초점 칼슘 ^{2 + 과도 감지}

먼저, 칼슘 로딩 용액을 준비하고 데우고 거품을 일으킵니다. 방광을 절개하고, 열고, 평평하게 핀으로 고정하고, 배뇨근 스트립을 채취합니다. 배설물 스트립을 로딩 용액에 첨가하고, 배양 및 헹구고, 평평하게 핀으로 고정합니다.

조직 내의 칼슘 층 4는 레이저 광에 의해 여기되고 방출된 빛은 결과적으로 포착됩니다. 개별 프레임으로 구성된 동영상은 연속적인 프레임을 비교하여 분석됩니다. 배경이 뺍니다.

cell edge threshold는 이벤트를 찾을 수 있는 위치를 결정하고 연속적인 뇌 간의 비율을 취합니다. 나머지 이벤트가 사전 정의된 기준과 일치하면 강조 표시되고 레이블이 지정됩니다. 안녕하세요, 제 이름은 옥스퍼드 대학교 약리학과의 Keith Brain과 Tom Kinane 실험실의 John Young입니다.

저는 Brain and Canne Labs의 Rob Amos이고 제 이름은 Keith Brain입니다. 오늘, 존과 롭은 평활근의 칼슘 이미징 기술을 보여줄 것입니다. 우리는 실험실에서 이것을 사용하여 자율 신경에서 신경 전달 물질의 방출과 평활근에 미치는 영향을 연구합니다.

시작하겠습니다. 칼슘 지시약 기관 녹색, 4 88 BAFTA 1:00 AM은 500 마이크로 그램의 분말이 들어있는 500 마이크로 리터 바이알로 제공됩니다. 분말에 Onic F1 27 용액 40 마이크로 리터에서 칼슘 지시약을 준비하고 생리 식염수 PSS 460 마이크로 리터에서 30 초 동안 부드럽게 흔든 후 다시 30 초 동안 부드럽게 흔든다.

최종 용액은 장기 녹색의 10 마이크로 어금니입니다. 4 88 BAFTA 1:00 AM은 각각 125 마이크로 리터의 4 개의 분취액을 제공합니다. 빛에 노출되지 않도록 하고 관심 조직을 해부하기 전에 용액을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

냉동실에서 칼슘 지시약을 꺼내 칼슘 지시약이 묽은 상태에서 실온에서 해동합니다. PSS 1ml를 시험관에 넣고 섭씨 33도의 수조에 넣습니다. 마개로 버블러를 시험관에 고정하거나 퍼필을 사용한 다음 95%산소와 5%의 이산화탄소 혼합물로 초당 약 1개의 기포가 나타나는 속도로 버블을 만들 수도 있습니다.

동물에서 평활근 기관을 해부합니다. 이 경우 쥐의 방광입니다. 조직을 조심스럽게 씻은 후 장기를 약 50mm의 PSS에 넣고 세척하고 ciero 지방 조직과 결합 조직을 제거합니다.

방광에 대한 평활근 laurean 유형에 따라 절개합니다. 방광 목에서 세로로 열리고, 코들 끝은 돔 상단까지 열립니다. 두개골 끝은 우세한 근육 다발의 방향으로 절단하는 resser의 등쪽 표면을 따라 길이 6-8mm, 너비 1-2mm의 4 개의 스트립을 준비합니다.

절개된 조직과 전쟁 전 및 거품이 일어난 PSS를 놓고 칼슘 지시약을 125마이크로리터의 10마이크로몰 장기 녹색, 4 88 B에서 1:00 AM까지 시험관의 조직에 로드하고 손으로 약간 흔들어 섞습니다. 튜브를 수조에 다시 넣습니다. 거품을 다시 일으키고 호일 시트로 수조를 덮으십시오.

충분한 조직이 칼슘 지표를 흡수하는 데 걸리는 시간은 조직의 크기와 평활근층의 두께에 따라 다릅니다. 예를 들어, 쥐 배설물과 쥐 황소의 경우 70분입니다. 쥐 배설물 및 마우스 VA 딘의 경우 120 분 동안 배양합니다.

조직에 칼슘 지시약이 로드되면 현미경 검사를 위해 준비할 수 있습니다. 먼저 거품이 일어난 PSS로 조직을 10분 동안 헹굽니다. 다음으로, S 가드가 늘어선 준비 접시에 티슈를 장착합니다.

약간 늘려 평평한 시트를 만듭니다. 짧은 길이를 사용하여 조직을 고정합니다. 예를 들어, 25-50 마이크로 미터 직경의 은선 2 밀리미터를 선택하고 핀을 비스듬히 삽입합니다.

길이가 몇 mm보다 긴 핀은 대물렌즈를 긁을 수 있으므로 사용하지 마십시오. 조직의 자발적인 발생을 최소화하고 이미징에 적합한 부위의 위치를 용이하게 하는 것부터 조직을 조심스럽게 고정하는 것이 중요합니다. 조직을 고정한 후 준비 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다.

