Name: Zebrafish의 두뇌 뇌실 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 배우세요 제브라피쉬 뇌실 주입 기술을 통해 살아있는 배아의 신경상피 형태와 뇌실 형성을 시각화하는 방법을. 형광 염료를 이용한 이 기법은 발달 생물학 및 신경과학 연구에 필수적인 도구입니다.

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저자는 실험실에서이 기술을 개발 로라 앤 로우 어리 감사하고 싶습니다. HS는 NIHMH70926에 의해 지원됩니다. 제니퍼 구츠맨은 CSBi / 머크 박사 친교에 의해 지원되었다.

프로토콜 1 부 : microinjection에 대비하여 <ol><li> 서터 인스 트루먼 트의 바늘 풀러를 사용하여 모세 바늘을 떼어하여 사출을위한 준비. </li><li> 형광 염료 (예 : 텍사스 - 레드 Dextran 등)로 바늘을 입력합니다. </li><li> micromanipulator과 microinjection 장치에 바늘을 탑재합니다. </li><li> beveled 팁을 만들 수있는 각도로 적절한 크기로 바늘을 잘라요. </li><li> 드롭 크기를 측정하고 기름 주입 당 1 2nl 사이에 있는지 확인합니다. </li></ol> 2 부 : 배아 준비 <ol><li> 관심의 무대 30 분만 일찍 배아를 주사. 예를 들어, 24 시간 게시물 수정 (HPF)에서 심실을 공부하기 위해, 23.5 HPF에서 배아를 주입. 킴멀 외에 따라 배아를 무대. (4). </li><li> stereomicroscope에서 신중하게 집게를 사용하여 태아의 chorion를 제거합니다. </li><li> 1% 아가로 오스와 코팅 플라스틱 접시를 사용하여 플라스틱 1-200 μl 피펫 팁있는 아가로 오스의 구멍을 찌르지. 조심스럽게 집게를 사용하여 구멍의 아가로 오스의 플러그를 제거합니다. </li><li> 구멍 아가로 오스 요리에 배아 미디어의 배아를 전송합니다. </li><li> 미디어에 추가 tricaine은 (웨스 터 필드 (5)에 따라 만들어진)은 배아를 마취 및 실험 도중 움직임을 방지하기 위해. </li><li> 부드럽게 구멍에 배아 꼬리를 장소, 사출 장치는 배아의 후부 측면에 있도록 동양 그것. </li></ol> 파트 3 : 뇌의 뇌실을 주입 <ol><li> 뇌의 뇌실을 삽입하려면 바늘 끝이 높은 전원 배아로보기 같은 분야에서되도록 미세 조작 설정을 주선해드립니다. </li><li> 조심스럽게 아래의 뇌 조직을 누르지 말고 r0/r1 hingepoint 단 후부 hindbrain의 얇은 roofplate를 통해 바늘을 넣어. </li><li> 주입은 충분히 완전히 심실을 채우기 위해 염료. 그것은 배아의 단계에 따라 뇌실 공간을 채우기 위해 여러 가지 주사 걸릴 수 있습니다. </li></ol> 4 부 : 영상 <ol><li> 깨끗한 1퍼센트 아가로 오스 - 코팅 접시를 사용하여 요리에 새로운 구멍을 찌르지, 플러그를 제거하고 배아를 마취하고 움직임을 방지하기 위해 tricaine를 추가합니다. </li><li> 지느러미 이미지의 구멍과 위치에 뇌실 - 주입된 배아의 꼬리를 놓습니다. </li><li> 전송 빛을 사용하여 이미지를 가져가라. </li><li> 그것은 배아 또는 현미경을 이동할하는 것은 매우 중요합니다. </li><li> 현미경의 설정을 변경하고 형광등과 이미지를 가져가라. </li><li> 전송 빛 형광 불빛 모두 측면 이미지를 취할 배아를 재조 정할. </li><li> 포토샵에서 이미지 처리를 위해 TIFF 파일로 이미지를 저장합니다. </li></ol> 제 5 부 : 이미지 처리 <ol><li> 포토샵에서 이미지를 처리​​하기 위해, 전송 조명과 같은 위치에서 찍은 같은 배아의 형광 이미지를 엽니다. 모든 설정은 각 이미지의 동일해야합니다. </li><li> 전송 빛의 이미지에 귀하의 형광 이미지를 드래그하고이를 정확하게 라인. </li><li> 형광 이미지가 선택된 상태에서 &quot;이미지&quot;, &quot;조정 선택&quot;다음 &quot;색상 바꾸기&quot;과 흰색에 검정색 배경을 변경할 수 있습니다. </li><li> 형광 이미지 색상의 균일 보인다 때까지 &quot;바꾸기 컬러&quot;창에서 오른쪽에있는 &quot;fuzziness&quot;요소를 조정합니다. </li><li> &#39;레이어&#39;창에서 오버레이 이미지를 볼 수 있습니다 &quot;곱하기&quot;을 선택합니다. 