Name: 브레인 은행 : 귀하의 연구 표본의 대부분을 만들기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 학습하세요 뇌 샘플을 크라이오스탯 절단용으로 준비하는 방법을 신경과학 연구를 위해. 체계적 샘플링과 항원 보존을 통해 무편향 스테레올로지 분석을 위한 뇌 뱅킹 프로토콜을 수립합니다.

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저자는 자신의 지속적인 기술 지원 Ikiel Ptito 감사하고 싶습니다.

1 부 : 조직의 사전 처리 <ol><li> 조직은 잘 paraformaldehyde, 글루 타 알데히드, 또는 포르말린과 perfused해야합니다. 이것은 일반적으로 다른 장기를 수확하는 데 사용되는 표준 transcardial 재관류를 통해 달성될 수있다. 현재 연구에서 주제가 깊이 나트륨 pentobarbital (25 MG / kg, IV)의 과다로 euthanized 케타민을 하이드로 클로라이드 (10 MG / kg, IM)과 진정했고 완전히 exsanguinated 때까지 0.1 M PBS로 transcardially perfused. 이것은 5 분 (~ 1리터)을 PBS에 4 % paraformaldehyde 솔루션옵니다. </li><li> 두뇌는 stereotaxically, 차단 두개골에서 제거, 무게, 볼륨 2 결정되어야합니다. 조직은 다음 인산염 버퍼의 30 % 자당의 최종 농도로 등급 자당 솔루션에 cryoprotected해야합니다. 조직 단위가 다음 -65 ° C에서 이소펜탄에 냉동과 -80에 보관해야 ° C가 슬라이스 준비가 될 때까지. </li></ol> 2 부 : 체계적인 샘플링 <ol><li> 체계적인 샘플링 이전 sectioning에 대한 적절한 계획에 의존합니다. 주동이의 - 꼬리와 지느러미 - 복부 extents 모두에 대한 관심의 전체 영역이 잘 정의되어야한다. 사용 종족의 stereotaxic 아틀라스는 관심의 영역을 정의하고 관심 영역의 길이를 결정하기 위해 도움이됩니다. 일단 관심 영역의 길이는 샘플링 간격을 설정하는 데 필요한 결정됩니다. 예를 들어, stereotaxic 아틀라스에서 당신은 코로나 비행기에 sectioning 때 관심 영역의 전체 rostro - 꼬리 정도 길이가 약 3mm 것을 확인하십시오. 그런 다음, 50μm에서 섹션에 그라 이오 스탯을 설정하려면이 속도에서 관심의 영역의 주동이의 - 꼬리 범위에 걸쳐 60 섹션을 결정합니다. 일반적인 편견 stereological 연구 60-10 체계적으로 샘플 섹션은 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 필요합니다. 이 예제에서 10 섹션은 동일 육분의 일 섹션의 샘플링 간격의 rostro - 꼬리 어느 정도 결과를 통해 간격. </li></ol> 파트 3 : 두뇌 은행의 창조 <ol><li> 섹션 샘플링 주파수가 결정되면, 다음 단계는 얼룩이 즉시 수행할지 결정하는 것입니다. 예를 들어, cresyl 제비꽃과 얼룩있다면 당신은 슬라이드에서 육분의 일 섹션을 사로잡을 것입니다. 이 시리즈 1 것입니다. 