PSS가 접시의 실 가드가 늘어선 영역에서 탈출하지 않도록 주의하십시오. 이로 인해 많은 영역이 PSS로 덮일 수 있습니다. 시연을 위해 초융합이 시작되면 다음 단계가 빛 아래에서 수행됩니다.

이러한 실험은 일반적으로 어둠 속에서 수행됩니다. 준비를 슈퍼 퓨즈하기 위해 펌프를 켜십시오. PSS를 사용하면 시간당 100밀리리터의 속도가 자주 사용됩니다.

히터 장치를 켜고 유입 및 유출 튜브와 온도 프로브를 바닥의 자석으로 금속 스트립에 각각 고정하는 준비 접시에 놓습니다. 유출 튜브의 팁 높이에 따라 PSS의 깊이가 결정됩니다. 유출이 실제로 PSS를 제거하지 않는 경우도 있으므로 주의해야 합니다.

처음에는 히터 장치의 온도를 섭씨 33도에서 35도 사이의 원하는 온도에 도달하도록 설정하십시오. 조직이 저전력 대물렌즈로 최소 10분 동안 평형을 이루도록 합니다. 10회 또는 20회.

에피 형광 또는 청색광으로 흥미진진하게 사용하여 평활근을 보고 모니터링하기에 적합한 영역을 식별합니다. 여기에 노출된 이후, 조명은 표시기를 광표백합니다. 한 번에 몇 초 이상 사용하지 마십시오.

밝은 구조가 있는 시야는 이미지 감지 알고리즘에서 많은 수의 오탐을 유발할 수 있으므로 피하십시오. 현장에서 움직임이 최소화되고 평활근 세포가 많은 부위를 선택하십시오. 이미지를 설정할 사이트를 선택했으면 40 x와 같은 더 높은 출력의 목표로 전환합니다.

평활근 세포가 수평으로 놓이도록 스테이지 또는 광축을 회전합니다. 이는 고속 스캔 축과 평행합니다. 평활근 세포는 이제 컨포칼 현미경으로 이미징할 준비가 되었습니다.

이 프로토콜에서는 Leica SP two 정립 컨포칼 현미경을 사용합니다. 통풍이 잘 되는 디스크 하나에 핀홀을 닫습니다. custo optic 조정 가능한 필터에서 레이저 출력을 25%에서 35% 사이로 설정합니다.

이 값은 밝기와 광 표백 사이의 절충안입니다. 데이터 분석을 준비하려면 이미지 J를 다운로드하여 설치합니다.플랫폼별 버전을 다운로드한 다음 최신 ImageJ jar 파일을 다운로드하여 이전 파일을 대체하여 최신 버전으로 업데이트합니다. 그런 다음 Excel 작성기 jar 파일을 다운로드하여 플러그인 jar 디렉토리에 설치합니다.

이 파일을 플러그인 디렉토리에 복사합니다. 플러그인 매크로를 사용하여 이러한 각 스크립트를 설치합니다. 이미지 J.The 소프트웨어 설치 Leica SP 두 개의 컨포칼 현미경 우리가 Leica라고 부르

LCS는 각 시리즈의 개별 프레임을 별도의 파일로 저장합니다. 시리즈를 재구성하기 위해. 재구성할 모든 프레임이 단일 폴더에 있는지 확인합니다.

예를 들어 데이터 폴더 tiffs가 있습니다. 그런 다음 플러그인 매크로 메뉴에서 Leica SP 두 스태커 매크로를 선택합니다. 이 경우 데이터 폴더에서 루트 디렉토리를 선택합니다.

드롭다운 목록에서 원하는 폴더를 선택합니다. 이 경우 tiffs는 출력 디렉토리를 선택하거나 새 디렉토리를 생성합니다. 예를 들어 데이터 폴더 스택이 있습니다.

그런 다음 스크립트는 움직임을 수정하기 위해 개별 프레임에서 시리즈를 재구성합니다. 우리는 시리즈 다운로드 스택, 리그 및 터보 reg 내에서 프레임을 정렬하거나 일치시키는 무료로 사용 가능한 알고리즘을 사용합니다. 각각에 대한 파일을 stacks 폴더에 복사합니다.

처리할 스택을 로드한 다음, 관심 영역을 명확하게 보여주는 프레임으로 이동합니다. 다른 프레임은 이 참조 프레임에 정렬됩니다. 그런 다음 플러그인 스택으로 이동합니다.

스택 등록 서로 다른 변환을 각각 시도하여 각 사이트에 가장 효과적인 것이 무엇인지 확인합니다. 칼슘 과도 현상의 검출에 영향을 미치는 이미지화된 요인은 특정 특성, 각 부위의 입자 매개변수를 측정함으로써 달라질 수 있습니다.

