Zebrafish의 두뇌 뇌실 주입

본 절차는 제브라피시 배아의 단계 설정부터 시작합니다. 배아가 원하는 단계에 도달하면 난막(corion)에서 분리합니다. 다음으로 피펫 팁을 사용하여 아가로스 코팅 디쉬에 배아를 고정할 구멍을 만들고, 배아의 꼬리 부분이 아래로 향하도록 구멍에 조심스럽게 배치합니다.

배아를 고정한 후, 후뇌를 통해 배아의 뇌실 공간에 형광 염료를 조심스럽게 주입합니다. 뇌실 주입 후 배아를 촬영하며, 데이터는 Photoshop을 사용하여 처리합니다. 안녕하세요, 저는 매사추세츠주 캠브리지에 위치한 MIT 화이트헤드 생의학 연구소의 Hazel Sieve 박사 연구실의 Jennifer Gutman입니다.

오늘은 제브라피시 뇌실 주입 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 살아있는 제브라피시의 뇌실 형성 및 신경 상피 형태 발생을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 제브라피시 배아는 투명한 특성을 가지고 있어, 뇌실의 형태를 규명하는 것이 어려울 수 있습니다.

이 기술은 액체로 채워진 공간을 주변 조직과 구별하고, 뇌실 형성 결함이 있을 수 있는 돌연변이 배아의 특성을 분석하는 데 유용한 간단한 방법입니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 제브라피쉬 뇌실 주입을 준비하기 위해, 먼저 주입용 바늘을 제작하는 것부터 시작하겠습니다.

Sutter 기기의 니들 풀러(needle puller)를 사용하여 모세관 바늘을 제작합니다. 그 다음 모세관 바늘에 Texas red dextrin과 같은 형광 염료를 채웁니다. 이어서, 염료가 채워진 바늘을 미세주입 장치의 마이크로 매니퓰레이터(micro manipulator)에 장착합니다.

바늘을 적절한 크기로 비스듬하게 자릅니다. 베벨 팁(beveled tip)을 만들기 위해, 바늘의 방울 크기를 측정하여 오일 내 주입당 1~2 nanoliters 사이인지 확인하십시오. 이 실험 단계의 절차를 시작하려면, Kimmel의 기준에 따라 모든 배아에 관심 단계보다 30분 일찍 주입해야 합니다.

예를 들어, 수정 후 24시간째의 뇌실을 연구하려면 수정 후 23시간 30분에 배아에 주입하십시오. 관심 단계의 배아를 실체 현미경 아래에 두고, 핀셋을 사용하여 배아에서 난막을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 1% agarose가 코팅된 플라스틱 접시를 사용하여 배아용 agarose 디쉬를 만들고, 100~200 µL 피펫 팁으로 agarose에 구멍을 뚫습니다.

포셉을 사용하여 구멍에서 aros 플러그를 조심스럽게 제거합니다. 배아와 배아 배지를 구멍이 있는 aros 디쉬로 옮깁니다. 배아를 마취시키고 움직임을 방지하기 위해 배지에 trica를 첨가합니다.

실험 과정 중, 배아의 꼬리 부분이 아래로 향하게 하여 구멍에 조심스럽게 넣고, 주입 장치가 배아의 후측에 위치하도록 방향을 잡습니다. 이제 배아가 아가로즈 디쉬 내에 올바르게 배치되고 방향이 설정되었으므로, 뇌실 주입을 시작할 준비가 되었습니다. 먼저, 고배율 상태에서 바늘 끝이 배아와 동일한 시야에 들어오도록 마이크로 조작 장치를 조정합니다.

바늘을 R0-R1 경첩점(hinge point) 바로 뒤쪽의 후뇌 얇은 지붕판(roof plate)을 통해, 아래쪽의 뇌 조직을 건드리지 않도록 조심스럽게 삽입한 후, 뇌실이 완전히 채워질 정도의 염료만 주입합니다. 배아의 단계에 따라 뇌실 공간을 채우기 위해 여러 번의 주입이 필요할 수 있습니다. 배아에 주입을 마치고 이미징 준비가 되면, 배아를 위한 새로운 아가로스(agarose) 접시를 준비합니다.

