Name: 렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 배우세요 제브라피시 렌즈 이식 기술을 통해 눈 발달 이상의 원인을 규명하는 방법을. GFP 형광을 이용한 이식 렌즈 추적으로 유전자의 자율성 및 비자율성 기능을 분석할 수 있습니다.

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이 절차는 이식 기술은 빌 제프리의 실험실에 의해 동굴 물고기를 위해 개발된 광범위하게 따릅니다.

1 부 : 배아 준비 이 프로토콜에서는, 우리는 가상 zebrafish 렌즈 돌연변이 거하고 있음을 나타내는 JJ XY 기호를 사용합니다. <ol><li> Zebrafish의 변종은 14h light/10h 어두운주기 28.5 C에서 표준 생선 시설 조건에서 유지됩니다. </li><li> 저녁에는 자리 남성과 zebrafish 변형 JJ XY의 여성 : AB / TU, 서로를 구분하는 구분선과 탱크에 TG (mGFP). 이 십자가의 자손은 모든 조직에서 GFP의 transgene을 표현되며, 기부자로 사용됩니다. 병렬로, 비 - 유전자 변형 야생 형 동물 사이의 경계를 설정하는 동일한 절차를 사용합니다. 본 실험의 목적에 따라, 한 기증자 또는 호스트로 JJ XY의 로커스에서 야생 타입 동물을 교차 수 있습니다. </li><li> 빛이 아침에 켜지 후 한 시간 이내, 친구에게 물고기를 허용하도록 디바이더를 제거합니다. </li><li> 15-30분 100 X 15mm 배양 접시에 배아를 수집 후, 그들을 청소하고, 매체 (계란 물)을 변경합니다. </li><li> 원하는 시간까지 28.5 C 배양기에서 배아 보관하십시오. </li><li> 언제 이식 준비, 날카로운 집게 두 쌍이있는 수동 chorion을 제거하고 30 분 동안 칼슘 무료 ZFR에서 0.2 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 배아를 품어. </li></ol> 2 부 : 절개의 바늘의 작성 <ol><li> 및 기증 렌즈를 이동하고 호스트에 삽입하는 데 사용하는 무딘 바늘, 렌즈 주위 조직을 잘라 chorion을 제거하고, 아가로 오스의 릴리스 배아하는 데 사용됩니다 날카롭게 한 : 이식 절차는 바늘의 두 가지 유형이 필요합니다. 여기이 바늘을 만드는 방법을 보여줍니다. </li><li> 첫째, 파스퇴르 피펫의 끝은 다이아몬드 칼을 이용하여 차단해야합니다. 다음 길이의 약 절반 안에되도록 파스퇴르 피펫 팁으로 모세관 유리를 삽입합니다. 이것은 쉽게 다음 단계에서 유리에 그것을 용융하여 텅스텐 와이어를 고정하는 것입니다. </li><li> 다음 모세관의 열린 끝을로 얇은 텅스텐 와이어를 삽입합니다. 알콜 램프로 철사 위에 유리를 용융. 손으로 바늘의 다른 쪽 끝을 비틀면서 집게를 사용하여 금속 와이어와 함께 꾸준한 유리 끝을시오. 부드럽게 유리는 금속 주위에 나선 자리에서 재밌해야합니다. </li><li> 당신이 뭉툭한 팁 바늘하고있다면이 절차의 마지막입니다. 날카롭게 바늘을 만들려면, 아주 좋은 팁이 생성되도록 금속을 굽기, 1-1.5 분 알콜 램프를 통해 텅스텐 와이어를 잡아. microscropy.It에 의해 팁의 품질은 이식 직전 몇 초 동안 불꽃에 두 바늘을 소독하는 것이 좋습니다 확인하십시오. </li></ol> 파트 3 : 시약의 준비 <ol><li> 칼슘 무료 Zebrafish 링거스 (ZFR) 솔루션 (116 MM NaCl, 2.9 KCl MM, 5 MM HEPES, pH를 7.2) </li><li> 칼슘 무료 Zebrafish 링어의 솔루션 (산도 7.2)에서 0.2 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li><li> 칼슘 무료 ZFR에서 1.2 % 아가로 오스 (낮은 융점) </li><li> 칼슘 무료 ZFR에서 0.2 % 아가로 오스 (낮은 융점) </li><li> 리터 당 배아 매체 (산도 7.0이 포함되어 있습니다 : 10 ML 행크스 솔루션 # 1, 1ml 행크스 솔루션 # 2, 