Name: Hippocampal 뉴런의 유전자 총을 Transfection (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 배우세요 해마 뉴런 유전자 전달을 위한 조직 분리 및 유전자총 전달법. 정밀한 슬라이서 스테이지를 활용한 뇌 해부 기술로 신경과학 연구의 재현성을 높이는 방법을 익히세요.

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hippocampal 뉴런의 유전자 총을 transfection

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Hippocampal 뉴런의 유전자 총을 Transfection

안녕하세요, 저는 Kma입니다. 저는 브라운 대학교의 Case Lab에서 근무하고 있습니다. 70% ethanol로 Clean Slicer 단계를 처리하십시오. 플레이트 인서트를 6개 묶음으로 배치하십시오.배지가 담긴 웰 플레이트를 준비하고 37°C에서 배양합니다. 핀셋을 사용하여 중뇌와 네 번째 뇌실 사이의 전뇌를 분리합니다. 한쪽의 해마를 분리하고, 반대편의 해마를 분리합니다. 분리한 해마들을 PBS 한 방울 위에 올립니다.PBS를 흡입하여 제거하고 조직 절편기를 사용하여 시상면 절편을 제작합니다. 절편기를 페트리 접시에 옮기는 과정을 반복하며, PBS로 세척하고 PBS와 배지를 조심스럽게 첨가 및 흡입하여 절편을 세척합니다. 핀셋을 사용하여 절편을 분리합니다.절편을 PBS와 배지로 세척합니다. 다시 절편을 플레이트에 옮겨 삽입합니다. 핀셋을 사용하여 절편 내의 배지를 흡입하여 제거합니다.유전자 총 호스를 헬륨 실린더에 연결합니다. 배럴을 유전자 총에 장착합니다. 매거진에 불렛을 채웁니다.매거진을 Jing 건에 삽입합니다. 헬륨 탱크 슈트의 압력을 조절합니다. 섹션 위에 EGFP 코팅 비드를 분사합니다.이제 시작하겠습니다.

gene-gun-transfection-of-hippocampal-neurons

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 DNA 코팅 황금 총알을 준비하는 방법을 설명하고 biolistically 교양 hippocampal 조각의 뉴런을 transfect 그러한 총알의 사용을 보여줍니다.

진 건 글머리 기호 및 슬라이스 문화 뉴런의 Biolistic Transfection의 준비

organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

이 프로토콜은 electroporation과 문화 마우스 hippocampal 및 대뇌 피질의 뉴런을 통해 transfect, 해부하다하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 장기 문화가 synaptogenesis 및 돌기 척추 분석 연구에 사용할 수 있지만 단기 문화는 축삭의 파생물과지도의 연구에 사용할 수 있습니다.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

출처: Keener, D. G., et al. 마우스 해마 흥분성 및 클래스 특이적 억제 뉴런의 다양한 기관형 절편 배양에 걸친 단일 세포 전기천공. J. Vis. 경험. (2020).이 비디오는 마우스 해마 절편 배양 내의 뉴런에 플라스미드 DNA를 도입하는 단일 세포 전기천공 과정을 보여줍니다. 이 절차에는 정확한 피펫 위치 지정, 압력 조정 및 전기천공 펄스가 포함되어 신경막을 일시적으로 투과시켜 유전자 전달을 촉진합니다. 전기천공 후, 슬라이스를 배양하여 도입된 관심 유전자의 발현을 가능하게 합니다.

마우스 해마 절편 배양에서 단일 세포 전기천공법을 통한 유전자 발현

출처: Denaxa, M., el al., 초기 출생 후 마우스 뇌에 화학유전적으로 조작된 피질 중간 뉴런 전구 세포의 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 관심 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터를 배아 뇌 절편의 중간 뉴런 전구 세포에 주입한 후 플라스미드 진입 및 유전자 발현을 위한 전기천공법을 시사하는 절차를 보여줍니다. 이러한 변형된 전구 세포는 나중에 뇌 장애 치료에 사용될 수 있습니다.

마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

인산 칼슘 침전은 배양 된 세포의 형질 전환을위한 편리하고 경제적 인 방법입니다. 최적화로, 일차 뉴런 같은 어려운 형질 세포에이 방법을 사용하는 것이 가능하다. 여기에서 우리는 astroglial 세포와 공 배양 된 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

최근 유기형 뇌 절편 제제의 개선으로 인해 생명 공학 응용 분야에 대한 이용이 가능해졌습니다. 유기형 절편(organotypic slice)은 기능적 시냅스 연결을 포함하여 생체 내 생물학의 국소적 구조적 특성을 유지합니다. 여기에서는 이러한 슬라이스를 라벨링하고 유전적으로 조작하기 위한 위치 선택적 생물학적 전달 방법을 제시합니다.

위치 선택성과 유전자는 수정 된 유전자 총을 사용의 Organotypic 뇌 조각에 타겟팅

제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.

정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

이 기술은 인간의 oncogene을 인코딩 복제 - 결함 retroviral 주식을 준비하는 효율적인 방법을 보여줍니다, 그리고 이후 마우스 모델에 myeloproliferative 질병의 유도에 사용.

293T 세포의 과도 Transfection하여 복제 - 결함이 레트로 바이러스의 생산

배우세요 해마 뉴런 유전자 전달을 위한 조직 분리 및 유전자총 전달법. 정밀한 슬라이서 스테이지를 활용한 뇌 해부 기술로 신경과학 연구의 재현성을 높이는 방법을 익히세요.

Hippocampal 뉴런의 유전자 총을 Transfection

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