당신이 원하는 것을 아마도 몇 가지 잠재적인 항체가 알고있다면 실행 그렇다고 기본 얼룩을 제공하거나 immunohistochemistry을 수행할 수있는 시간이 없어도, 순서 섹션의 나머지 5 시리즈를 배치하는 데이터를 보려는 그들이 웰스가 포함된 항원 보존 (1 % 폴리비닐 pyrrolidone, o.1M PBS에서 50 %의 에틸렌 글리콜, 수소 이온 농도 7.4)를 자르고 있었다. 아래 표는 1 슬라이드와 두뇌 은행 (표 1)의 일부로서 섹션 1 접시 (표준 48 잘 판)의 구성 샘플링 방식을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="표 1" /> 표 1. 여기서 섹션 샘플링 주파수 1 / 6입니다. 첫 번째 섹션은 cresyl 보라색 얼룩을 위해 슬라이드에 배치하고 향후 5 섹션은 보존 항원에 게재됩니다. 제 번호는 7 다음 슬라이드에서 캡처되고 섹션은 9-12 보존 항원에 배치됩니다. 관심이나 조직의 블록의 영역이 철저하게 sectioned 때까지이주기가 반복됩니다. </li><li> 다음 단계는 철저하게 섹션 조직의 블록을하는 것입니다. 척에 미디어를 삽입의 작은 금액을 놓고 그것이 동결하자. 마이크로톰 머리에 척을 놓고 평평한 표면을 가지고 냉동 매체의 정도 떨어져 면도. 마이크로톰 머리와 그라 이오 스탯 내에서 플랫 플레이스에서 척을 제거합니다. 척에 미디어를 삽입 붓고 단단히 척에 단호하게 위치 stereotaxically 컷 측면과 뇌 블록을 놓으십시오. 천천히 그리고 완전히는 매체를 장착의 머리를 포함. 마이크로톰 머리와 섹션 샘플링 주파수에 대해 미리 정해진 매개 변수를 사용하여 섹션으로 두뇌와 척를 놓습니다. </li><li> 조직의 블록이 철저하게 sectioned되었으며 섹션이 우물에 배치되면, 뚜껑과 접시를 커버 parafilm으로 뚜껑을 버리고, -20 ° C의 냉장고에서 개최. 각 시리즈, 섹션 - 샘플링 간격, 각 동물에 대한 일련의 번호를 촬영 섹션의 총 수를에 로그인합니다. 이 로그는 미래 immunohistochemistry를위한 두뇌 은행에서 섹션의 후속 제거를 추적할 중요한 것입니다. </li></ol> 4 부 : 대표 결과 : 이러한 방식으로 조직적인 샘플링은 지난 3 년간 우리 연구실에서 표준 연습을하고 있습니다. 그것이 신호의 열화 (그림 1)하지 않고 자른 후에 우리가 알게 된 지 3 년 보존 항원에 저장되었습니다 물질에 대한 성공적인 수행 immunohistochemistry의 좋은 거래를했다합니다. 또한, 우리의 두뇌 은행의 일환으로 우리가 아닌 인간의 가까이에 20,000 체계 섹션 로그인영장류의 두뇌 (그림 2) 장기 연구 계획의 일환으로. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> 1.이 아닌 인간 영장류의 후두 극의 섹션입니다 그림 레이어 VI와 중간 흰색 물질 뉴런을 모두 보여주는 NeuN위한 immunostained. 이 특정 섹션 2 년간의 기간 동안 -20 ° C에 보존 항원에 저장되었습니다. 스케일 바 = 100μm. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="figure2" /> 그림 2. 우리 vervet 두뇌 은행은 현재 30여 원숭이에서 가까운 20,000 체계적인 섹션으로 구성되어 있습니다.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

