April 6th, 2009
신경 튜브 형성 후, neuroepithelium은 수축과 튜브가 배아 두뇌 심실을 형성하기 위해 배아 뇌척수 (eCSF)로 채우고 동안 주름. 우리는 더 나은 라이브 배아에서 neuroepithelial 모양 대조적으로 액체 채워진 공간을 시각화이 뇌실 주입 기술을 개발했습니다.
이 절차는 제브라피시 배아의 병기로 시작됩니다. 배아가 관심 단계에 도달하면 코리온에서 제거합니다. 다음으로 배아를 장착하기 위한 피펫 팁이 있는 aros 코팅 접시에 구멍을 만들고 배아를 꼬리를 아래로 하여 구멍에 부드럽게 넣습니다.
배아가 장착된 후, 형광 다이는 뒷뇌를 통해 배아의 심실 공간으로 조심스럽게 주입됩니다. 심실 주사 후 배아를 이미지화하고 Photoshop을 사용하여 데이터를 처리합니다. 안녕하세요, 저는 매사추세츠 주 케임브리지에 있는 MIT의 화이트헤드 생물의학 연구소(Whitehead Institute for Biomedical Research)의 헤이즐 시브(Hazel Sieve) 박사 실험실의 제니퍼 거트먼(Jennifer Gutman)입니다.
오늘은 제브라피시 뇌실 주사 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 살아있는 제브라피쉬의 뇌실 형성 및 신경 상피 형태 형성을 연구합니다. 투명한 제브라피시 배아의 특성으로 인해 뇌실 모양을 특성화하는 것은 어려울 수 있습니다.
이 기술은 액체로 채워진 공간을 주변 조직과 구별하고 뇌실 형성 결함이 있을 수 있는 돌연변이 배아를 특성화하는 유용하고 간단한 방법입니다. 시작하겠습니다. 제브라피시 뇌심실 주사를 준비하기 위해 먼저 주사 바늘을 만듭니다.
Sutter 기기의 바늘 극성은 모세관 바늘을 당기는 데 사용됩니다. 그런 다음 모세관 바늘을 텍사스 레드 덱스트린과 같은 형광 염료로 채웁니다. 다음으로, 채워진 바늘은 미세 주입 장치의 마이크로 매니퓰레이터에 장착됩니다.
바늘을 비스듬히 적절한 크기로 자릅니다. 비스듬한 팁을 만들려면 바늘의 방울 크기를 측정하고 오일 주입당 1-2나노리터 사이인지 확인하십시오. 이 절차 단계를 시작하기 위해, Kimmel에 따르면 모든 배아의 배아는 관심 단계보다 30 분 일찍 주입되어야합니다.
예를 들어, 수정 후 24시간에 심실을 연구하려면 수정 후 23시간 30분에 배아를 주입합니다. 관심 단계의 배아를 실체 현미경 아래에 놓고 집게를 사용하여 배아에서 코리온을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 배아를 위한 아로스 접시는 1%아로스로 코팅된 플라스틱 접시를 사용하여 200마이크로리터의 플라스틱 피펫 팁으로 아로스에 구멍을 뚫습니다.
집게를 사용하여 구멍에서 aros 플러그를 조심스럽게 제거합니다. 배아와 배아 배지를 구멍이 있는 aros 접시에 옮깁니다. 배지에 trica를 첨가하여 배아를 마취하고 움직임을 방지합니다.
실험하는 동안 배아 꼬리를 구멍에 부드럽게 넣고 주입 장치가 배아의 뒤쪽에 오도록 방향을 잡습니다. 이제 배아가 배아 접시에 올바르게 배치되고 방향이 잡혔으므로 뇌실 주사를 맞을 준비가 되었습니다. 먼저, 바늘 끝이 고출력의 배아와 동일한 시야에 있도록 미세 조작 설정을 준비합니다.
아래의 뇌 조직에 부딪히지 않고 R zero R 하나의 힌지 포인트 바로 뒤에 있는 뒷뇌의 얇은 지붕 플레이트를 통해 바늘을 조심스럽게 넣고 심실을 완전히 채울 만큼만 염료를 주입합니다. 배아의 단계에 따라 심실 공간을 채우기 위해 여러 번의 주사가 필요할 수 있습니다. 배아가 주입되고 이미징 준비가 되면 배아를 위한 새로운 aros 접시가 준비됩니다.
