렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

제브라피시의 수정체 이식을 시작하려면, 먼저 GFP를 발현하는 형질전환 공여자와 야생형 수혜체를 칼슘이 없는 제브라피시 링거 용액(ringer solution)이 담긴 각각의 페트리 접시에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 물고기 치어를 저융점 아가로스(low melting point agarose) 내에 두 줄의 평행선으로 매립합니다. 한 줄인 A는 공여체용이며, 다른 한 줄인 B는 수혜체용입니다. 수혜체의 경우 눈 전체를 제거하는 반면, 공여체에서는 수정체만 제거합니다.

공여체 수정체를 숙주 안구에 이식하기 전에 주변 조직을 제거합니다. 이식 후, 물고기들은 라벨이 부착된 24웰 플레이트에 보관합니다. 이식된 수정체는 숙주 내에서 GFP 형광을 나타내어야 합니다.

당연하게도, 숙주의 반대편 눈은 수술을 받지 않았으므로 GFP를 발현하지 않습니다. 안녕하세요, 저는 Yj입니다. 그리고 저는 Kaya McCullough이며, 저희는 하버드 의과대학 안과학과의 Yma Maki 박사 연구실 소속입니다. 오늘은 야생형 제브라피쉬 Daniel Rio의 수정체 이식 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 야생형에서 돌연변이 동물로, 또는 그 반대로 수정체를 이식하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이를 통해 돌연변이 유전자가 수정체 내에서 자율적으로 기능하는지 또는 비자율적으로 기능하는지 결정할 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.

제브라피쉬 계통은 표준 어류 시설 조건인 28.5 °C, 14시간 명기 및 10시간 암기 주기에서 유지하며, 계획된 실험 전날 저녁에 수컷과 암컷을 칸막이가 있는 수조에 넣어 서로 분리해 둡니다. 이 물고기들의 유전자형은 GFP 발현과 관심 있는 돌연변이를 가진 자손을 생성해야 합니다. 동시에 동일한 절차를 사용하여 1시간 이내에 비형질전환 야생형 동물 간의 교배를 준비합니다.

아침에 조명이 켜지면, 물고기가 교배할 수 있도록 칸막이를 제거합니다. 15~30분 후, 수조의 물을 체에 부어 배아를 수집한 다음, 세척병의 알 배양액을 쏘아 100 x 15 mm 페트리 접시로 씻어냅니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 수정되지 않은 배아와 이물질을 제거함으로써 알을 세척합니다.

기존의 난수(egg water)를 새 난수로 교체합니다. 배아는 수정체 이식 전까지 28.5 °C 인큐베이터에 보관할 수 있습니다. 이식을 진행할 준비가 되면, 코리온(corion)을 수동으로 제거하여 배아를 준비합니다.

금속 프로브와 핀셋을 사용하여, 난황막이 제거된 배아를 칼슘이 없는 ZFR 내의 0.2% EDTA에서 30분 동안 배양해야 합니다. 배양하는 동안 해부에 필요한 바늘을 준비할 수 있습니다. 이식 과정에서는 수정체 주변 조직을 절개하기 위해 날카롭게 간 바늘과 agros에서 분리한 배아가 필요합니다.

또한 공여 수정체를 이동시켜 수혜체에 삽입하기 위해 둔한 바늘이 필요한데, 이를 만들기 위해 먼저 다이아몬드 칼을 사용하여 파스퇴르 피펫의 끝부분을 자릅니다. 그런 다음 유리 모세관을 파스퇴르 피펫 끝에 삽입하여 모세관 길이의 약 절반이 내부에 들어가게 합니다. 화염을 이용하여 모세관의 열린 끝부분에 얇은 텅스텐 와이어를 조심스럽게 삽입합니다.

포셉을 사용하여 와이어 위에서 유리를 녹인 다음, 금속 와이어로 유리 끝을 안정적으로 잡은 상태에서 바늘의 반대쪽 끝을 비틉니다. 부드러워진 유리가 금속을 따라 나선형으로 감기면서 단단히 고정되어야 합니다. 이를 통해 뭉툭한 바늘을 만들어 날카로운 바늘로 제작할 수 있습니다.

텅스텐 와이어를 불꽃 위에 1~1.5분 동안 유지하여 금속을 태워냅니다. 이렇게 하면 매우 미세한 팁이 생성됩니다. 현미경을 통해 팁의 품질을 확인하십시오.