당신의 뇌실 공간 이미지가 정확하게 전송 빛의 이미지와 일치해야합니다. </li><li> 다른 이미지에 대해이 파일과 반복을 저장합니다. </li></ol> 대표 결과 / 결과 잘못된 사출 이미지의 예제 EH 표시하는 동안 적절한 뇌실 주입 이미지는 1 패널 AD 그림에 표시됩니다. 적절한 주사는 날카로운 가장자리와 비 확산 염료 있습니다. 바늘이 꽂혔어 너무 멀리 삽입 아래의 뇌 조직을 치는 경우에 발생합니다 잘못된 주사, 뇌실 공간의 볼 수 밖에 염료와 노른자가 발생할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1218/1218figure1.png" alt="그림 1" width="600" height="742" /> 그림 1. 25 HPF 야생 유형 태아의 뇌실 주사. (AD) 올바른 주사 방법과 (EH) 잘못된 주입 방법은 예제로 표시됩니다. 해당 형광 이미지 (A, E) 도설 브라이트 이미지 (B, F)와 같이 정확하고 잘못된 모두 주입 방법에 대한 형광 및 브라이트 이미지의 오버레이 (C, G). 화살표는 염색이 잘못된 뇌실 주입 ( &quot;문제 해결&quot;을 참조)로 인해 뇌의 뇌실 공간 넘어 간 영역을 나타냅니다. 앞의 모든 이미지 왼쪽입니다. 문제 해결 : <table border="1"><tbody><tr style="font-weight:bold; font-size:16px;"><td> 문제 </tD&gt; <td> 원인 </td><td> 치료제 </td></tr><tr><td> 당신은 바늘로 배아를 부수 있습니다. </td><td> 당신의 바늘이 너무 무딘거나 끝이 너무 큽니다. </td><td> 새 바늘로 시작하여 그것을 멀리 다시 휴식하지 않습니다. 베벨은 바늘 주사기 바늘처럼 날카로운 만들 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 염료 (그림 1E - H 참조) 배아와 노른자에 걸쳐있다. </td><td> 당신의 바늘은 조직을 통해 가서 뇌실 공간에서 체류하지 않았다. </td><td> 당신의 바늘을 충분히 예리하지 않을 수 있습니다 당신이 주사의 속도를 제어 수 없습니다 그래서. </td></tr><tr><td> 염료는 forebrain 너무 희미하거나하지 않습니다. </td><td> 당신은 주사만큼 충분히 높은 압력을 사용하지 않았거나 바늘은 멀리 당신이 염료를 주입 때 forebrain에 도달하는 앞쪽에되지 않았습니다. </td><td> 귀하의 분사 압력을 높이거나 사출 동안 바늘이 약간 더 앞쪽에 놓습니다. 자세한 내용은 forebrain에 필요한 경우에는 midbrain - hindbrain 경계를 통해 바늘을 넣을 수 있습니다. 당신은 또한 단순히 영상 전에 더욱 확산하는 염료에 대해 조금만 기다려 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 당신의 형광 이미지를 포토샵에서 색상 교체 후 가장자리 주위에 어두운 있습니다. </td><td> 당신은 색상 바꾸기 창에서 &quot;fuzziness&quot;설정을 변경하려면 잊어버렸습니다. </td><td> &quot;fuzziness&quot;그 색상 바꾸기 창에서 오른쪽에있는 모든 방법을 이동합니다. </td></tr><tr><td> 바늘이 찔린 hindbrain의 roofplate하지 않습니다. </td><td> 당신의 주사 바늘을 제대로 절단되지 않습니다. </td><td> 새로운 바늘을합니다. 당신이 주사를 많이하고있다면 그들이 무딘 얻을 수있는 몇 가지 바늘이 필요할 수 있습니다. </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Gutzman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).</li>
<li>Lowery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+Classification+of+Zebrafish+Brain+Morphology+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).</li>
</ol>