10ml 행크스 솔루션 # 4, 10ml 행크스 솔루션 # 5, 0.35 g의 나트륨 중탄산염, 2M 300 UL을 HCL, 페니실린 - 스트렙토 마이신 500,000 Zebrafish 도서 (오레곤 프레스 대학, 2000)에서와 마찬가지로 U). </li><li> 텅스텐 와이어, 도금, 0.1mm 직경 알파 Aesar </li><li> 모세관, 1.0mm 직경, 세계 정밀 계측기 </li></ol> 4 부 : 이식 절차 <ol><li> 플라스틱 원심 분리기 튜브에서 물 목욕 40 C에 preheated 칼슘 무료 ZFR에서 1.2 % 낮은 용융 점 아가로 오스를 준비합니다. </li><li> 원하는 단계 (30 HPF, 예를 들면)에서, 파스퇴르 피펫으로 배아를 타고 천천히 원심 튜브에 그들을 추방하고, 서서히 원심 튜브에 그들을 추방하고 약 5 초 동안 품어. 기증자와 호스트는 별도 incubated해야합니다. </li><li> 피펫으로 원심 튜브에서 1.2 % 아가로 오스의 배아를 가지고 100mm 폴리스티렌 페트리 접시 두 평행 행에서 그들을 마련, 호스트와 기부자는 별도의 유지. 천천히 그리고 신중하게 그들을 pipetting하여, 대부분의 태아는 아가로 오스에서 양쪽에 누워 것입니다. 당신은 아가로 오스가 굳은 전에 안구가 직면되도록 무딘 바늘을 사용하여이 위치에 거짓말하지 않는 사람을 방향해야합니다. </li><li> 응고에 1.2 % 아가로 오스 기다립니다, 그리고 0.2 % 낮은 융점 아가로 오스 솔루션을 오버레이. </li><li> 날카롭게 바늘을 사용하면, 눈 주위에 아가로 오스를 제거, 그리고 아주 조심스럽게 작은 스트로크를 사용하여 호스트 및 기증 배아에서 렌즈를 잘라. 그럼으로 그것을 찢어하지 않는 렌즈에 그냥 가까운 정도 잘라 있는지 확인뿐만 아니라, 그래서 당신은 호스트 눈의 나머지 부분에서 너무 많은 조직을 제거하지 마십시오. </li><li> 일단 무료로 렌즈가 중간에 떠 있습니다. 무딘 바늘을 사용하여 조심스럽게 기증자를 밀어렌즈는 단지 호스트 렌즈가 정상적으로 될 어디의 위치 이상에 다음 무딘 바늘로 눈 안으로 그것을 아래로 밀어. 호스트 렌즈가 삭제됩니다. </li><li> 30~60분에 대한 1.2 % 아가로 오스의 기증자와 호스트 배아를 남겨 다음 날카로운 바늘을 사용하여 아가로 오스에서 그들을 출시하고, 배아 매체와 함께 24 잘 판에 그들을 전송합니다. 각각의 배아는 별도의 우물을 점유한다. 제대로 때문에 호스트가 어떤 기증자에 해당하는 취소되는 우물 레이블을해야합니다. </li><li> 기증자 파생 렌즈 GFP 형광에 따라 같은 동물의 unoperated 측면에 호스트 렌즈에서 구분할 수 28.5 C.에서 알을 품다. 섹션은 또한 렌즈의 크기를 측정하고 제대로 차별화 여부를 확인 할 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림. 렌즈 이식에 사용 날카롭게 바늘 1 낮은 배율 이미지. 모세관 유리 (B)은 파스퇴르 피펫 (A)에 삽입하고, 얇은 텅스텐 와이어 (C)은 모세관의 열린 끝을 삽입됩니다. 와이어를 통해 유리는 알콜 램프로 부드럽게합니다. 손으로 파스퇴르 피펫의 다른 쪽 끝을 비틀면서 집게를 사용하여 금속 와이어와 함께 꾸준한 유리 끝을시오. 부드럽게 유리 장소에 그것을 근사한, 금속 주위에 나선 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/1258/fig2 1258.png" alt="" width="600" height="204" /> 그림. 렌즈 이식에 사용되는 바늘의 이가지 2 팁. <img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림. 3 태아는 30hpf에서 렌즈 이식을 받았습니다. 표시는 기증자의 배아 (A, B), 이식 렌즈 (C, D)으로 호스트 눈, 및 호스트 배아의 제어 측면 (E, F)입니다. 표시된 각 눈은 전송 빛과 자외선 조명 모두에 표시됩니다. 사진은 48 HPF에서 찍은. Q01 [9] 유전자 변형 라인이 실험에서 사용되었습니다.