깨끗한 1% 코팅된 접시를 사용하여 접시에 구멍을 뚫고 플러그를 제거합니다. 배아를 접시에 옮기고 트리카를 첨가하여 배아를 마취하고 움직임을 방지합니다. 심실을 주입한 배아의 꼬리를 구멍 안에 넣어 등쪽 이미지를 만듭니다.
이제 배아를 이미징할 준비가 되었습니다. 투과광을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 배아나 현미경을 움직이지 않는 것이 매우 중요합니다.
그런 다음 현미경의 설정을 변경하고 형광등으로 이미지를 촬영합니다. 투과광과 형광등이 모두 있는 측면 이미지를 촬영하도록 배아의 위치를 변경합니다. Photoshop의 이미지 처리를 위해 모든 이미지를 파일로 저장합니다.
Photoshop에서 이미지를 처리하려면 동일한 위치에서 촬영한 동일한 배아의 투과광과 형광등 이미지를 엽니다. 모든 설정이 동일한지 확인하십시오 각 이미지에 대해 형광등 이미지를 투과광 이미지로 드래그하고 선택한 형광등 이미지와 정확하게 정렬합니다. 이미지 조정을 선택한 다음 색상을 바꾸고 검은색 배경을 흰색으로 변경합니다.
replace color 창에서 형광 이미지의 색상이 균일하게 보일 때까지 흐릿함 계수를 오른쪽으로 조정합니다. 레이어 창에서 곱하기를 선택합니다. 오버레이 이미지를 보려면 심실 공간 이미지가 투과광 이미지와 일치해야 합니다. 정확하게.
이 파일을 저장하고 다른 이미지에 대해 반복합니다. 심실 주사가 올바르게 수행되면 이미지는 25시간 동안의 이미지에서 볼 수 있듯이 비확산 염료에서 날카로운 모서리를 가져야 합니다. 수정 후, 유형 배아 패널 A는 명시야 이미지, 패널 B는 형광 이미지, 패널 C는 오버레이 이미지를 보여줍니다.
오버레이 이미지의 측면도는 패널 D에 표시되어 있습니다.반면에, 심실 주사 중에 바늘이 너무 많이 삽입되면 심실 공간 아래의 뇌 조직으로 들어가 잘못된 주사로 이어질 수 있습니다. 그 결과 여기에 표시된 것처럼 심실 공간 외부와 난황에서 볼 수 있는 염료가 생성됩니다. 패널 E는 명시야 이미지를 보여줍니다.
패널 F는 형광 이미지를, 패널 G는 오버레이된 이미지를 보여줍니다. 오버레이된 이미지의 측면도는 패널 H에 표시되어 있으며, 화살표는 염료가 뇌실 공간을 벗어난 영역을 나타냅니다. 이 비디오에서는 발달 중인 제브라피시 뇌실에 형광 염료를 주입하는 방법을 시연했습니다.
이 방법은 주변 신경 상피와 대조적으로 뇌실 공간을 시각화하는 데 사용되며, 주변 뇌 조직의 모양뿐만 아니라 심실 공간의 모양을 결정하는 데 매우 유용합니다. 이 기술을 통해 살아있는 배아에서 시간이 지남에 따라 뇌실 형성 및 뇌 형태 형성 과정을 더 잘 이해할 수 있습니다. 뇌실 형성 결함을 연구하고 뇌 형태 형성 돌연변이의 초기 특성을 규명하는 데 탁월한 도구입니다.
그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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이 기사는 젤리피쉬 배아의 뇌실 주입 기술을 설명하여 배아의 뇌실을 시각화합니다. 이 방법은 살아있는 배아에서 신경상피 모양과 유체 역학의 이해를 향상시킵니다.
Visualizing fluid-filled cavities in live embryos supports mechanistic de-risking in neurodevelopmental target validation by clarifying structure-function relationships. This technique enables quantitative assessment of neuroepithelial dynamics, improving predictive confidence in early discovery. It aids in prioritizing genetic or pharmacological interventions based on phenotypic brain morphogenesis.
The method fits within early discovery workflows where phenotypic screening requires structural validation of fluid-filled compartments in living systems.