Name: 우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 제 3 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 학습하세요 백신 바이러스에 감염된 HeLa 세포에서 항의 RNA 샘플을 아미노알릴 염료 결합으로 표지하고 마이크로어레이 분석을 위한 정제 방법을. 이 기법은 바이러스 유전자 발현 동역학 연구에 활용됩니다.

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1 부 : 아르나 라벨 : 염료의 아미노산 알릴 커플링 <ol><li> 1.5mL microcentrifuge 튜브에 아르나 샘플 1μg을 추가합니다. </li><li> 그들이 완전히 건조되기 전까지는 낮은 여부 열에 샘플을 건조 진공. 바로 그것이 건조 각 튜브 캡 - overdry 마세요! </li><li> 각각의 튜브에 9μl 커플링 버퍼를 추가하고 부드럽게 1 분 vortexing하여 아르나을 resuspend. 튜브의 맨 아래에있는 샘플을 수집하기 위해 간략하게 원심 분리기, 다음 예제는 얼음에 앉아 보자. </li><li> Cy3 또는 Cy5 염료의 각 튜브에 22μl 고품질의 DMSO를 추가합니다. 염료 중 하나 튜브 충분이 샘플입니다. Cy3의 염료가 참조 샘플 라벨을위한, 그리고 Cy5의 염료는 테스트 샘플 라벨입니다. </li><li> 철저하게 혼합하기 위해 염료 소용돌이. 사용할 준비가 될 때까지 어둠 속에 염료 보관하십시오. 사용하기 전에 이전 1시간보다 염료를 준비하지 마십시오. 물이 언제든지 염료 / DMSO 혼합에 도착하지 있는지 확인하십시오. </li><li> 각 샘플에 대한 준비 DMSO / 싸이 염료의 11μl를 추가합니다. 부드럽게 vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 상온에서 30~45분에 대한 부화. 석박와 샘플을 표지 또는 조명에 노출을 최소화하기 위해 서랍에 보관하십시오. </li><li> 부화 후, 반응을 담금질하기 위해 각 샘플에 4.5μl hydroxlyamine를 추가합니다. 부드럽게 vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 상온에서 또 다른 15 분 동안 품어. 석박와 샘플을 표지 또는 조명에 노출을 최소화하기 위해 서랍에 보관하십시오. </li></ol> 2 부 : 아르나 청소 라벨 <ol><li> 소용돌이 RNA 바인딩 비즈 간단히 사용하기 전에도 혼합물을 얻을 수 있습니다. </li><li> 상온에서 아르나 바인딩 믹스를 준비합니다. (표 1) </li><li> vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 적어도 10 분 동안 50-60 ° C에서 1.5mL 튜브 및 부화에 아르나의 용출 버퍼 Aliquote. </li><li> 각 샘플에 아르나 바인딩 믹스 70μl를 추가하고 3-4 회 위아래로 pipetting과로 잘 섞는다. </li><li> PCR 플레이트에서 96 잘 왕복 하단 플레이트에 샘플을 전송합니다. </li><li> 각 샘플에 이소프로판올 100 % 50μl를 추가하고 3-4 회 위아래로 pipetting과로 잘 섞는다. </li><li> 부드럽게 철저하게 샘플을 혼합하기 위해 최소한 2 분 동안 궤도 쉐이크에 접시를 흔들. </li><li> 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 혼합물이 투명하게되고 바인딩 비즈가 pelleted 때까지 법정에 접시를 남겨주세요. </li><li> 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. 뜨는은 밝은 분홍색 또는 비법인 염료 분자로 인해이 시점에서 밝은 파란색이어야한다. </li><li> 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 각 잘하는 100μl 아르나 와시 솔루션을 추가하고 중간 속도로 궤도 쉐이크에서 1 분 접시를 흔들. 구슬 완전히이 단계에서 분산되지 않을 수 있습니다. </li><li> 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 세차에게 100μl 아르나 와시 솔루션 2 차 시간을 반복합니다. </li><li> 2 차 세척 후, 최대 속도로 궤도 쉐이크 1 분에 대한 번호판을 흔들어하여 비즈를 건조. 샘플을 overdry하지 마! </li><li> 각 샘플에 20μl preheated 아르나의 용출 버퍼를 추가하여 비즈에서 아르나을 Elute. </li><li> 강력 3 분 궤도 쉐이크에 번호판을 흔들 다음 마그네틱 비즈가 완전히 분산되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않다면, 계속 떨고. </li><li> 자기 비즈가 완전히 분산이되면, 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 뜨는은 청소, 표시 아르나 샘플을 포함하고 창백한 분홍색이나 하늘색 중 하나가 될 것입니다. </li><li> 조심스럽게 새로운 PCR 플레이트 (또는 PCR 튜브)로 eluted 아르나를 전송합니다. </li><li> (선택 단계)는 Microarray 모듈을 사용하여 NanoDrop 분광 광도계에 1.5μl를 측정하여 시료의 RNA 농도 및 염료의 양을 확인합니다. </li><li> 바로 선택의 microarray 플랫폼에 표시된 아르나을 잡종, 또는 양자 택일로, 당신은 -80에서 레이블 아르나를 저장할 수 있습니다 ° C가 하이브 리다이 제이션을위한 준비가 될 때까지. </li></ol> 표 1 아르나 바인딩 믹스 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 한 반응에 대한 금액 </td></tr><tr><td> RNA 바인딩 비즈 * </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> 비드 Resuspension 솔루션 * </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> 백퍼센트 이소프로판올 ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> 아르나 바인딩 버퍼 컨센트레이트 </td><td> 50μl </td></tr></tbody></table> *와 RNA 바인딩 비즈를 믹스첫째 비드 resuspension 솔루션 ** 이소프로판올를 추가하고 아르나 바인딩 버퍼 집중을 추가하기 전에 잘 섞는다.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

