Name: 성인 Zebrafish에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 총과 파인 해부 ( Danio rerio) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 배우세요 성인 Danio rerio의 내이 감각 상피 조직을 총해부와 파인해부 기법으로 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 모발세포 재생 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 국가 인간 게놈 연구소, 건강의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.

1 부 : 조직의 준비 <ol><li> 와 성인 zebrafish를 안락사 (에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate 소금, 0.03 %) MS - 222 버퍼. </li><li> 물고기 목을 벨. 아래턱을 잘라 최대 복부 측면과 해부 패드에 머리를 장소, 곤충 핀으로 조직을 고정. 두개골에 복부 부드러운 조직을 제거하고 해부 현미경 하에서 미세 핀셋 한 쌍의와 두개골 캡슐의 복부 부분을 깨서. </li><li> 4 ° C 하룻밤에 paraformaldehyde에서 생선 머리 (4 %) 이후의 수정 프로그램입니다. </li><li> 3 번 5 분 때마다 (인산은 1X, 살린 버퍼) PBS에 고정 생선 머리를 씻어. </li></ol> 2 부 : 내이 (内耳)의 총 해부 <ol><li> 복부 측면까지 함께 해부 패드에 생선 머리를 놓습니다. 곤충 핀으로 고정. 모든 다음 단계는 해부 현미경 하에서 실시하고 있습니다. </li><li> 고급 핀셋 한 켤레와 내이 (内耳)를 통해 두개골 뼈를 제거하고 다음 조심스럽게 내이 (内耳)의 조직을 당겨 : saccules, lagenae 및 utricles 있습니다. saccule과 lagena가 긴밀하게 함께 서로 부착 때문에 철수하는 동안 utricle (saccule 및 lagena에 앞쪽에), 해부하는 동안 다른 쪽 끝을 기관에서 분리하는 것입니다 매우 높다. </li><li> PBS (1X)에서 내이 (内耳)의 조직 놔. 더 이상의 미세 절개가 필요하지 않은 경우, PBS (1X)과 조직에게 2-3 번 씻어하고는 다른 실험 예 cryosections 사용할 수 있습니다. </li></ol> 파트 3 : 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 훌륭한 해부 <ol><li> 미세 절개는 깨끗한 유리 슬라이드에 PBS (1X)의 드롭 수행하실 수 있습니다. </li><li> 고급 핀셋 두 쌍이있는 utricle에서 utricular otolith를 제거하고, 원하는 경우, 벌금 족집게 한 켤레와 바늘 블레이드와 상피 조직에서가 아닌 감각 상피 조직과 innervation을 잘라. </li><li> 가능한 한 그대로 전체 saccule을 유지하려고하면서 saccular 및 lagenar 상피 조직을 분리하기 전에 lagenar otolith를 제거합니다. 복부 측면까지 함께 PBS 드롭의 조직을 놓으십시오. 조심스럽게 saccule과 lagena 사이에 잘​​라 바늘 블레이드를 사용합니다. 원하는 경우, 과도한 아닌 감각 상피 조직 및 고급 핀셋과 바늘 블레이드와 innvervation를 낸다. </li></ol> 파트 4 : 감각 상피 조직에있는 세포의 형광 염색법 <ol><li> 3 회, 5 분 때마다 PBT (1XPBS, 1 % 트리톤 X - 100)와 감각 상피 조직을 씻어. </li><li> 로 상피 조직을 품어 fluophore - 라벨 phalloidin (예 : 알렉사 플라워 488 Phalloidin, 1:1,000 희석) 실온에서 30 분. </li><li> 3 회, 10 분 때마다 PBT와 감각 상피 조직을 씻어. </li><li> 미디어를 장착과 함께 슬라이드에 상피 조직을 탑재하고 적절한 파장의 필터를 형광 현미경으로 스테인드 조직을 확인하십시오. </li><li> 성공적인 해부와 얼룩 후, 강력한 헤어 셀 번들 얼룩과 함께 그대로 상피 조직은 현미경 (그림 1) 아래에서 볼 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1211/fig1.png" alt="그림 1" /> 그림 1. saccular 감각 상피의 세포는 알렉사 밀가루 488 Phalloidin (녹색) 물들일되었습니다. 조직 샘플은 종이에 언급으로 해부와 스테인드되었습니다. 몇몇 사진은 샘플의 다른 위치에서 찍은 및 어도비 포토샵 7.0과 함께 기와되었습니다. 스케일 바 = 150μm.