검출의 민감도와 특이도가 증가합니다. 따라서, 각 사이트에 대해, ratio와 cell edge threshold에 대한 뺀 임계값에 대한 임계값을 계산할 것입니다. 시작하려면 플러그인, 매크로로 이동하여 jn CTO dot oh eight 릴리스 dot IJM JM을 설치하고 선택하십시오. 그런 다음 플러그인 매크로 로드 스택으로 이동합니다.

계열을 선택하고 다음 입자 매개변수를 계산합니다. 뺄셈에 대한 임계값을 계산하려면 배경 측정으로 생각되는 항목에 대해 관심 있는 사각형 영역을 선택합니다. 음표 아래 평균 비율에 대한 임계값을 계산하려면 평활근 세포 또는 세포의 광학적으로 평평한 영역 주위의 직사각형 관심 영역을 선택합니다.

메모 다운, 평균 및 표준 편차를 측정합니다. 이 과정을 두 번 더 반복하거나 Shift 키를 눌러 한 번에 세 개의 상자를 그릴 수 있습니다. 비율에 대한 임계값 아래로 메모를 추가합니다.

표준 편차를 평균으로 나눈 값에 1을 더한 다음 결과에 32를 곱하여 계산합니다. 세 번의 반복실험에서 값을 평균화하는 경우 32의 계수는 진행 프레임의 변화가 정수 값 32에 매핑되지 않는 비율 알고리즘을 설명하는 데 필요합니다. 이것은 비율의 증가와 감소를 감지할 수 있는 좋은 다이내믹 레인지를 제공합니다.

8비트 이미지의 경우 이미지 조정 임계값을 선택합니다. 흑백을 선택합니다. 슬라이드 상한 아래 를 정의하고 해당 값을 기록해 둡니다.

이것은 슬라이더의 오른쪽에 있습니다. 검은색 영역에서 발생하는 이벤트만 계산됩니다. 재설정을 클릭합니다.

이제 비율에 대한 뺀 임계값과 매도 에지 임계값에 대한 임계값이 계산되었으므로 이미지 스택을 분석할 수 있습니다. 분석할 스택의 위치를 결정합니다. 이 단계에서 시리즈를 하나만 선택합니다.

이것이 첫 번째 파일이고 마지막 파일은 동일해야 합니다. 그런 다음 데이터 파일 및 스택의 출력 위치를 선택합니다. 예를 들어 데이터 폴더 출력이 있습니다.

임계값을 뺀 값을 비율과 판매 에지 임계값을 입력합니다. 다른 설정은 기본값으로 둡니다. 알고리즘은 처리된 계열이 왼쪽에 표시되고 원본이 오른쪽에 표시되는 이중 창 창을 생성합니다.

출력 폴더에서 이 파일을 열고 이 작업을 주의 깊게 수행하여 가양성 수와 눈으로 볼 수 있는 이벤트가 감지되지 않은 경우를 평가합니다. 각 계열에 대해 알고리즘은 진폭 영역과 같은 감지된 이벤트의 특성을 자세히 설명하는 Excel 파일을 생성하고, 알고리즘이 출력하는 이미지 파일을 검토하여 식별된 거짓 긍정을 이 Excel 파일에서 수동으로 제거할 수 있는 위치를 지정합니다. 그렇게 하기 위해서는 엄격한 기준이 있어야 하지만.

이것은 평활근의 칼슘 과도기에 대한 영화입니다. 이 예에서 동영상은 5헤르츠에서 획득된 100개의 개별 프레임으로 구성됩니다. 우리는 예를 들어, 칼슘 과도현상의 빈도에 대한 특정 약물의 효과를 조사할 때 실험당 이러한 필름을 많이 획득했습니다.

여기서 우리는 평활근 세포에서 수많은 자발적인 칼슘 과도기를 볼 수 있습니다. 입자 감지 알고리즘의 결과는 다음과 같습니다. 각 계열에 대해 알고리즘은 진폭 영역 및 위치와 같은 감지된 이벤트의 특성을 자세히 설명하는 Excel 파일을 생성합니다.

그래서 우리는 방광과 같은 평활근 기관에서 칼슘 트랜스를 영상화하는 방법을 시연했고, 실험실에서 만든 알고리즘을 사용하여 칼슘 과도 상태를 분석하는 방법을 시연했습니다. 기억해야 할 중요한 사항은 칼슘 이미징을 위해 조직을 잘 준비하는 것입니다. 오늘 우리가 시연한 조직의 경우, 결합 조직을 제거하고 필드를 가릴 수 있는 지방을 제거하는 것입니다.

조직을 평평한 시트에 고정하는 것도 중요합니다. 글쎄요, 당신의 실험에 행운을 빌며 시청해 주셔서 감사합니다.