체계적인 샘플링 연구 자료를 극대화하기위한 저렴한 방법입니다. 이 샘플링 전략 지역에 걸쳐 체계적인 샘플링을 필요로 불편 stereology의 규칙을 준수하도록 설계되었습니다. 그것은 각 시리즈에 대한 섹션의 순서를 유지하는 것은 매우 중요합니다. 저희 연구실에서는 성공적으로 햄스터와 비 인간 영장류 두뇌 섹션을 모두 은행에 대해이 방법을 사용했습니다. 지금까지 우리는 가까이에 20,000 vervet 원숭이 (Chlorocebus aethiops sabeus) 뇌 부분을 수집하고 정기적으로 년 이상 저장되었습니다 섹션에 immunohistochemisty을 수행합니다. 잘 특징 뇌 은행의 장점은 자금 조달 의사 결정, 신속하게 데이터를 수집하는 새로운 학생을위한 능력, 그리고함으로써 연구 기금을 극대화 새로운 동물의 사용 및 치료를 최소화간에 데이터를 수집하는 가능성을 포함합니다.

<table><tbody><tr><td>에틸렌 글리콜</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Scientific 임베딩 매질</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

브레인 은행 : 귀하의 연구 표본의 대부분을 만들기

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

불편 stereology 정확하고 효율적으로 관심 주어진 영역에서 총 뉴런 번호 (또는 다른 세포 유형) 계산하는 방법입니다<sup&gt; 1</sup&gt;. 이 목표를 달성하기 위해서는 6-10 체계 섹션은 전체 구조를 다루는 탐지해야합니다. 일반적으로이 처리되지 않은 물질의 상당한 양의 나뭇잎 5분의 1 섹션을 처리 포함됩니다. 자료를 극대화하기 위해, 우리는 장기 저장 연구 계획의 일환으로 고정 조직을 보존을위한 저렴한 방법을 제안합니다. 조직이 원하는 얼룩이나 항체, 다른 섹션에 대한 슬라이스 및 처리로가 체계적으로 미래를 처리 -20 ° C에 보존 항원에 배치해야합니다. 24 잘 접시를 사용하여 섹션 향후 검색을 위해 순서로 배열 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 조직은 저장하고 년간의 과정을 통해 immunohistochemistry에 대해 처리할 수 있습니다.

브레인 은행 및 생물 학적 물질의 체계적인 샘플링 불편 stereology의 기초를 제공하고 각 표본에서 얻은 잠재적인 데이터를 극대화할 수 있습니다.

비편향적 입체학(Unbiased stereology)은 관심 영역 내의 전체 뉴런 수(또는 다른 세포 유형)를 정확하고 효율적으로 추정하기 위한 방법입니다1. ...

