Name: 와이드 필드 현미경을 사용하여 장기 이미징 포유 동물 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: 학습하세요 포유동물 세포의 장기 이미징을 위한 와이드 필드 현미경 기법을 사용하여 신경과학 연구에서 세포 분열 과정을 관찰하는 방법을 배우세요. 37도 온도 제어와 GFP 형광 이미징을 활용합니다.

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와이드 필드 현미경을 사용하여 장기 이미징 포유 동물 세포

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

실제로 제가 진행할 방법은, 먼저 여기에 장착한 다음 교체하는 것입니다. 이제 최대한 조심스럽게 흡입하겠습니다. 좋습니다. 몇 초 동안 그대로 유지합니다. 좋습니다. 됐습니다.따라서 저희 라이브 셀 이미징 시스템의 중요한 특징은 도립 현미경이라는 점이며, 이는 대물렌즈가 샘플 아래에 위치함을 의미합니다. 즉, 대물렌즈가 위쪽을 향하고 있으며, 대물렌즈와 샘플을 포함한 현미경의 거의 전체 시스템이 37 °C로 유지됩니다. 따라서 이 플라스틱 박스 내부의 모든 요소는 37 °C 상태입니다.그리고 스테이지 바로 위에는 공기와 CO2 혼합 가스가 있습니다. 이는 5%CO2입니다. 즉, 시료가 세포 배양기 형태의 챔버 안에 들어 있다는 개념입니다.따라서 여기 공기와 CO2를 위한 혼합기가 있으며, 가습 및 가열 과정을 거친 후 스테이지 위의 샘플로 파이프를 통해 전달됩니다. 오늘은 단일 채널인 GFP 형광 분석을 진행하겠습니다. 이 호스는 5% CO2가 유입되는 경로이며, 스테이지 홀더에 맞게 장착됩니다.그 점이 중요합니다. 그런 다음 이것들을 닫고 내린 후 첫 번째 위치로 이동합니다. 제가 할 일은 제 대조군 샘플인 첫 번째 시야로 가서 화면에 보이는 내용을 바탕으로 위치를 선택하는 것입니다.따라서 각 웰마다 현미경으로 직접 확인해야 합니다. 각 웰의 초점 평면이 서로 다르고, 디시 바닥면이 완전히 평평하지 않기 때문입니다. 따라서 웰을 이동할 때마다 미세 조정이 필요합니다. 현재 첫 번째 웰에 있으며, 초점을 맞추기 위해 현미경의 투과광을 켜겠습니다.그런 다음 모든 빛이 접안렌즈로 전달되는지 확인합니다. 접안렌즈를 통해 시야가 깨끗하게 확보되었는지 확인한 후, 일반 조명을 끄고 형광 조명을 켭니다. 이때 관찰 중인 세포들이 건강한 상태인지, 그리고 세포 사멸(apoptotic)이 일어나지 않았는지 확인합니다.그리고 이것을 끕니다. 다음으로 제가 할 일은 전송하는 것입니다. 이제 위치를 선택하기 시작할 것이며, 이는 광로를 카메라로 보내야 함을 의미합니다. 카메라가 바로 여기에 있습니다.현미경이 모든 빛을 카메라로 보내도록 설정하면, 접안렌즈로는 아무것도 보이지 않게 됩니다. 이제 현미경 제어 소프트웨어에서 목적에 맞는 필터 세트인 psy를 선택한 다음, 노출 시간을 설정하겠습니다.저는 이 세포들에 대해 매우 잘 알고 있으며, 노출 시간이 0.2초가 필요하다는 점을 알고 있습니다. 그래서 소프트웨어에 그렇게 설정합니다. 그런 다음 포커스 버튼을 누릅니다.이것은 기본적으로 살아있는 상태입니다. 빛이 들어오면, 세포들이 보일지는 모르겠지만, 이 시야가 적절한 이유는 모든 세포의 형광 상태가 고르고, 세포 사멸(apoptotic) 세포가 없기 때문입니다. 일반적으로 세포 사멸 세포는 매우 밝게 나타나는데, 여기에는 그런 세포나 시야 내의 이물질 또는 오염물이 없습니다.보시는 바와 같이, 이것은 중기 세포이고 저것도 중기 세포이며, 저 세포는 아마 방금 분열기를 마친 것으로 보입니다. 두 세트의 염색질이 서로 매우 잘 정렬되어 있는 것으로 보아, 방금 후기를 마쳤다는 것을 알 수 있습니다.적절한 시야를 찾았습니다. 이제 노출 시간과 필터 세트가 정확하다는 것을 확인했으므로, 소프트웨어 설정에 따라 해당 위치를 지정하겠습니다. 그러면 소프트웨어가 해당 시야의 X, Y, Z 좌표를 기억하게 됩니다. 