2006년 11월 30일
소포 자료의 속도론을 측정하는 능력은 neurotransmission의 기초의 일부에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 hippocampal의 연결을 문화에 presynaptic 소포 릴리스의 속도를 측정하기 위해 빨간색 형광 염료 FM 4-64으로 표시 vesicles의 실시간 이미지를 사용합니다.
저는 지미 린(Jimmy Lynn)입니다. 하버드 대학교 분자 및 세포 생물학 프로그램의 대학원생입니다. 현재 머피 연구소(Murphy Lab)에서 근무하고 있으며, 저희 연구소에서는 해마 신경(Hippocampal Neuro)을 연구하고 있습니다.
지금부터 FM-dye 실험 방법을 보여드리겠습니다. 우선 뉴런이 배양된 커버슬립을 이 맞춤 제작 챔버에 장착하겠습니다. 저희가 사용하는 현미경은 도립형 CCD 현미경이며, 바닥면의 물기를 완전히 제거해야 합니다.
전극을 연결하겠습니다. 이제 퍼퓨전(perfusion) 장치가 설정되었습니다. 이를 챔버의 한쪽 끝에 배치하겠습니다.
고정시키기 위해 점토를 사용합니다. 실험당 HBS의 리더들이 이를 모두 추가하겠습니다. 융합 설정이 완료되었습니다.
이를 고정하기 위해 클레이를 사용할 수 있으며, 아마도 세포체가 있는 부분과 같이 고정하면 세포체 막이 염료를 많이 흡수하여 시냅스로 바로 전달될 것입니다. 여기처럼 즉각적으로 처리를 진행한 인접 영역의 경우도 마찬가지입니다. 그리고 첫 10장의 이미지에서 초기 광퇴색(photo bleaching)이 일어납니다.
안녕하세요, 저는 하버드 대학교 분자생물학 프로그램의 대학원생인 Jamil Newton입니다. 현재 Vinky Murphy 교수님의 지도하에 신경과학 연구실에서 연구하고 있습니다.
오늘 제가 여러분께 말씀드리고자 하는 내용은 FM 실험을 수행하는 방법에 관한 것입니다. 여러분의 실험 목표는 무엇입니까? FM의 장점은 FM이 엑소사이토시스(exocytosis)의 역학을 추적할 수 있게 해주는 형광 염료라는 점입니다.
따라서 먼저 로딩 자극을 주어 염료가 시냅스로 흡수되도록 합니다. 그런 다음 세척 기간을 거친 후, 염료가 소포에서 방출되도록 디테인 자극을 줍니다. 특정 유형의 뉴런을 연구하고 계신가요?
따라서 저희 실험실에서는 이를 해마 뉴런에 사용하며, 용해물보다는 배양된 뉴런에 적용하고 있습니다. 이 실험에서 발생할 수 있는 문제는 무엇일까요? 흔히 발생하는 문제 중 하나로, 저희는 전기 자극을 사용합니다.
과거에 간혹 어떤 이유로든 전기 시뮬레이션 작동에 문제가 발생하는 경우가 있었습니다. 다른 연구실에서도 고칼륨 용액을 사용하는 것으로 알고 있습니다. 따라서 전기 자극 사용에 문제가 있을 때 고칼륨 용액이 훌륭한 대안이 될 수 있습니다.
또한, 일반적으로 세척 단계 중 어떤 이유로든 비특이적 염색이 충분히 제거되지 않는 경우가 있는 것으로 보입니다. 저는 유속을 높임으로써, 즉 분당 0.5 mL 대신 1.5 mL를 흘려주고, 세척 시간을 5분에서 10분으로 늘리는 것만으로도 결과가 획기적으로 개선된다는 것을 자주 발견했습니다. 이 실험의 가능한 응용 분야는 무엇입니까?
실제로 무엇을 연구하고 싶으신가요? 예를 들어, 이를 통해 대조군 세포와 어떤 방식으로든 조작된 세포를 비교 테스트할 수 있습니다. 따라서 서로 다른 마우스 라인을 대상으로 방출 역학에 차이가 있는지 확인하거나, 특정 약물을 추가했을 때 그것이 실제로 세포 용해(cytosis)에 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다.
감사합니다.
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본 연구는 신경전달에 대한 이해를 높이기 위해 소낭 방출의 역학을 측정하는 데 중점을 둡니다. FM 4-64 염료를 이용한 실시간 이미징을 통해, 해마 신경세포 배양물에서의 시냅스 전 소낭 방출 속도를 조사합니다.
FM 염색 표지를 이용한 시냅스 소포 엑소사이토시스의 정량적 측정은 신경전달물질 방출 기전에 대한 실질적인 통찰을 제공하며, 신경생물학 중심의 신약 개발 단계에서 초기 표적 검증을 지원합니다. 이러한 접근 방식은 유전적 또는 약리학적으로 조작된 뉴런과 대조군 간의 소포 방출 키네틱스를 직접적으로 비교할 수 있게 하여, 발견 전환점에서의 기전적 리스크 감소와 예측 신뢰도를 높여줍니다.
FM 염료 기반의 엑소사이토시스 측정법은 초기 기전 연구와 신경계에서의 중개적 검증을 연결함으로써, 발견부터 전임상 단계까지의 연속적인 연구 과정에 통합됩니다.