이 비디오에서 우리는 zebrafish 두뇌 ​​심실 개발에 형광 염료 (텍사스 - 레드 Dextran)를 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 주변 neuroepithelium 달리 뇌 뇌실 공간을 시각화하는 데 사용과 뇌실 공간의 형태뿐 아니라 주변의 뇌 조직의 모양을 결정하는 매우 유용합니다. 우리가 더 나은 살아있는 배아에서 시간이 지남에 따라 뇌 뇌실 형성 및 뇌 morphogenesis의 과정을 이해할 수 있습니다. 이 기술은 뇌의 뇌실 형성 결함을 공부 및 초기 특성화 및 뇌 morphogenesis의 돌연변이 연구를위한 훌륭한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>포셉(Forceps)</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>모세관 튜브(바늘)</td><td>도구</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 코팅 디쉬</td><td>도구</td><td>Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)</td><td>Agarose (50027) Dishes (430166)</td><td>주입하려는 배아의 단계에 따라 디쉬 내 아가로스 층의 깊이를 약 2-3 mm로 만듭니다.</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 기능 및 이미지 캡처 소프트웨어가 탑재된 현미경 카메라</td><td>도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu; 파이펫 팁</td><td>도구</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0806</td><td>아가로스에 구멍을 뚫어 배아가 딱 맞게 들어가게 하기에 최적의 크기입니다.</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>이미지 분석</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>배아 루프(Embryo Loop)</td><td>도구</td><td></td><td></td><td>유리 파이펫과 머리카락 또는 낚싯줄을 사용하여 직접 제작하고 밀랍으로 밀봉합니다.</td></tr><tr><td>마이크로인젝터(Microinjector)</td><td>도구</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PL1-100</td><td></td></tr><tr><td>니들 풀러(Needle Puller)</td><td>도구</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>설정값 (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).</td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터(Micromanipulator)</td><td>도구</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 염료 Texas-Red Dextran 70,000MW</td><td>시약</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td>필요에 따라 다른 분자량의 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>배아 배지</td><td>시약</td><td></td><td></td><td>Westerfield (5)의 방법에 따름</td></tr></tbody></table>

zebrafish의 두뇌 뇌실 주입

Zebrafish Brain Ventricle Injection

배아 두뇌 개발하는 동안 적절한 두뇌 뇌실 형성은 정상적인 뇌 기능이 필요합니다. 뇌 심실은 뇌척수로 가득하는 두뇌 내의 고도 보존 충치 있습니다. 그것이 두뇌 뇌실 형성의 결과로 액체로 채우고있는 동안 zebrafish에서 신경 튜브 형성 후, neuroepithelium는 constrictions과 주름 일련의를 겪습. 뇌실 형성 과정과 동시에 발생하는 neuroepithelial 모양의 변화를 이해하기 위해서, 우리는 뇌 조직에 비해 뇌실 공간을 시각화하는 방법이 필요했습니다. 그러나, 투명한 zebrafish의 배아의 본질은 어려운 뇌실 우주에서 조직을 차별화 수 있습니다. 따라서, 우리는 뇌실 공간이 형광 염료 가득한과 브라이트 및 형광 현미경으로 몇 군데있는 두뇌 뇌실 사출 기술을 개발했습니다. 브라이트과 형광 이미지는 다음 처리와 포토샵으로 겹쳐있다. 이 기법은 브라이트 이미지의 neuroepithelium의 형태 비교, 형광 염료와 뇌실 공간의 시각화를위한 수 있습니다. zebrafish의 뇌 뇌실 주입은 초기 애벌레 단계를 통해 18시간 게시물 수정에서 근무하실 수 있습니다. 우리는뿐만 아니라 두뇌 morphogenesis의 돌연변이 (1-3)를 특성화 같이 뇌실 뇌 형성과 morphogenesis 우리의 연구에 광범위하게이 기술을 사용했습니다.