그 후 동일한 웰 내에서 다른 시야를 선택할 때는, 접안렌즈로 직접 확인하는 대신 셔터를 열고 화면에 표시되는 영상을 보면서 새로운 시야들을 선택하겠습니다.따라서 제가 사용하는 토닉이 하나도 보이지 않습니다. 하지만 다시 말씀드리자면, 적절히 중앙에 위치하더라도 이러한 세포들은 제 PS를 통과하게 됩니다. 계속해서, 여기 좋은 예가 있습니다. 제가 피하고 싶은 사례의 좋은 예인데, 얼마나 밝은지 보이시나요?매우 밝게 보입니다. 이것은 아마도 세포 사멸(apoptotic cell)의 잔해일 것입니다. 이를 피해야 하는 이유는 너무 밝기 때문에 소프트웨어가 자동으로 초점을 맞출 때 해당 부분에만 초점을 맞추게 되어, 다른 모든 세포들과 동일한 평면에 놓이지 않기 때문입니다.따라서 해당 시야에서는 아무런 정보를 얻지 못할 것입니다. 상태가 좋아 보이네요. 여기 전중기(pro metaphase)가 있고, 이것은 중기(metaphase)입니다.따라서 각 웰당 세 지점을 측정하겠습니다. 그렇게 세 지점을 측정했으며, 이제 다음 웰로 이동하겠습니다. 아마 10분마다 이미지를 촬영할 예정인데, 이는 절충안입니다.라이프스타일 이미징은 항상 절충안을 찾는 과정이죠, 그렇죠? 이미징을 수행하면서도 특히 유사분열에 관심이 있는 경우 세포의 건강 상태를 유지해야 합니다. 따라서 형광 광선에 노출되는 시간을 최소화해야 합니다.또한, 정보를 얻고자 한다면 이미지를 촬영해야 하므로, 캡처하고자 하는 정보의 종류에 대해 절충하고 선택해야 합니다. 본 실험의 목적상, 유사분열은 보통 약 1시간 정도 소요됩니다.따라서 10분 간격으로 촬영한다면 충분히 적절합니다. 이를 통해 전기, 중기, 후기를 관찰할 수 있으며, 특정 세포 주기 단계에 영향을 미치는 처리, 약물 또는 siRNA가 있을 때 그 시점을 확인할 수 있습니다. 우리의 목적에는 이것으로 충분하지만, 항상 더 정밀한 관찰을 지향합니다.우리는 항상 더 많은 측정 지점이나 더 세밀한 시간 및 간격 등을 원합니다. 따라서 이는 일종의 절충안입니다. 그러고 나서 시작 버튼을 누르겠습니다.따라서 저희 소프트웨어는 첫 번째 단계에서 자동 초점 조정 과정을 수행합니다. 시작 버튼을 누르면 자동 초점 조정이 시작되며, 초점을 맞추는 동안 셔터가 열리고 닫히는 것을 확인할 수 있습니다. 이제 시작 버튼을 누르겠습니다.이것이 셔터가 열리고 닫히는 모습입니다. Z축 모터가 작동하면서 실제로 가장 대비가 뚜렷한 평면, 즉 초점이 가장 잘 맞는 평면을 찾으려고 시도합니다. 화면을 통해 최적의 초점 평면을 찾기 위해 앞뒤로 움직이는 것을 볼 수 있는데, 이는 우려되는 부분일 수 있습니다.따라서 이 과정은 Z 모터를 구동하여 초점이 가장 잘 맞는 평면, 즉 이미지가 가장 선명한 지점을 찾는 것입니다. 그런 다음 해당 지점에서 사진을 획득하고 해당 Z 위치를 학습합니다. 이후 다음 12회 스캔 동안 이 Z 위치를 사용하게 됩니다.그런 다음 다시 자동 초점 단계를 수행하겠습니다. 어떤 종류의 실험을 하시나요? 저희 실험실은 주로 유사분열 진행을 조절하는 요인을 이해하는 데 관심이 있으며, 적어도 저는 그 부분을 이해하는 데 가장 큰 관심이 있습니다.따라서 라이브 셀 이미징, 특히 당사의 다중 위치 장기 이미징 현미경을 사용하면 세포가 유사분열에 진입하고 진행되는 과정을 2~3일 동안 촬영할 수 있으며, 여러 차례의 유사분열 과정을 이미지화하여 분석할 수 있습니다. 또한 연구하고자 하는 세포에 약물이나 RNA 또는 모든 종류의 섭동을 가할 수 있습니다. 이를 통해 해당 약물이나 유전자가 유사분열 진행을 조절하는 데 어떻게 작용하는지 이해할 수 있습니다.고정 세포 작업이 아닌 살아있는 세포 작업이기 때문에, 유사분열에 영향을 주기 위해 언제 섭동을 가해야 하는지, 또는 유사분열의 어떤 단계가 영향을 받는지 이해할 수 있습니다. 그런 점에서 매우 강력한 방법입니다. 이 실험의 주요 기술적 요소는 무엇인가요?발생 가능한 문제점은 무엇일까요? 