저자들은 공개할 이해관계가 없음을 밝힙니다.

중요 단계 아미노 알릴 커플링을 수행할 때, 그것은 결합하기 전에 바로 DMSO (미만 1 시간)에 염료를 resuspend하고 염료에있는 활성 그룹과 반응하므로 물이, 염료 / DMSO 혼합에 도착하지 않도록하는 것이 중요합니다. RNA (1 - 2uL보다는 완전히 건조까지 건조 가능) overdry 및 커플링 버퍼에 잘 resuspend하지 마십시오. 커플링 반응하는 동안, 가끔 flicking과 함께 어둠 속에서 반응을 유지하고 필요할 경우 스핀 다운. 신청 / 의의 이 프로토콜에서 발생하는 분류 RNA는 문화에 감염된 세포에 유전자 표현 반응을 평가하기 위해 인간, 바이러스, 또는 사용자 정의 microarrays에 hybridized 수 있습니다. Microarray 플랫폼 다양하므로 표시된 프로브에서 하이브 리다이 제이션 혼합물의 준비에 대한 제조 업체의 지침을 따르시기...

<table><tbody><tr><td>CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>Cy3 및 Cy5 염료 모두 포함</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS 분광광도계</td><td>기타</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>또는 동등한 성능의 분광광도계</td></tr></tbody></table>

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 제 3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

가족<em&gt; Poxviridae</em&gt; 감염된 세포의 세포질에서 독점적으로 복제 바이러스를 포함하는 대형 더블 - 좌초된 DNA로 구성되어 있습니다. 회원<em&gt; orthopox</em&gt; 속 포함 천연두, 인간 작은 수두의 원인이되는 대리인, monkeypox, 그리고 우두 (VAC), 바이러스 제품군의 prototypic 회원. 비교적 큰 (~ 2백킬로바이트) 우두 게놈 내에서 유전자의 세 클래스가 인코딩됩니다 : 초기, 중간, 그리고 늦었어요. 세 클래스가 virally 인코딩 RNA의 polymerases에 의해 베꼈는데 있지만, 각 클래스는 바이러스의 생활주기에서 다른 기능을 제공합니다. Poxviruses 감염 동안에 호스트 세포 환경의 변조에 대해 여러 전략을 활용합니다. 두 호스트 및 바이러스 유전자 발현의 조절을 이해하기 위해서, 우리는 바이러스와 호스트 세포 모두에서 사본의 풍요로움을 분석하는 게놈 차원의 접근법을 활용했습니다. 여기서 우리는 몇 시간이 지점 후 감염에 우두 바이러스와 샘플링 RNA와 헬라 세포의 시간 코스 감염을 보여줍니다. 두 호스트 및 바이러스 총 RNA는 격리 및 유전자 발현 분석을 위해 microarrays에 하이브 리다이 제이션에 대한 증폭됩니다.

