초점 칼슘 ^{2 + 과도 감지}

먼저, 칼슘 로딩 용액을 준비하여 가온하고 기포를 발생시킵니다. 방광을 적출하여 절개한 후 평평하게 핀으로 고정하고, detrusor 조직 조각을 채취합니다. 채취한 detrusor 조각을 로딩 용액에 넣고 배양 및 세척한 후, 다시 평평하게 핀으로 고정합니다.

조직 내의 칼슘 형광이 레이저 광에 의해 흥분되며, 방출되는 빛을 포착하여 결과를 얻습니다. 개별 프레임으로 구성된 동영상을 연속적인 프레임 간의 비교를 통해 분석합니다. 배경은 제거됩니다.

세포 가장자리 임계값은 이벤트가 발견될 위치를 결정하며, 연속된 뇌 사이의 비율이 산출됩니다. 남은 이벤트가 사전 정의된 기준과 일치하면, 해당 이벤트는 강조 표시되고 라벨이 지정됩니다. 안녕하세요, 저는 옥스퍼드 대학교 약리학과의 Keith Brain 및 Tom Kinane 연구실 소속 John Young입니다.

저는 Brain 및 Canne 연구소의 Rob Amos이며, 제 이름은 Keith Brain입니다. 오늘 John과 Rob이 평활근에서의 칼슘 이미징 기술을 보여드릴 것입니다. 저희 연구소에서는 자율 신경에서 신경전달물질의 방출과 그것이 평활근에 미치는 영향을 연구하기 위해 이 기술을 사용합니다.

이제 시작해 보겠습니다. 칼슘 지시약인 Organ Green 488 BAPTA-1 AM은 50 µg의 분말이 포함된 500 µL 바이알 형태로 제공됩니다. 칼슘 지시약을 준비하려면 분말에 40 µL의 DNK F1 27 용액을 첨가하고 30초 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 그 후 460 µL의 생리식염수(PSS)를 첨가하고 다시 30초 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.

최종 용액인 10 µM Organ Green 4 88 BAFTA 1:00 AM은 각각 125 µL씩 4개의 분주액으로 제공됩니다. 빛 노출을 피하고, 관심 조직을 박리하기 전까지 용액을 -20 °C에서 보관하십시오.

냉동고에서 칼슘 지시약을 꺼내어 칼슘 지시약이 녹을 때까지 상온에서 해동합니다. 시험관에 PSS 1 mL를 넣고 33 °C의 항온 수조에 둡니다. 마개로 버블러를 시험관에 고정하거나 퍼필(perfil)을 사용할 수도 있으며, 초당 약 한 개의 기포가 생성되는 속도로 95% 산소와 5% 이산화탄소 혼합 가스를 버블링합니다.

동물로부터 평활근 기관을 적출합니다. 본 실험에서는 마우스의 방광을 사용합니다. 기관을 약 50 millimeters의 PSS에 넣어 세척한 후, 조직이 충분히 세척되면 주변의 지방 조직과 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다.

방광의 평활근 로리언(laurean) 유형에 따라 절개하여 엽니다. 방광경부부터 시작하여 꼬리쪽 끝에서 돔 상단까지 세로로 절개합니다. 두측 끝 부분에서 배측 표면을 따라 우세한 근섬유 다발 방향으로 길이가 6~8 mm, 너비가 1~2 mm인 스트립 4개를 준비합니다.

박리한 조직과 사전 가온 및 포화시킨 PSS를 담아, 10 µM Organ Green 488B 칼슘 지시약 125 µL를 시험관 내 조직에 넣고 손으로 가볍게 흔들어 혼합합니다. 시험관을 다시 항온 수조에 넣습니다. 버블링을 재개하고 항온 수조를 알루미늄 호일로 덮습니다.

충분한 조직이 칼슘 지시약을 흡수하는 데 걸리는 시간은 조직의 크기와 평활근 층의 두께에 따라 다릅니다. 예를 들어, 마우스 배뇨근과 쥐의 oxs의 경우 70분이 소요됩니다. 반면, 쥐의 배뇨근과 마우스 VAs deens의 경우에는 120분 동안 배양합니다.

조직에 칼슘 지시약을 로딩한 후, 현미경 관찰을 위한 준비를 할 수 있습니다. 먼저, 기포가 발생하는 PSS로 조직을 10분 동안 헹굽니다. 다음으로, S 가드가 내장된 준비 접시에 조직을 고정합니다.

약간 잡아당겨 평평한 시트 형태로 만듭니다. 짧은 길이의 핀을 사용하여 조직을 고정합니다. 예를 들어, 직경 25 to 50 µm의 은선을 2 mm 길이로 잘라 핀을 비스듬히 삽입합니다.

핀의 길이가 몇 밀리미터보다 길면 대물렌즈에 흠집을 낼 수 있으므로 사용을 피하십시오. 조직을 주의 깊게 고정하는 것은 조직의 자발적인 움직임을 최소화하고 이미징에 적합한 부위를 쉽게 찾는 데 중요합니다. 조직을 고정한 후, 준비 접시를 현미경 스테이지 위에 배치하십시오.