<ol><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+the+lens+in+cave+fish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role for the lens in cave fish eye degeneration.</a> Science. 289, 631-633 (2000).</li>
<li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+vision+in+the+zebrafish%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of vision in the zebrafish(Danio rerio).</a> Dev Biol. 180, 646-663 (1996).</li>
<li>Schmitt, E., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+eye+morphogenesis+in+the+zebrafish.+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.comp.+Neuro%22%5BJournal%5D)">Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio.</a> J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).</li>
<li>Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+forward+genetics--analysis+of+neuronal+diversity+and+patterning+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina.</a> Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).</li>
<li>Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+to+the+analysis+of+eye+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish.</a> Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+study+neurogenesis+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina.</a> Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutagenesis+yields+eye+morphological+mutants+with+retinal+and+lens+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects.</a> Vision Res. 42, 535-540 (2002).</li>
<li>Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).</li>
</ol>

여러 단계 렌즈 transplantations 중 특별한주의가 필요합니다. <ol><li> 바늘을 날카롭게 : 그것은 렌즈 이식을 수행하기 전에 몇 가지 바늘을 준비하는 것이 좋습니다, 그리고 바늘 끝이 가능한 얇은해야합니다. 두꺼운 바늘은 치료 눈에 실패를 초래하기 때문에 넓은 직경이 더 많은 조직을 찢어 것입니다. </li><li> 배아를 정리 : 그들의 측면에 누워되도록 마우스 이식하기 전에 배아를 위치합니다. 위치하면, 1.2 % 아가로 오스는 강화는 매우 신속하게하실 수 있습니다. 아가로 오스의 경화 속도가 느린하려면, 페트리 접시는 그것이 40 ° C 물 욕조에서 부동 주어 preheated 수 있습니다. </li><li> 호스트의 눈을 기증 렌즈를 삽입하기 전에 가능한 호스트 머리 주위에 많은 아가로 오스를 제거하려고합니다. 그것은 기증자 렌즈 그런식으로 삽입 쉽게. </li><li> 그냥 렌즈 이식 후 배아가 0.2 % 아가로 오스 계층이 적용되는 1.2 % 아가로 오스 레이어에 포함된 남아 있어야합니다....

<table><tbody><tr><td>0.1mm 직경 텅스텐 와이어</td><td>A Johnson Matthey</td><td>45086</td><td></td></tr><tr><td>Agarose(low melting point)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW 100-4</td><td></td></tr><tr><td>포셉</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>피펫 펌프</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683C</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Cardinal Health</td><td>D1906</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

