렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

제브라피시 수정체 이식을 시작하기 위해, GFP를 발현하는 형질전환 공여자(donor)와 야생형 수혜자(recipient) 숙주를 각각 칼슘이 없는 제브라피시 링거 용액이 담긴 별도의 페트리 접시에서 30분 동안 배양합니다. 그다음 치어들을 저융점 agarose 내에 두 줄의 평행선으로 매립합니다. 한 줄(A)은 공여자를 위한 것이고, 다른 한 줄(B)은 숙주를 위한 것입니다. 공여자의 경우 안구 전체를 제거하며, 숙주에서는 수정체만을 제거합니다.

기증자 수정체를 호스트 안구에 배치하기 전에 주변 조직을 제거합니다. 이식 후, 물고기들은 라벨이 부착된 24웰 플레이트에 보관합니다. 이식된 수정체는 호스트 내에서 GFP 형광을 나타내야 합니다.

당연히 숙주의 반대측 눈은 수술을 받지 않았으며 GFP를 발현하지 않습니다. 안녕하세요, Yj입니다. 그리고 저는 Kaya McCullough이며, 저희는 하버드 의과대학 안과학교실의 Yma Maki 박사님 연구실 소속입니다. 오늘은 야생형 제브라피쉬(Danio rerio)의 수정체 이식 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 야생형 동물에서 돌연변이 동물로, 또는 그 반대로 수정체를 이식하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이를 통해 돌연변이 유전자가 수정체 내에서 자율적으로 작용하는지 또는 비자율적으로 작용하는지를 결정할 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.

제브라피시 계통은 표준 어류 사육 시설 조건인 28.5 °C, 14시간 명기 및 10시간 암기 주기로 유지한다. 계획된 실험 전날 저녁에 수컷과 암컷을 구분 칸막이가 있는 수조에 넣어 서로 분리시킨다. 이 물고기들의 유전자형은 GFP 발현과 관심 대상인 변이를 가진 자손을 생성할 수 있어야 한다. 동시에 동일한 절차를 사용하여 1시간 이내에 비형질전환 야생형 동물 간의 교배를 준비한다.

아침에 조명이 켜지면, 물고기가 교배할 수 있도록 격벽을 제거합니다. 15~30분 후, 수조의 물을 체에 부어 배아를 수집한 다음, 세척병의 난자용 용수를 사용하여 100 × 15 mm 페트리 접시에 씻어냅니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 수정되지 않은 배아와 이물질을 제거하여 알을 세척합니다.

기존의 난수(egg water)를 새로운 난수로 교체합니다. 수정란은 수정체 이식 전까지 28.5 °C 인큐베이터에 보관할 수 있습니다. 이식을 진행할 준비가 되면, 코리온(corion)을 수동으로 제거하여 수정란을 준비합니다.

금속 프로브와 핀셋을 사용하여, dec 코팅된 배아를 칼슘이 없는 ZFR 내의 0.2% EDTA에서 30분 동안 배양해야 합니다. 배양하는 동안 해부에 필요한 바늘을 준비할 수 있습니다. 이식 과정에서는 수정체 주변 조직을 절개하기 위해 날카롭게 갈린 바늘과 agros의 Woolies 배아가 필요합니다.

또한 공여체 수정체를 이동시켜 수용체에 삽입하기 위해 둔탁한 바늘이 필요한데, 다이아몬드 나이프로 파스퇴르 피펫의 끝부분을 잘라내어 바늘을 제작합니다. 그런 다음 유리 모세관을 파스퇴르 피펫 끝에 삽입하여 모세관 길이의 약 절반이 내부에 위치하도록 합니다. 화염을 이용하여 모세관의 열린 끝부분에 얇은 텅스텐 와이어를 조심스럽게 삽입합니다.

핀셋으로 유리를 와이어 위에서 가열하여 녹인 후, 금속 와이어로 유리 끝부분을 안정적으로 잡은 상태에서 바늘의 반대쪽 끝을 비틉니다. 부드러워진 유리가 금속 와이어를 따라 나선형으로 감기며 고정되어야 합니다. 이렇게 하면 끝이 뭉툭한 바늘이 되며, 이후 이를 가공하여 날카로운 바늘로 만들 수 있습니다.