PSS가 디시의 실 가드 라인 영역 밖으로 새어 나가지 않도록 주의하십시오. 그렇게 되면 넓은 영역이 PSS로 덮일 수 있습니다. 시연 목적으로 슈퍼퓨전(superfusion)을 시작할 때, 다음 단계들은 빛 아래에서 수행됩니다.

이 실험들은 일반적으로 암실에서 수행된다는 점에 유의하십시오. 준비물을 과관류하기 위해 펌프를 켭니다. PSS의 경우, 보통 시간당 100 milliliters의 속도가 사용됩니다.

가열 장치를 켜고, 유입관과 유출관 및 온도 프로브를 준비 접시에 배치한 뒤 각각의 바닥면에 있는 자석을 이용해 금속 스트립에 고정합니다. 유출관 끝의 높이에 따라 PSS의 깊이가 결정됩니다. 유출관이 때때로 PSS를 제대로 제거하지 못하는 경우가 있으므로, 실제로 PSS가 배출되고 있는지 주의 깊게 확인하십시오.

먼저 가열 장치의 온도를 33~35 °C 사이의 목표 온도에 도달하도록 설정하십시오. 10배 또는 20배의 저배율 대물렌즈를 사용하여 조직이 최소 10분 동안 평형 상태에 도달하도록 둡니다.

평행 형광 현미경을 사용하거나 청색광으로 여기하여 평활근을 관찰하고 모니터링에 적합한 영역을 식별하십시오. 여기 및 조명에 노출되면 지시약의 광퇴색이 발생하므로, 한 번에 수 초 이상 사용하지 않도록 하십시오.

이미지 검출 알고리즘에서 다수의 위양성이 발생할 수 있으므로 밝은 구조물이 보이는 부위는 피하십시오. 움직임이 최소화되어 있고 시야 내에 평활근 세포가 많이 포함된 부위를 선택하시기 바랍니다. 촬영할 부위를 선택했다면 40x와 같은 고배율 대물렌즈로 교체하십시오.

평활근 세포가 수평으로 놓이도록 스테이지 또는 광축을 회전시킵니다. 즉, 래피드 스캔 축(rapid scan axis)과 평행하게 맞춥니다. 이제 평활근 세포를 공초점 현미경으로 이미징할 준비가 되었습니다.

본 프로토콜에서는 Leica SP 2 upright confocal microscope를 사용합니다. 핀홀을 1 airy disc로 닫습니다. custo optic 가변 필터의 레이저 출력을 25%에서 35% 사이로 설정합니다.

이 값은 밝기와 광퇴색(photo bleaching) 사이의 절충안입니다. 데이터 분석을 위해 ImageJ를 다운로드하여 설치하십시오. 플랫폼 전용 버전을 다운로드한 후, 최신 ImageJ jar 파일을 다운로드하여 기존 파일을 교체함으로써 최신 버전으로 업데이트하십시오. 다음으로, Excel writer jar 파일을 다운로드하여 plugins jar 디렉토리에 설치하십시오.

이 파일들을 plugins 디렉토리에 복사하십시오. plugins 매크로를 사용하여 각 스크립트를 설치하십시오. ImageJ의 설치 함수를 사용하십시오. 우리가 사용하는 Leica SP2 공초점 현미경용 소프트웨어의 명칭은 Leica입니다.

LCS는 각 시리즈의 개별 프레임을 별도의 파일로 저장합니다. 시리즈를 재구성하려면, 재구성할 모든 프레임이 하나의 폴더에 들어 있는지 확인하십시오.

예를 들어, data folder tiffs입니다. 그런 다음 plugins macros 메뉴에서 Leica SP two stacker 매크로를 선택하십시오. 이 경우 data folder인 루트 디렉토리를 선택하십시오.

드롭다운 목록에서 원하는 폴더를 선택하십시오. 이 경우, tiffs 출력 디렉토리를 선택하거나 새로 생성합니다. 예를 들어, data folder stacks가 있습니다.

그런 다음 스크립트가 개별 프레임으로부터 시리즈를 재구성하여 움직임을 보정합니다. 여기서는 다운로드한 스택 내의 프레임을 정렬하거나 매칭하는 무료 알고리즘인 rig 및 turbo reg를 사용합니다. 각 파일을 stacks 폴더로 복사하십시오.

처리할 스택을 불러온 다음, 관심 영역이 명확하게 보이는 프레임으로 이동하십시오. 다른 프레임들은 이 기준 프레임에 맞춰 정렬됩니다. 그 후, plugins > stacks로 이동하십시오.

스택 등록(Stack Reg.). 각 부위별로 가장 효과적인 방법을 결정하기 위해 서로 다른 변환 방법을 각각 시도하십시오. 칼슘 과도 현상(calcium transients) 검출에 영향을 주는 이미지 요인은 각 부위의 특정 특성 및 입자 파라미터를 측정함에 따라 달라질 것입니다.