팁의 상태가 좋으려면 굽거나 휘어지지 않아야 하며, 끝부분이 지름 50 µm 이하의 미세한 점으로 부드럽게 가늘어져야 합니다. 두 바늘을 화염 멸균기에서 몇 초간 멸균한 후 식힙니다. 플라스틱 원심 분리 튜브에 40 °C 항온 수조에서 예열한 1.2% low melting point agarose와 칼슘 제거 ZFR을 준비하고 절차를 시작합니다. 원하는 단계에서 파스퇴르 피펫으로 공여 배아를 흡입하여 agarose가 들어 있는 원심 분리 튜브에 천천히 배출합니다. 알을 agarose 내에서 약 5초 동안 배양합니다.

피펫을 사용하여 배아를 제거하고, 천천히 주의 깊게 피펫팅하여 100mm 폴리스티렌 페트리 접시에 한 줄로 배열합니다. 대부분의 배아는 눈이 위를 향한 채 옆으로 눕게 됩니다. 이제 호스트 난자로 이 과정을 반복하고, 아가로스(agarose)가 응고되기 전에 공여 난자와 평행하게 한 줄로 배열합니다. 아가로스가 응고된 후, 뭉툭한 바늘을 사용하여 방향이 잘못된 배아를 눈이 위를 향하도록 돌려줍니다.

0.2% 저융점 한천 용액을 덮어줍니다. 뾰족한 바늘을 사용하여 눈 주변의 한천을 제거하고, 부유하고 있는 공여자 눈 전체를 매우 조심스럽게 잘라냅니다. 다음으로, 눈에서 수정체를 분리합니다.

이는 바늘을 안구 조직의 아래쪽에서 위쪽으로 끌어당겨 수행합니다. 이는 숙주에만 해당됩니다. 뾰족하게 만든 바늘을 이용해 짧게 끊어 치는 동작으로 수정체를 절제하며, 수정체가 찢어지지 않도록 최대한 밀착하여 절개합니다.

숙주 안구의 나머지 부분에서 조직을 너무 많이 제거하지 않도록 주의하십시오. 렌즈가 분리되면 배지 속에 떠 있게 됩니다. 뭉툭한 바늘을 사용하여 공여자 렌즈를 숙주 렌즈 위치 바로 위까지 조심스럽게 밀어 넣은 다음, 뭉툭한 바늘로 눌러 정위치에 배치하십시오.

호스트 수정체는 폐기해도 됩니다. 공여체 및 호스트 배아를 1.2% Aros에 30분에서 60분 동안 둡니다. 배아 배지는 상처 치유를 돕습니다.

그 다음, 뾰족한 금속 바늘을 사용하여 배아를 agros에서 분리합니다. 배아를 배아 배지가 담긴 24-well plate로 옮깁니다. 각 배아는 개별 well에 배치되어야 합니다.

렌즈 이식이 완료된 후 어떤 호스트가 어떤 공여자와 대응하는지 명확히 알 수 있도록 웰에 적절하게 라벨을 붙이십시오. 원하는 시간까지 배아를 28.5 °C에서 배양하십시오. 표현형 관찰의 경우, 일반적으로 1~2일 이내에 렌즈 분화를 확인합니다.

공여자 유래 수정체는 숙주 안구로 이식된 후에도 GFP 발현을 유지해야 합니다. 야생형 환경에서 돌연변이 표현형이 회복되지 않는다면, 이는 해당 표현형이 자율적(autonomous)임을 나타냅니다. 반면, 표현형이 회복된다면 이는 비자율적(non-autonomous)인 것으로 간주됩니다.

그리고 이는 하위 유전자의 기능에 중요한 영향을 미칩니다. 지금까지 제브라피쉬 배아의 수정체 이식 방법을 살펴보았습니다. 이 시술을 수행할 때는 바늘의 모양을 잡는 방법과 수정체 자체를 분리해내는 과정에 매우 주의를 기울이는 것이 중요합니다.

또한, 이식 완료 후 난자가 굴러가기 전에 배아를 빠르게 정렬해야 합니다. 8개의 웰(well)에 배아 배지를 추가하는 것을 잊지 마십시오. 이것으로 모두입니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.