신경 튜브 형성 후, neuroepithelium은 수축과 튜브가 배아 두뇌 심실을 형성하기 위해 배아 뇌척수 (eCSF)로 채우고 동안 주름. 우리는 더 나은 라이브 배아에서 neuroepithelial 모양 대조적으로 액체 채워진 공간을 시각화이 뇌실 주입 기술을 개발했습니다.

Zebrafish의 두뇌 뇌실 주입

배아 뇌 발달 과정 중 적절한 뇌실 형성은 정상적인 뇌 기능에 필수적입니다. 뇌실은 고도로 보존된...

본 절차는 제브라피시 배아의 단계 설정부터 시작합니다. 배아가 원하는 단계에 도달하면 난막(corion)에서 분리합니다. 다음으로 피펫 팁을 사용하여 아가로스 코팅 디쉬에 배아를 고정할 구멍을 만들고, 배아의 꼬리 부분이 아래로 향하도록 구멍에 조심스럽게 배치합니다.배아를 고정한 후, 후뇌를 통해 배아의 뇌실 공간에 형광 염료를 조심스럽게 주입합니다. 뇌실 주입 후 배아를 촬영하며, 데이터는 Photoshop을 사용하여 처리합니다. 안녕하세요, 저는 매사추세츠주 캠브리지에 위치한 MIT 화이트헤드 생의학 연구소의 Hazel Sieve 박사 연구실의 Jennifer Gutman입니다.오늘은 제브라피시 뇌실 주입 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 살아있는 제브라피시의 뇌실 형성 및 신경 상피 형태 발생을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 제브라피시 배아는 투명한 특성을 가지고 있어, 뇌실의 형태를 규명하는 것이 어려울 수 있습니다.이 기술은 액체로 채워진 공간을 주변 조직과 구별하고, 뇌실 형성 결함이 있을 수 있는 돌연변이 배아의 특성을 분석하는 데 유용한 간단한 방법입니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 제브라피쉬 뇌실 주입을 준비하기 위해, 먼저 주입용 바늘을 제작하는 것부터 시작하겠습니다.Sutter 기기의 니들 풀러(needle puller)를 사용하여 모세관 바늘을 제작합니다. 그 다음 모세관 바늘에 Texas red dextrin과 같은 형광 염료를 채웁니다. 이어서, 염료가 채워진 바늘을 미세주입 장치의 마이크로 매니퓰레이터(micro manipulator)에 장착합니다.바늘을 적절한 크기로 비스듬하게 자릅니다. 베벨 팁(beveled tip)을 만들기 위해, 바늘의 방울 크기를 측정하여 오일 내 주입당 1~2 nanoliters 사이인지 확인하십시오. 이 실험 단계의 절차를 시작하려면, Kimmel의 기준에 따라 모든 배아에 관심 단계보다 30분 일찍 주입해야 합니다.예를 들어, 수정 후 24시간째의 뇌실을 연구하려면 수정 후 23시간 30분에 배아에 주입하십시오. 관심 단계의 배아를 실체 현미경 아래에 두고, 핀셋을 사용하여 배아에서 난막을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 1% agarose가 코팅된 플라스틱 접시를 사용하여 배아용 agarose 디쉬를 만들고, 100~200 µL 피펫 팁으로 agarose에 구멍을 뚫습니다.포셉을 사용하여 구멍에서 aros 플러그를 조심스럽게 제거합니다. 배아와 배아 배지를 구멍이 있는 aros 디쉬로 옮깁니다. 배아를 마취시키고 움직임을 방지하기 위해 배지에 trica를 첨가합니다.실험 과정 중, 배아의 꼬리 부분이 아래로 향하게 하여 구멍에 조심스럽게 넣고, 주입 장치가 배아의 후측에 위치하도록 방향을 잡습니다. 이제 배아가 아가로즈 디쉬 내에 올바르게 배치되고 방향이 설정되었으므로, 뇌실 주입을 시작할 준비가 되었습니다. 먼저, 고배율 상태에서 바늘 끝이 배아와 동일한 시야에 들어오도록 마이크로 조작 장치를 조정합니다.