검출의 민감도와 특이도가 향상됩니다. 따라서 각 사이트별로 비율에 대한 감산 임계값과 세포 가장자리 임계값을 계산합니다. 먼저, plugins, macros, install로 이동하여 jn CTO dot oh eight release dot IJM JM을 선택합니다. 그런 다음 plugins, macros, load stack으로 이동합니다.

시리즈를 선택하고 다음의 입자 파라미터를 계산하십시오. 감산(subtracted) 임계값을 계산하려면 배경 측정값이라고 판단되는 부분에 직사각형 관심 영역을 선택하십시오. 평균값을 기록하십시오. 비율(ratio) 임계값을 계산하려면 평활근 세포 또는 세포들의 광학적으로 평평한 영역 주변에 직사각형 관심 영역을 선택하십시오.

평균과 표준편차를 측정하여 기록하십시오. 이 과정을 두 번 더 반복하거나, shift 키를 눌러 한 번에 세 개의 박스를 그릴 수 있습니다. 비율에 대한 임계값을 계산하여 기록하십시오.

표준편차를 평균에 1을 더한 값으로 나눈 후, 그 결과에 32를 곱하여 계산하십시오. 3가지 반복 실험값의 평균을 낼 때, 이전 프레임과 변화가 없는 경우 정수 값 32로 매핑되는 비율 산출 알고리즘을 반영하기 위해 32라는 인자가 필요합니다. 이를 통해 비율의 증가와 감소를 감지할 수 있는 적절한 동적 범위(dynamic range)를 확보할 수 있습니다.

8비트 이미지의 경우, 이미지 조정 임계값(image adjust threshold)을 선택하십시오. 흑백(black and white)을 선택합니다. 상단 슬라이더 제한 값 아래를 정의하고 해당 값을 기록하십시오.

이것은 슬라이더의 오른쪽에 있습니다. 검은색 영역에서 발생하는 이벤트만 계산됩니다. 리셋을 클릭하십시오.

비율 차감 임계값과 세포 가장자리 임계값이 계산되었으므로, 이제 이미지 스택을 분석할 수 있습니다. 분석할 스택의 위치를 결정하십시오. 이 단계에서는 단 하나의 시리즈만 선택하십시오.

그것이 첫 번째 파일이며, 마지막 파일도 동일해야 합니다. 그런 다음 데이터 파일과 스택의 출력 위치를 선택하십시오. 예를 들어, 데이터 폴더 출력을 선택합니다.

감산 임계값, 비율 임계값 및 세포 가장자리 임계값을 입력하십시오. 나머지 설정은 기본값으로 둡니다. 알고리즘은 왼쪽에는 처리된 시리즈가, 오른쪽에는 원본이 표시되는 이중창 창을 생성합니다.

출력 폴더에서 이 파일을 열고 세밀하게 검토하여 위양성(false positives)의 수와 육안으로 확인 가능한 이벤트가 검출되지 않은 사례를 평가하십시오. 각 시리즈에 대해 알고리즘은 진폭, 면적, 위치와 같이 검출된 이벤트의 특성을 상세히 기록한 Excel 파일을 생성합니다. 알고리즘이 출력한 이미지 파일을 검토하여 식별된 위양성은 이 Excel 파일에서 수동으로 제거할 수 있습니다. 단, 제거 시에는 엄격한 기준을 적용해야 합니다.

이 영상은 평활근의 칼슘 일시적 변화(calcium transience)를 보여줍니다. 본 예시에서 영상은 5Hz로 획득한 100개의 개별 프레임으로 구성되어 있습니다. 예를 들어, 특정 약물이 칼슘 일시적 변화의 빈도에 미치는 영향을 조사할 때, 실험당 이러한 영상을 다수 획득하게 됩니다.

여기에서 평활근 세포 내의 수많은 자발적 칼슘 과도 현상을 확인할 수 있습니다. 입자 검출 알고리즘의 결과가 여기에 표시되어 있습니다. 각 시리즈에 대해, 알고리즘은 진폭, 면적 및 위치와 같이 검출된 이벤트의 특성을 상세히 기록한 Excel 파일을 생성합니다.

지금까지 방광과 같은 평활근 기관에서 칼슘 과도 현상을 이미지화하는 방법과, 저희 연구실에서 개발한 알고리즘을 사용하여 이러한 칼슘 과도 현상을 분석하는 방법을 시연하였습니다. 기억해야 할 중요한 점은 칼슘 이미지화를 위해 조직을 충분히 준비하는 것입니다. 오늘 시연한 조직의 경우, 결합 조직을 제거하고 시야를 가릴 수 있는 지방을 모두 제거하는 것이 이에 해당합니다.

또한 조직을 평평한 시트 형태로 핀으로 고정하는 것이 중요합니다. 그럼, 실험에 좋은 결과가 있기를 바라며 시청해 주셔서 감사합니다.