렌즈 zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

렌즈는 광학 컵 [1,2]의 개발에 중요한 역할을합니다. 모델 유기체로 zebrafish를 사용하여 렌즈 개발에 관한 질문은 해결할 수 있습니다. zebrafish 작은 크기, 높은 생산력, 짧은 수명주기, 그리고 관리의 용이성 등 여러 가지 유리한 특성에 의한 유전자 연구에 유용합니다. 렌즈 개발 zebrafish에 급속하게 발생합니다. 72 HPF으로 zebrafish 렌즈 기능 성숙이다 [3]. 풍부한 유전 및 분자 자원 zebrafish 연구를 지원하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 다른 척추 동물들에게 zebrafish 눈의 유사성은 인간의 결함이 뛰어난 동물 모델 [4-7]과 같이 사용에 대한 기초를 제공합니다. 여러 zebrafish의 돌연변이가 어떤 경우에는 렌즈 조직의 완전한 변성에 이르게 세포 사망의 높은 수준 [8]. 포함한 렌즈 이상 전시 렌즈 이상은 본질적인 원인이나 주변 조직과 결함이 상호 작용에 의한인지 확인하려면, 야생 형 안구에 돌연변이 렌즈의 이식이 수행됩니다. 를 사용하여 화재를 광택 금속 바늘, 돌연변이 또는 야생 형 렌즈는 신중하게 기증 동물의 해부를하고, 호스트로 전송됩니다. 야생 타입과 돌연변이 조직을 구분하기 위해 유전자 변형 라인은 기증자로 사용됩니다. 이 줄은 렌즈를 포함한 모든 조직의 막 - 바운드 GFP를 표현합니다. 이 이식 기술은 zebrafish 렌즈 돌연변이의 연구에 필수적인 도구입니다.

렌즈 개발은 다른 조직과 상호 작용을 포함한다. 여러 zebrafish 아이 돌연변이 비정상적으로 작은 렌즈의 크기가 특징입니다. 여기 우리는이 표현형은 본질적 원인이나 렌즈를 둘러싸고있는 조직과 결함이 상호 작용에 의한 있는지 여부를 확인하기 위해 렌즈 이식 실험을 보여줍니다.

렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

수정체는 안배(optic cup)의 발달에 중요한 역할을 합니다[1,2]. 제브라피시를 모델 생물로 사용하여, 수정체 발달과 관련된 질문들...