이 프로토콜에서는, 우리는 우리가 감각 상피 조직의 세포와 subcellular 기능을 공부에 대한 조직 샘플을 준비하는 수 성인 zebrafish의 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 매출과 미세 절개를 설명했다. 성공적인 해부, 매우 첫 번째 단계, 고정을 수행하기 위해서는 매우 중요합니다. 이전 솔루션은 절개 중에 처리하기 어려운 조직의 밑에 - 고정의 결과 때문에 항상 신선한 paraformaldehyde 솔루션을 사용할 수 있는지 확인합니다. 그러나, 그것은 절개 후 면역 / histological 얼룩의 결과에 영향을 것이기 때문에 당신이 너무 오래를위한 고정 솔루션에서 그들을 떠날하여 조직을 통해 - 수정하지 않은지 확인하십시오. 또한, 적절한 크기에 잘 유지 해부 도구를 사용하면 특히 미세 해부에 대한, 물론 중요합니다. 이 총 해부 프로토콜은 또한 조직을 특정 DNAs / RNAS / 단백질의 추출에 대한 내이 ...

<table><tbody><tr><td>MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS (인산완충식염수, 10X)</td><td>시약</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI가 포함된 VECTASHIELD Hard Set 봉입제</td><td>시약</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>현미경</td><td>Nikon 기기</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>곤충 핀</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-40</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>도구</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>도구</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>바늘형 칼날</td><td>도구</td><td>샤포인트</td><td>78-6810</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>해부 패드</td><td>도구</td><td>eNasco</td><td>SB07840M</td><td></td></tr><tr><td>제브라피시</td><td>동물</td><td>다양한</td><td>입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주시기 바랍니다.</td><td></td></tr></tbody></table>

성인 zebrafish에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 총과 파인 해부 ( danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

내이 (内耳)에 Neurosensory 상피 조직은 청력과 균형 기능에 중요한 구조입니다. 따라서, 그것은 주로 세포의 두 가지 유형으로 구성되어있는 상피 조직의 세포 및 분자 기능을 이해하는 것이 중요합니다 : 세포 (HCs) 및 지원 전지 (SCS). 여기서 우리는 상피 구조가 고도로 공부 모든 척추 동물에 보존되어 있기 때문에 성인 zebrafish뿐만 아니라에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직을 연구하기 위해 선택할뿐만 아니라 성인 zebrafish는 HCs, 포유류는 출생 직후에 잃게하는 능력을 재생 할 수 있기 때문에. 우리는 HC 손실의 결과로 인간 심리 / 균형 적자의 임상 치료를 위해 도움이 될 수있는 성인 척추 동물의 내이 (内耳) HC 재생의 메커니즘을 연구하기위한 모델 시스템으로 성인 zebrafish의 내이 (内耳)를 사용합니다. 여기 우리는 성인 zebrafish에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 총 훌륭한 해부를하는 방법을 보여줍니다. 총 해부는 내이 (内耳)를 둘러싼 조직을 제거하고 우​​리가 감각 상피 조직의 세부 구조를 검사할 수있는 조직 섹션을 준비하는 데 도움이됩니다. 미세 절개은 개별 상피의 비 - 감각 상피 조직을 깨끗이 치우고 전체 마운트 상피 샘플에서 쉽게 전체 상피의 이질을 검토하는 데 있습니다.

성인 zebrafish의 내이 (内耳) 감각 상피는 성인 척추 동물의 머리 세포 재생의 메커니즘을 이해하는 좋은 모델 시스템이다. 이 프로토콜은 우리가 휴대 전화와 subcellular 수준에서 재생 이벤트를 공부에 대한 조직 샘플을 얻을 수를 통해 상피 조직의 미세 절개를 보여줍니다.