바늘을 R0-R1 경첩점(hinge point) 바로 뒤쪽의 후뇌 얇은 지붕판(roof plate)을 통해, 아래쪽의 뇌 조직을 건드리지 않도록 조심스럽게 삽입한 후, 뇌실이 완전히 채워질 정도의 염료만 주입합니다. 배아의 단계에 따라 뇌실 공간을 채우기 위해 여러 번의 주입이 필요할 수 있습니다. 배아에 주입을 마치고 이미징 준비가 되면, 배아를 위한 새로운 아가로스(agarose) 접시를 준비합니다.깨끗한 1%aros 코팅 접시를 사용하여 접시에 구멍을 뚫고 플러그를 제거합니다. 배아를 접시로 옮기고 trica를 첨가하여 배아를 마취시키고 움직임을 방지합니다. 뇌실에 주입된 배아의 꼬리 부분을 구멍에 배치하여 배측 이미지를 촬영할 수 있도록 위치시킵니다.이제 배아를 이미징할 준비가 되었습니다. 투과광을 사용하여 이미지를 촬영하십시오. 배아나 현미경을 움직이지 않는 것이 매우 중요합니다.다음으로, 현미경 설정을 변경하고 형광광을 이용하여 이미지를 촬영하십시오. 배아의 위치를 조정하여 투과광과 형광광 모두로 측면 이미지를 촬영하십시오. 모든 이미지를 Photoshop 이미지 처리를 위해 파일로 저장하십시오.Photoshop에서 이미지를 처리하려면, 동일한 위치에서 촬영한 동일한 배아의 투과광 및 형광광 이미지를 엽니다. 모든 설정이 동일한지 확인하십시오. 각 이미지에 대해, 형광 이미지를 투과광 이미지 위로 드래그하고 형광 이미지가 선택된 상태에서 정확하게 정렬합니다. 이미지 조절(image adjustments)을 선택한 다음, 색상 대체(replace color)를 통해 검은색 배경을 흰색으로 변경합니다.색상 대체(replace color) 창에서 형광 이미지의 색상이 균일하게 보일 때까지 허용치(fuzziness) 인자를 오른쪽으로 조정하십시오. 레이어 창에서 곱하기(multiply)를 선택하십시오. 오버레이 이미지를 확인했을 때, 뇌실 공간(ventricle space) 이미지와 투과광 이미지가 정확히 일치해야 합니다.이 파일을 저장하고 다른 이미지들에 대해서도 동일하게 반복하십시오. 뇌실 주입이 정확하게 수행되었다면, 수정 후 25시간 된 배아의 이 이미지들에서 보는 바와 같이 염료가 확산되지 않은 부분의 경계가 뚜렷하게 나타나야 합니다. 패널 A는 명시야 이미지를, 패널 B는 형광 이미지를, 패널 C는 중첩 이미지를 보여줍니다.오버레이 이미지의 측면도가 패널 D에 제시되어 있습니다. 반면에, 뇌실 주입 중에 바늘이 너무 깊게 삽입되면 뇌실 공간 아래의 뇌 조직으로 진입하여 잘못된 주입으로 이어질 수 있습니다. 이 경우 여기에서 보는 것처럼 염료가 뇌실 공간 외부와 난황에서 관찰됩니다. 패널 E는 명시야 이미지를 보여줍니다.패널 F는 형광 이미지를, 패널 G는 중첩 이미지를 보여줍니다. 중첩 이미지의 측면도는 패널 H에 나타나 있습니다. 화살표는 염료가 뇌실 공간 너머로 퍼진 영역을 나타냅니다. 본 영상에서는 발달 중인 제브라피시 뇌실에 형광 염료를 주입하는 방법을 시연하였습니다.이 방법은 주변 신경 상피와 대비하여 뇌실 공간을 시각화하는 데 사용되며, 뇌실 공간의 형태뿐만 아니라 주변 뇌 조직의 형태를 결정하는 데 매우 유용합니다. 이 기술을 통해 살아있는 배아에서 시간에 따른 뇌실 형성 과정과 뇌 형태 형성 과정을 더 잘 이해할 수 있습니다. 이는 뇌실 형성 결함을 연구하고, 뇌 형태 형성 돌연변이의 초기 특성을 분석하는 데 탁월한 도구입니다.여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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