제브라피시 수정체 이식을 시작하기 위해, GFP를 발현하는 형질전환 공여자(donor)와 야생형 수혜자(recipient) 숙주를 각각 칼슘이 없는 제브라피시 링거 용액이 담긴 별도의 페트리 접시에서 30분 동안 배양합니다. 그다음 치어들을 저융점 agarose 내에 두 줄의 평행선으로 매립합니다. 한 줄(A)은 공여자를 위한 것이고, 다른 한 줄(B)은 숙주를 위한 것입니다. 공여자의 경우 안구 전체를 제거하며, 숙주에서는 수정체만을 제거합니다.기증자 수정체를 호스트 안구에 배치하기 전에 주변 조직을 제거합니다. 이식 후, 물고기들은 라벨이 부착된 24웰 플레이트에 보관합니다. 이식된 수정체는 호스트 내에서 GFP 형광을 나타내야 합니다.당연히 숙주의 반대측 눈은 수술을 받지 않았으며 GFP를 발현하지 않습니다. 안녕하세요, Yj입니다. 그리고 저는 Kaya McCullough이며, 저희는 하버드 의과대학 안과학교실의 Yma Maki 박사님 연구실 소속입니다. 오늘은 야생형 제브라피쉬(Danio rerio)의 수정체 이식 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 야생형 동물에서 돌연변이 동물로, 또는 그 반대로 수정체를 이식하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이를 통해 돌연변이 유전자가 수정체 내에서 자율적으로 작용하는지 또는 비자율적으로 작용하는지를 결정할 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.제브라피시 계통은 표준 어류 사육 시설 조건인 28.5 °C, 14시간 명기 및 10시간 암기 주기로 유지한다. 계획된 실험 전날 저녁에 수컷과 암컷을 구분 칸막이가 있는 수조에 넣어 서로 분리시킨다. 이 물고기들의 유전자형은 GFP 발현과 관심 대상인 변이를 가진 자손을 생성할 수 있어야 한다. 동시에 동일한 절차를 사용하여 1시간 이내에 비형질전환 야생형 동물 간의 교배를 준비한다.아침에 조명이 켜지면, 물고기가 교배할 수 있도록 격벽을 제거합니다. 15~30분 후, 수조의 물을 체에 부어 배아를 수집한 다음, 세척병의 난자용 용수를 사용하여 100 × 15 mm 페트리 접시에 씻어냅니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 수정되지 않은 배아와 이물질을 제거하여 알을 세척합니다.기존의 난수(egg water)를 새로운 난수로 교체합니다. 수정란은 수정체 이식 전까지 28.5 °C 인큐베이터에 보관할 수 있습니다. 이식을 진행할 준비가 되면, 코리온(corion)을 수동으로 제거하여 수정란을 준비합니다.금속 프로브와 핀셋을 사용하여, dec 코팅된 배아를 칼슘이 없는 ZFR 내의 0.2% EDTA에서 30분 동안 배양해야 합니다. 배양하는 동안 해부에 필요한 바늘을 준비할 수 있습니다. 이식 과정에서는 수정체 주변 조직을 절개하기 위해 날카롭게 갈린 바늘과 agros의 Woolies 배아가 필요합니다.또한 공여체 수정체를 이동시켜 수용체에 삽입하기 위해 둔탁한 바늘이 필요한데, 다이아몬드 나이프로 파스퇴르 피펫의 끝부분을 잘라내어 바늘을 제작합니다. 그런 다음 유리 모세관을 파스퇴르 피펫 끝에 삽입하여 모세관 길이의 약 절반이 내부에 위치하도록 합니다. 화염을 이용하여 모세관의 열린 끝부분에 얇은 텅스텐 와이어를 조심스럽게 삽입합니다.핀셋으로 유리를 와이어 위에서 가열하여 녹인 후, 금속 와이어로 유리 끝부분을 안정적으로 잡은 상태에서 바늘의 반대쪽 끝을 비틉니다. 부드러워진 유리가 금속 와이어를 따라 나선형으로 감기며 고정되어야 합니다. 이렇게 하면 끝이 뭉툭한 바늘이 되며, 이후 이를 가공하여 날카로운 바늘로 만들 수 있습니다.텅스텐 와이어를 불꽃 위에 1~1.5분 동안 유지하여 금속을 태웁니다. 그러면 매우 미세한 팁이 형성됩니다. 현미경으로 팁의 품질을 확인하십시오.적절한 팁은 휘거나 굽지 않아야 하며, 직경 50 µm 이하의 미세한 끝부분까지 매끄럽게 가늘어져야 합니다. 두 바늘을 화염 속에서 몇 초간 멸균하고 식힌 후 절차를 시작하십시오. 플라스틱 원심분리 튜브에 40 °C 항온수조에서 예열한 1.2% low melting point agarose와 칼슘 제거 ZFR을 준비합니다. 원하는 단계에서 공여 배아를 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 agarose가 들어 있는 원심분리 튜브에 천천히 배출합니다. 난자를 agarose 내에서 약 5초 동안 배양합니다.피펫을 사용하여 배아를 제거한 후, 천천히 그리고 조심스럽게 피펫팅하여 100 mm 폴리스티렌 페트리 접시에 일렬로 배치합니다. 대부분의 배아는 눈이 위를 향한 상태로 옆으로 누워 있게 됩니다. 이제 숙주란에 대해서도 이 과정을 반복하며, 아가로스(agarose)가 응고되기 전에 공여란과 평행하게 일렬로 배치합니다. 아가로스가 응고된 후, 뭉툭한 바늘을 사용하여 방향이 잘못 잡힌 배아의 눈이 위를 향하도록 돌려줍니다.그 위에 0.2% 저융점 agar 용액을 덮습니다. 끝을 뾰족하게 만든 바늘을 사용하여 눈 주변의 agar를 제거하고, 떠오르는 공여자 눈 전체를 매우 조심스럽게 절제하여 분리합니다. 다음으로, 눈에서 수정체를 분리합니다.바늘을 안구 조직의 아래쪽에서 위쪽으로 끌어당겨 수행합니다. 이는 숙주에만 해당됩니다. 끝을 뾰족하게 만든 바늘로 짧게 여러 번 쳐서 렌즈를 제거하며, 렌즈가 찢어지지 않도록 최대한 렌즈에 가깝게 절개합니다.숙주 안구의 나머지 부분에서 조직을 너무 많이 제거하지 않도록 주의하십시오. 렌즈가 분리되면 배지 속에 떠다니게 됩니다. 둔탁한 바늘을 사용하여 공여자 렌즈를 숙주 렌즈의 위치 바로 위까지 조심스럽게 밀어 넣은 다음, 다시 둔탁한 바늘로 밀어 내려 제자리에 위치시킵니다.숙주 수정체의 렌즈는 폐기해도 좋습니다. 공여체 및 숙주 배아를 1.2% Aros에 30분에서 60분 동안 둡니다. 배아 배지는 상처 치유를 돕습니다.그런 다음 날카로운 금속 바늘을 사용하여 agros로부터 배아를 분리합니다. 배아를 배아 배지가 담긴 24웰 플레이트로 옮깁니다. 각 배아는 별개의 웰에 배치해야 합니다.렌즈 이식이 완료된 후 어떤 호스트가 어떤 공여자와 대응하는지 명확히 알 수 있도록 웰에 적절하게 라벨을 붙이십시오. 원하는 시간까지 배아를 28.5 °C에서 배양하십시오. 표현형 관찰을 위해, 일반적으로 1~2일 이내에 렌즈 분화를 확인합니다.공여자 유래 수정체는 숙주 안구로 이식된 후에도 GFP 발현을 유지해야 합니다. 야생형 환경에서 돌연변이 표현형이 회복되지 않는다면, 이는 해당 표현형이 자율적(autonomous)임을 나타냅니다. 반대로, 표현형이 회복된다면 해당 표현형은 비자율적(non-autonomous)인 것으로 간주됩니다.그리고 이는 하위 유전자의 기능에 중요한 영향을 미칩니다. 지금까지 제브라피쉬 배아에서 수정체 이식물을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 바늘의 모양을 만드는 방식과 수정체 자체를 박리하는 방법에 각별히 주의하는 것이 중요합니다.또한, 이식 완료 후 알이 굴러가기 전에 배아를 빠르게 배열해야 합니다. 우드 힐링(wood healing)에 배아 배지를 8개 추가하는 것을 잊지 마십시오. 이상입니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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생물학