텅스텐 와이어를 불꽃 위에 1~1.5분 동안 유지하여 금속을 태웁니다. 그러면 매우 미세한 팁이 형성됩니다. 현미경으로 팁의 품질을 확인하십시오.

적절한 팁은 휘거나 굽지 않아야 하며, 직경 50 µm 이하의 미세한 끝부분까지 매끄럽게 가늘어져야 합니다. 두 바늘을 화염 속에서 몇 초간 멸균하고 식힌 후 절차를 시작하십시오. 플라스틱 원심분리 튜브에 40 °C 항온수조에서 예열한 1.2% low melting point agarose와 칼슘 제거 ZFR을 준비합니다. 원하는 단계에서 공여 배아를 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 agarose가 들어 있는 원심분리 튜브에 천천히 배출합니다. 난자를 agarose 내에서 약 5초 동안 배양합니다.

피펫을 사용하여 배아를 제거한 후, 천천히 그리고 조심스럽게 피펫팅하여 100 mm 폴리스티렌 페트리 접시에 일렬로 배치합니다. 대부분의 배아는 눈이 위를 향한 상태로 옆으로 누워 있게 됩니다. 이제 숙주란에 대해서도 이 과정을 반복하며, 아가로스(agarose)가 응고되기 전에 공여란과 평행하게 일렬로 배치합니다. 아가로스가 응고된 후, 뭉툭한 바늘을 사용하여 방향이 잘못 잡힌 배아의 눈이 위를 향하도록 돌려줍니다.

그 위에 0.2% 저융점 agar 용액을 덮습니다. 끝을 뾰족하게 만든 바늘을 사용하여 눈 주변의 agar를 제거하고, 떠오르는 공여자 눈 전체를 매우 조심스럽게 절제하여 분리합니다. 다음으로, 눈에서 수정체를 분리합니다.

바늘을 안구 조직의 아래쪽에서 위쪽으로 끌어당겨 수행합니다. 이는 숙주에만 해당됩니다. 끝을 뾰족하게 만든 바늘로 짧게 여러 번 쳐서 렌즈를 제거하며, 렌즈가 찢어지지 않도록 최대한 렌즈에 가깝게 절개합니다.

숙주 안구의 나머지 부분에서 조직을 너무 많이 제거하지 않도록 주의하십시오. 렌즈가 분리되면 배지 속에 떠다니게 됩니다. 둔탁한 바늘을 사용하여 공여자 렌즈를 숙주 렌즈의 위치 바로 위까지 조심스럽게 밀어 넣은 다음, 다시 둔탁한 바늘로 밀어 내려 제자리에 위치시킵니다.

숙주 수정체의 렌즈는 폐기해도 좋습니다. 공여체 및 숙주 배아를 1.2% Aros에 30분에서 60분 동안 둡니다. 배아 배지는 상처 치유를 돕습니다.

그런 다음 날카로운 금속 바늘을 사용하여 agros로부터 배아를 분리합니다. 배아를 배아 배지가 담긴 24웰 플레이트로 옮깁니다. 각 배아는 별개의 웰에 배치해야 합니다.

렌즈 이식이 완료된 후 어떤 호스트가 어떤 공여자와 대응하는지 명확히 알 수 있도록 웰에 적절하게 라벨을 붙이십시오. 원하는 시간까지 배아를 28.5 °C에서 배양하십시오. 표현형 관찰을 위해, 일반적으로 1~2일 이내에 렌즈 분화를 확인합니다.

공여자 유래 수정체는 숙주 안구로 이식된 후에도 GFP 발현을 유지해야 합니다. 야생형 환경에서 돌연변이 표현형이 회복되지 않는다면, 이는 해당 표현형이 자율적(autonomous)임을 나타냅니다. 반대로, 표현형이 회복된다면 해당 표현형은 비자율적(non-autonomous)인 것으로 간주됩니다.

그리고 이는 하위 유전자의 기능에 중요한 영향을 미칩니다. 지금까지 제브라피쉬 배아에서 수정체 이식물을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 바늘의 모양을 만드는 방식과 수정체 자체를 박리하는 방법에 각별히 주의하는 것이 중요합니다.

또한, 이식 완료 후 알이 굴러가기 전에 배아를 빠르게 배열해야 합니다. 우드 힐링(wood healing)에 배아 배지를 8개 추가하는 것을 잊지 마십시오. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.