이 절차를 시작하려면, 뇌 블록을 크라이오스탯(cryostat)용으로 준비하고 섹션 샘플링 빈도를 결정해야 합니다. 다음으로, 항원 보존액과 슬라이드를 준비합니다. 뇌 블록을 크라이오스탯 내부의 척(chuck) 위에 배치합니다.뇌 조직이 설정된 두께로 척 섹션(chuck section)에 단단히 고정되면, 첫 번째 시리즈는 슬라이드에 놓고 이후 시리즈는 항원 보존액이 미리 채워진 웰에 넣는 방식으로 체계적인 절편 제작을 수행해야 합니다. 블록을 모두 소진하면, 뇌 은행의 일부로서 플레이트를 -20 °C 냉동고에 보관하십시오. 안녕하세요, 저는 몬트리올 대학교 검안학과의 시각 신경과학 연구소의 Mark Burke 박사입니다.안녕하세요, 몬트리올 대학교 검안대학 시각 신경과학 연구소의 Shahin Zur 박사입니다. 안녕하세요, 몬트리올 대학교 검안대학 시각 신경과학 연구소 소장 Mo Petto 박사입니다. 오늘은 항원 보존액을 사용하여 뇌 조직을 체계적으로 보관하는 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 연구 재료를 최대한 활용하고 편향 없는 조사를 수행하기 위한 기초 단계로 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 본 프로토콜은 고정 후 1cm 두께의 슬라이스로 정위 고정 블록 처리하여 냉동 보관한 뇌 조직을 체계적으로 샘플링하는 방법을 설명합니다.이전 단계들에 대한 자세한 내용은 비인간 영장류 뇌의 정위 고정 공간 해부법을 다룬 최신 JoVE 논문을 참조하십시오. 체계적 샘플링의 첫 번째 단계는 샘플링 계획을 수립하는 것이며, 여기에는 조직을 어떻게 절편화할 것인지, 해당 절편들을 시리즈나 샘플로 어떻게 나눌 것인지, 그리고 샘플들을 어떻게 배치하고 추적할 것인지 결정하는 과정이 포함됩니다. 먼저, 필요에 따라 정위 고정 아틀라스를 참조하십시오.주두측(rostral), 꼬리측(caudal), 배측-복측(dorsal-ventral) 차원에서 관심 영역(region of interest)을 명확하게 정의하고 절단면을 선택하십시오. 그다음, 절편의 두께를 결정하고 관심 영역에서 총 몇 개의 절편을 만들 수 있는지 계산하십시오. 예를 들어, 뇌입체좌표 지도(Stereotaxic atlas)를 통해 관심 영역의 전체 주두-꼬리측 범위가 약 3 mm 길이임을 확인했다고 가정합니다.그다음 크라이오스탯(cryostat)을 50 micrometers 두께로 절편하도록 설정하며, 이 속도로 절편하면 전체 영역을 덮는 60개의 관상면(coronal) 절편을 얻게 됩니다. 이 시점에서 샘플링 간격을 설정할 수 있습니다. 전형적인 비편향적 조직학 연구에서는 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 체계적으로 샘플링된 6~10개의 절편이 필요합니다.이 예시에서는 Ros coddle 전체 범위에 걸쳐 동일한 간격으로 10개의 절편을 얻었으며, 이는 6개 절편 중 1개를 선택하는 샘플링 간격으로 이어집니다. 이러한 절편 샘플링 빈도를 결정한 후에는 어떤 염색을 수행할지 결정해야 합니다. 즉시 염색하고자 하는 절편은 조직을 절편화함과 동시에 슬라이드에 직접 부착하십시오.예를 들어, 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet)으로 염색하는 경우, 슬라이드 하나에 6개의 절편 중 하나를 고정하게 됩니다. 이것이 첫 번째 시리즈가 됩니다. 나머지 절편들은 향후 면역조직화학 염색을 위해 항원 보존액이 담긴 플레이트에 보관하십시오.여기에 표시된 샘플링 계획은 뇌 은행의 일부로서 2개의 슬라이드와 1개의 표준 24웰 플레이트에 분절을 배치하여, 이 조직 블록에 대해 총 6개의 시리즈로 구성됩니다. 다음 단계는 크라이오스탯 마이크로톰을 사용하여 조직 블록을 철저하게 절편화하는 것입니다. 먼저, 마이크로톰 헤드에 장착되어 샘플의 스테이지 역할을 하는 척(chuck)이라고 불리는 부품에 냉동 조직 샘플을 고정해야 합니다.먼저, 척(chuck) 위에 소량의 매립제(embedding medium)를 올리고 이를 동결시킵니다. 척을 마이크로톰 헤드에 장착하고, 샘플을 위한 평평한 표면이 만들어질 때까지 동결된 매립제를 깎아냅니다. 척을 마이크로톰 헤드에서 분리하여 크라이오스탯(cryostat) 내부에 평평하게 배치합니다.척(chuck) 위에 매립제를 붓고 단단하게 고정합니다. 절단면이 아래로 향하도록 뇌 블록을 척 위에 천천히 완전히 놓습니다. 뇌 조직 조각을 마운팅 매질에 매립합니다.미리 결정된 절편 샘플링 빈도에 따라, 뇌가 장착된 척(chuck)을 마이크로톰(Microtome) 헤드 섹션에 배치하십시오. 절편을 슬라이드에 부착하거나 항원 보존제가 포함된 플레이트 내의 지정된 시리즈에 추가한 후, 절편의 순서가 유지되도록 각별히 주의하십시오. 이는 나중에 뇌 뱅크로 돌아가 또 다른 체계적인 샘플을 채취할 수 있도록 절편을 슬라이싱하는 것입니다.조직 절편 제작을 모두 마치고 절편들을 웰에 배치했다면, 플레이트에 덮개를 덮고 파라필름으로 밀봉한 후 -20 °C 냉동고에 보관하십시오. 각 시리즈의 총 절편 수, 절편 샘플링 간격 및 동물당 시리즈 수를 기록하십시오. 이 기록은 향후 실험을 위해 브레인 뱅크에서 절편을 꺼낼 때 이를 추적하는 데 매우 중요합니다.이러한 방식으로 체계적인 샘플링을 수행하는 것은 저희 실험실의 표준 관행이었습니다. 지난 3년 동안, 신호의 저하 없이 antigen preserve에 3년간 보관된 재료를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행함으로써 큰 성과를 거두었습니다. 또한, 저희의 뇌 뱅크의 일환으로 비인간 영장류 뇌의 체계적 절편을 약 20,000개 기록하였습니다.장기 연구 계획의 일환으로, 생물학적 표본을 체계적으로 채취하고 보존하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 채취한 총 시리즈 수와 시리즈당 총 절편 수를 상세히 기록하는 것이 중요합니다. 또한, 절편이 분실되거나 손상된 경우, 체계적인 샘플링 절차를 유지하기 위해 해당 절편 번호를 기록지에 작성하십시오.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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