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 파트 3 찬란 염료의 아미노 알릴 결합에 의해 두 호스트 및 바이러스 샘플에서 증폭된 RNA를 라벨링 과정을 설명합니다. 3 부 3.

Poxviridae과는 감염된 세포의 세포질에서만 복제되는 거대 이중가닥 DNA 함유 바이러스들로 구성됩니다. ...의 구성원들은

안녕하세요, 저는 Whitehead Institute for Biomedical Research의 Kate Rubins 연구실 소속 Judy Y입니다. 본 영상에서는 다이(dye)의 aminoallyl coupling을 이용하여 백시니아 바이러스(vaccinia virus)에 감염된 HeLa 세포와 바이러스 모두에서 수집한 antisense RNA 샘플을 표지하는 방법을 시연합니다. 이어서 표지된 antisense RNA를 정제하고, 유전자 발현의 마이크로어레이 분석을 위한 하이브리드화 준비 과정을 보여드리겠습니다.이전 JoVE 영상에서는 바이러스 감염, 총 RNA 분리, 그리고 RNA 증폭 단계를 수행하는 방법을 다루었습니다. 이제 시작해 보겠습니다. RNA 표지를 시작하려면, 먼저 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 1 µg의 RNA 샘플을 넣으십시오.샘플이 완전히 마를 때까지 저온 또는 무가열 상태에서 진공 건조합니다. 건조가 완료되는 즉시 각 튜브의 캡을 닫습니다. 샘플이 마른 후 과하게 건조되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.각 튜브에 9 µL의 커플링 버퍼를 첨가하고, 1분 동안 부드럽게 볼텍싱하여 A RNA를 재부유시킨 후, 짧게 원심분리하여 시료를 튜브 바닥에 모으고 얼음 위에 둡니다. 다음으로, SCI 3 또는 S 5 염료가 포함된 각 튜브에 22 µL의 고순도 DMSO를 첨가합니다. 염료 한 튜브로 시료 두 개를 처리할 수 있습니다. SCI 3 염료는 대조군 시료 라벨링에 사용하고, SCI 5 염료는 테스트 시료 라벨링에 사용합니다.염료가 충분히 섞이도록 볼텍싱합니다. 사용 전까지 염료를 암소에 보관하십시오. 염료는 사용 전 1시간 이내에 준비해야 하며, 어떤 단계에서도 염료 DMSO 혼합물에 물이 들어가지 않도록 주의하십시오.준비된 D-M-S-O-S 염료 혼합물 11 µL를 각 샘플에 넣고 볼텍싱으로 잘 섞어줍니다. 실온에서 30~45분 동안 천천히 인큐베이션합니다. 빛 노출을 최소화하기 위해 샘플을 알루미늄 호일로 덮거나 서랍 안에 보관하십시오.배양 후, 각 시료에 4.5 µL의 hydroxylamine을 첨가하여 반응을 정지시키고 볼텍싱으로 잘 섞어줍니다. 상온에서 15분 동안 부드럽게 추가 배양합니다. 빛 노출을 최소화하기 위해 시료를 알루미늄 호일로 덮거나 서랍 안에 보관하십시오.라벨을 세척하려면 RNA 볼텍스를 사용하여 RNA 결합 비드를 처리합니다. 사용 전 균일한 혼합물을 얻기 위

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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