 바이러스 RNA를 분리하고 증폭합니다.
- 바이러스 감염을 연구하는 연구자들에게 상세한 프로토콜을 제공합니다.
사용된 방법
- 백신 바이러스로 HeLa 세포 감염.
- 감염된 세포로부터 전체 RNA 분리.
- RNA에서 cDNA를 합성하기 위한 역전사.
- 유전자 발현에 대한 마이크로어레이 분석 준비.
주요 결과
- 감염된 HeLa 세포로부터 전체 RNA의 성공적인 분리.
- 역전사를 사용한 바이러스 RNA의 증폭.
- 후속 마이크로어레이 분석을 위한 샘플 준비.
- 숙주 및 바이러스 유전자 발현 역학에 대한 통찰.
결론
- 이 프로토콜은 바이러스 감염을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 증폭된 RNA는 마이크로어레이 분석에 효과적으로 사용할 수 있습니다.
- 유전자 발현 변화를 이해하는 것은 치료 전략에 도움을 줄 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol enables systematic analysis of host and viral gene expression dynamics during vaccinia virus infection, providing a foundation for antiviral target identification and mechanistic de-risking in antiviral development. By capturing temporal expression patterns of early, intermediate, and late viral genes, researchers can prioritize targets based on functional relevance in the viral life cycle. The approach supports preclinical evaluation of host-directed therapeutics by revealing virus-induced host pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral gene function across infection stages to validate essential targets for antiviral intervention.
- Operational Value: Provides a reproducible method to generate high-quality RNA for downstream functional assays and target validation studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates expression profiles that can inform assay design for screening compounds affecting viral transcription or host response pathways.
- Operational Value: Produces amplified RNA suitable for microarray or sequencing platforms, enabling scalable screening of antiviral candidates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic understanding of virus-host interactions, aiding in biomarker identification for preclinical efficacy studies.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration by delivering standardized, time-resolved molecular data for PK/PD modeling and target engagement assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the antiviral discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling mechanistic de-risking before compound progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral gene function and host pathway modulation during infection.
- Screening: Delivers quantitative gene expression readouts essential for evaluating compound effects on viral replication and host response.
- Analytics: Provides temporal expression data that enables statistical comparison of infected versus mock conditions and dose-response relationships.
- Translational Research: Connects early discovery findings to preclinical validation by identifying conserved viral mechanisms and host biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying other orthopoxviruses or emerging viral threats with similar genomic strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by linking viral gene expression to phenotypic outcomes in infection models.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized RNA isolation, amplification, and labeling procedures.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by enabling early identification of non-essential or redundant viral targets.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted target prioritization by distinguishing between early (replication-essential) and late (structural) viral gene functions.
Implementation Considerations
- Molecular biology expertise in RNA handling, reverse transcription, and in vitro transcription.
- Access to thermocyclers, magnetic separation equipment, and microarray hybridization infrastructure.
- Standardization of infection timing and RNA sampling across laboratories for comparative studies.
- Adaptation considerations for different host cell lines or viral strains while maintaining temporal resolution.
- Requirement for RNase-free environments and validation of amplification efficiency to avoid bias in downstream expression analysis.