우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

이 문서는 망막 안료 상피 하나에서 세 일 postfertilization의 배아에게 부착과 않고 zebrafish의 망막 microdissect하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

이 비디오는 성체 및 유충 제브라피시 렌즈를 해부하여 피질 수정체 형태 및 렌즈 봉합사의 구조적 무결성을 분석하기 위해 개발된 프로토콜에 대해 설명합니다.

눈 렌즈 해부: 제브라피시 렌즈 형태를 관찰하는 기술

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

여기, 우리는 방법 프로토콜 neoangiogenesis 및 구조적인 변화에 연결 된 장기 혈관 병 리의 설정에서 빠른 읽기로 쉽게 성인 tg(fli:EGFP) zebrafish 망막 맥 관 구조 분석 수 있는 논의.

물고기는 눈을 통해 당뇨병을 공부: 기정, 시각화, 및 성인 tg(fli:EGFP) Zebrafish 망막 맥 관 구조 분석

이러한 프로토콜은 피 질 렌즈 형태학을 분석 하기 위해 개발 되었으며, 고정 및 라이브 렌즈에서 제 브라 피시 렌즈 봉합 사의 구조적 완전성을 측정 하 고, 전방 후부 축을 따라 제 브라 피시 렌즈 핵의 위치를 측정할 수 있다.

제 브라 피쉬 렌즈의 평가 핵 현지화 및 조직 무결성

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

이 기사는 망막 입력이 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기위한 첫 번째 단계로 살아있는 제브라 피쉬 유충에서 눈을 외과 적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 또한이 기사는 애벌레 마취, 고정 및 뇌 해부에 대한 정보를 제공하고 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 제공합니다.

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

여기에서 우리는 수정 후 최소 1일에서 7일 사이의 모든 단계에서 제브라피시 배아와 유충에서 높은 공간적 및 시간적 해상도로 세포를 이식하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

배우세요 제브라피시 렌즈 이식 기술을 통해 눈 발달 이상의 원인을 규명하는 방법을. GFP 형광을 이용한 이식 렌즈 추적으로 유전자의 자율성 및 비자율성 기능을 분석할 수 있습니다.

렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

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