우선, 장비를 설정하는 것 외에 가장 큰 문제는 장비 설정 자체가 간단하지 않다는 점입니다. 많은 사람이 장비를 보유하고 있지만, 자신의 실험 응용 분야에 맞게 장비가 제대로 작동하는지 확인하는 과정이 중요합니다.경제적 요소 또한 결코 작지 않습니다. 장치를 설정하는 과정이 있고, 데이터를 수집하고 나면 실제 데이터 분석 문제가 뒤따릅니다. 만약 각 필드당 30개의 세포가 포함된 동영상을 40개 수집했다면, 즉 40개의 필드를 촬영했고 각 필드에 30개의 세포가 있다면, 그 모든 동영상을 하나씩 살펴보며 동영상 속의 모든 세포를 확인해야 합니다.따라서 데이터 분석에 매우 오랜 시간이 소요됩니다. 즉, 데이터를 수집하는 데 이틀이 걸렸다면, 그 데이터를 분석하는 데는 일주일이 걸립니다. 이는 많은 양의 데이터를 수집하는 데 있어 매우 큰 장애물이 됩니다.따라서 이는 고처리량 데이터 수집 방식이기는 하지만, 고처리량 분석 방식은 아닙니다. 그렇다면 이 실험을 진정한 고처리량 방식으로 만들려면 어떻게 해야 할까요? 현재 저희 연구실에서는 데이터 분석을 자동으로 수행하는 프로그램을 개발하는 과정에 있습니다.그리고 상당히 괜찮은 프로그램입니다. 완벽하지는 않습니다. 항상 사람의 눈이 더 정확하지만, 점차 개선되고 있습니다.그렇다면 이 실험의 흥미로운 응용 분야는 무엇일까요? 세포 분열 외에 언급할 만한 다른 분야가 있을까요?그러니까, 오, 살아있는 세포 이미징(live cell imaging)을 말씀하시는 건가요? 네. 글쎄요, 세포 운동성 분석(cell motility assays)을 수행할 수 있습니다. 사용되는 현미경의 종류에 따라 다르겠지만, 원하신다면 세포의 움직임을 관찰하거나 종양 발달 과정을 살펴볼 수도 있을 것입니다.하지만 적절한 이미징 설정만 갖추고 있다면 무엇이든 거의 제한 없이 수행할 수 있습니다. 저희의 현미경은 마침 광시야(wide field)이며 20배 objective를 사용합니다. 따라서 해상도가 상당히 낮은 설정이지만, 저희가 확인해야 할 내용에는 충분합니다.따라서 가능하지만, 분명 제한되지는 않을 것입니다. 생물학처럼 역동적인 성격의 실험이 포함된 모든 분야는 라이브 셀 이미징(lifestyle imaging)을 통해 큰 도움을 받을 수 있습니다. 칼슘 이미징의 경우, 저희 장비로는 수행할 수 없지만, 이 역시 라이브 셀(live cell) 분석에 해당합니다.그 작업을 위해서는 반드시 살아있는 세포 이미징(live cell imaging)이 필요합니다. 말씀드린 것처럼 환자 분석이나 운동성 분석 같은 실험들은 살아있는 세포 이미징을 통해 큰 도움을 받을 수 있습니다. 이전의 관련 경험에 대해 간단히 말씀해 주시겠습니까?이 기술들을 얼마나 오래 연구하셨나요? 이전에는 어떤 연구를 하셨나요? 와. 그래서 박사 과정 동안에는 하지 않았습니다.저는 공초점 현미경 분석은 많이 수행했지만, 라이브 셀 이미징(lifestyle imaging)은 하지 않았습니다. 그래서 박사후연구원 과정 동안 King 박사님이 이 장비를 도입하는 것을 도와 Fragment 설정을 완료하고 가동시켰습니다. 결과적으로 박사후연구원 기간 동안 광시야 현미경을 이용한 타임랩스 이미징과 공초점 현미경을 이용한 타임랩스 이미징 모두에 대해 많은 경험을 쌓을 수 있었습니다.그리고 저는 이것이 정말 강력한 방법이라고 생각합니다. 많은 정보를 얻을 수 있지만, 완벽하게 작동하게 만드는 것은 쉽지 않습니다. 따라서 프로세스의 모든 작은 단계마다 세심한 주의와 디테일에 대한 철저한 관심이 정말로 필요합니다.그런 다음에도 여전히 문제가 발생할 수 있습니다. 따라서 까다로운 응용 분야이지만, 연구하고자 하는 과학적 문제를 해결하는 데 꼭 필요하다면 그 점에서는 매우 가치 있는 방법입니다. 다만 과정이 쉽지 않으므로, 숙련된 전문가의 도움을 받아 진행하시기 바랍니다.이것이 저의 조언입니다. 매우 유용합니다.

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