깨끗한 1%aros 코팅 접시를 사용하여 접시에 구멍을 뚫고 플러그를 제거합니다. 배아를 접시로 옮기고 trica를 첨가하여 배아를 마취시키고 움직임을 방지합니다. 뇌실에 주입된 배아의 꼬리 부분을 구멍에 배치하여 배측 이미지를 촬영할 수 있도록 위치시킵니다.

이제 배아를 이미징할 준비가 되었습니다. 투과광을 사용하여 이미지를 촬영하십시오. 배아나 현미경을 움직이지 않는 것이 매우 중요합니다.

다음으로, 현미경 설정을 변경하고 형광광을 이용하여 이미지를 촬영하십시오. 배아의 위치를 조정하여 투과광과 형광광 모두로 측면 이미지를 촬영하십시오. 모든 이미지를 Photoshop 이미지 처리를 위해 파일로 저장하십시오.

Photoshop에서 이미지를 처리하려면, 동일한 위치에서 촬영한 동일한 배아의 투과광 및 형광광 이미지를 엽니다. 모든 설정이 동일한지 확인하십시오. 각 이미지에 대해, 형광 이미지를 투과광 이미지 위로 드래그하고 형광 이미지가 선택된 상태에서 정확하게 정렬합니다. 이미지 조절(image adjustments)을 선택한 다음, 색상 대체(replace color)를 통해 검은색 배경을 흰색으로 변경합니다.

색상 대체(replace color) 창에서 형광 이미지의 색상이 균일하게 보일 때까지 허용치(fuzziness) 인자를 오른쪽으로 조정하십시오. 레이어 창에서 곱하기(multiply)를 선택하십시오. 오버레이 이미지를 확인했을 때, 뇌실 공간(ventricle space) 이미지와 투과광 이미지가 정확히 일치해야 합니다.

이 파일을 저장하고 다른 이미지들에 대해서도 동일하게 반복하십시오. 뇌실 주입이 정확하게 수행되었다면, 수정 후 25시간 된 배아의 이 이미지들에서 보는 바와 같이 염료가 확산되지 않은 부분의 경계가 뚜렷하게 나타나야 합니다. 패널 A는 명시야 이미지를, 패널 B는 형광 이미지를, 패널 C는 중첩 이미지를 보여줍니다.

오버레이 이미지의 측면도가 패널 D에 제시되어 있습니다. 반면에, 뇌실 주입 중에 바늘이 너무 깊게 삽입되면 뇌실 공간 아래의 뇌 조직으로 진입하여 잘못된 주입으로 이어질 수 있습니다. 이 경우 여기에서 보는 것처럼 염료가 뇌실 공간 외부와 난황에서 관찰됩니다. 패널 E는 명시야 이미지를 보여줍니다.

패널 F는 형광 이미지를, 패널 G는 중첩 이미지를 보여줍니다. 중첩 이미지의 측면도는 패널 H에 나타나 있습니다. 화살표는 염료가 뇌실 공간 너머로 퍼진 영역을 나타냅니다. 본 영상에서는 발달 중인 제브라피시 뇌실에 형광 염료를 주입하는 방법을 시연하였습니다.

이 방법은 주변 신경 상피와 대비하여 뇌실 공간을 시각화하는 데 사용되며, 뇌실 공간의 형태뿐만 아니라 주변 뇌 조직의 형태를 결정하는 데 매우 유용합니다. 이 기술을 통해 살아있는 배아에서 시간에 따른 뇌실 형성 과정과 뇌 형태 형성 과정을 더 잘 이해할 수 있습니다. 이는 뇌실 형성 결함을 연구하고, 뇌 형태 형성 돌연변이의 초기 특성을 분석하는 데 탁월한 도구입니다.

여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.