성인 Zebrafish에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 총과 파인 해부 ( Danio rerio)

내이의 신경감각 상피는 청각 및 평형 기능에 핵심적인 구조입니다. 따라서 ...을 이해하는 것이 중요합니다.

제브라피시의 내이에는 주머니 형태의 말단 기관인 구구(utricle), 낭(Saccule), 타원낭(Lagena)이 각각 한 쌍씩 세 쌍 존재합니다. 구구는 가장 앞쪽에 위치하며, 낭과 타원낭은 서로 밀접하게 부착되어 구구의 뒤쪽에 위치합니다. 육안 해부 후에도 낭과 타원낭은 부착된 상태로 유지되며, 이어지는 정밀 해부 과정에서 각 말단 기관 내의 돌과 같은 구조물인 이석(otolith)을 쉽게 확인할 수 있습니다. 낭과 타원낭은 복측에서 절개하여 서로 분리합니다.이석을 제거하고 비감각 상피 조직을 다듬어 세 개의 말단 기관 모두에서 감각 상피 조직을 얻습니다. 안녕하세요, 국립 인간 게놈 연구소(National Human Genome Research Institute) 발달 유전체학 부문의 Sean Burgess 연구실 소속 Jean Leon입니다. 오늘은 성체 제브라피쉬의 내이 감각 상피를 정밀하게 박리하는 절차를 보여드리겠습니다.저희 실험실에서는 내이 감각 상피의 유전자 발현을 연구하기 위해 이 과정을 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 해부를 시작하려면, buffered MS 2 22 0.03%를 사용하여 성체 제브라피시를 안락사시키십시오. 그다음 물고기의 머리를 절단하고 하악골을 제거합니다.다음으로, 머리 부분을 복측이 위로 향하게 하여 해부 패드 위에 놓고 해부 현미경 하에서 곤충 핀으로 조직을 고정합니다. 동일한 미세 핀셋을 사용하여 두개골 복측의 연조직을 제거합니다. 두개골 캡슐의 복측 부분을 깨서 엽니다.마지막으로, 물고기 머리를 4% Paraformaldehyde와 1X PBS가 담긴 작은 플라스틱 용기에 넣어 4°C에서 하룻밤 동안 고정합니다. Paraformaldehyde는 유해 폐기물로 간주되므로 폐기하십시오. 사용한 Paraformaldehyde 용액은 소속 기관의 실험실 안전 규정에 따라 폐기해야 함을 유의하시고, 고정된 물고기 머리를 1X PBS로 3회, 각 5분씩 세척하십시오.어류의 머리 고정이 완료되었으므로, 내이의 육안 해부를 시작할 수 있습니다. 먼저 어류의 머리를 복측이 위로 향하게 하여 해부 패드 위에 놓습니다. 곤충 핀을 사용하여 고정합니다.이 시점부터 나머지 작업은 해부 현미경 하에서 진행합니다. 미세 핀셋을 사용하여 내이 위의 두개골을 제거한 다음, 내이 조직인 구형낭, 타원낭, 반고리관을 조심스럽게 끌어냅니다. 타원낭과 반고리관은 서로 단단히 부착되어 있어 함께 끌어

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 성인 zebrafish에서 장기를 식별하고 해부를위한 절차를 설명합니다.

성인 Zebrafish에서 기관의 해부

이 문서는 망막 안료 상피 하나에서 세 일 postfertilization의 배아에게 부착과 않고 zebrafish의 망막 microdissect하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

여러 발달 단계에있는 zebrafish 심장의 해부 및 격리에 대한 명확하고 표준화된 방법 설명되어 있습니다. 주석과 부량 기법도 설명합니다.

애벌레의 심장 해부, 소년과 성인 Zebrafish, Danio rerio</em

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배우세요 성인 Danio rerio의 내이 감각 상피 조직을 총해부와 파인해부 기법으로 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 모발세포 재생 메커니즘 연구에 활용됩니다.

성인 Zebrafish에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 총과 파인 해부 ( Danio rerio)

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