Name: 두뇌에 게이트웨이 : 프리 메이트 눈을 분석 해 봅시다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 학습하세요 비인간 영장류 망막 해부 기법을 통해 정상 발달 및 병리 상태 연구 방법을. 이 실험은 인간 망막 질환 이해와 노화 과정 연구에 중요한 통합 모델을 제공합니다.

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저자는 자신의 기술 지원 Ikiel Ptito 감사하고 싶습니다. 우리는 프랭크 에르빈, 로버타 Palmour 및 영장류 작품들의 지속적인 지원 세인트 키츠에 위치한 Behavioural 과학 재단 연구소, 웨스트 인디스의 직원에게 감사하고 있습니다.

1 부 : 조직의 사전 처리 <ol><li> 조직은 잘 paraformaldehyde, 글루 타 알데히드, 또는 포르말린과 perfused해야합니다. 이것은 일반적으로 다른 장기를 수확하는 데 사용되는 표준 transcardial 재관류를 통해 달성될 수있다. 그것은 얼마 후이 눈이 그냥 렌즈에 따라 정착액과 주입과 정착액에 저장 희생하는 것이 좋습니다. </li><li> 현재 연구에서 주제가 깊이 나트륨 pentobarbital (25 MG / kg, IV)의 과다로 euthanized 케타민을 하이드로 클로라이드 (10 MG / kg, IM)과 진정했고 완전히 exsanguinated 때까지 0.1 M PBS로 transcardially perfused. 이것은 5 분 (~ 1리터)을 PBS에 4 % paraformaldehyde 솔루션옵니다. </li></ol> 2 부 : 궤도 구멍에서 안구 제거 <ol><li> 눈알을 쉽게하기 위해 그것은 먼저 두뇌를 제거하는 것이 좋습니다. 두뇌가 삭제되면 얇은 벽으로 둘러싸인 궤도 뼈가 쉽게 분명합니다. 서서히 궤도의 장벽을 멀리 칩에 뼈 rongeurs을 사용합니다. 메스로 안구 근육을 버려야하고 안구의 결합 조직을 제거합니다. 조심스럽게 시신경을 잘라, 이것은 전자 현미경 연구에서 사용할 수 있습니다. 눈알이 이제 궤도 캐비티에서 공개 되어야만합니다. </li></ol> 파트 3 : 세안 컵에서 망막을 해부하다 <ol><li> 건조에서 망막을 유지하기 위해 PBS와 페트리 접시에 눈을를 놓습니다. 해부 현미경 또는 테이블 조명 스탠드를 확대하는 것은 필요하지 해부에 유용하지만, 장착. 스프링 가위로 오라 세라타의 수준에있는 각막의 경계와 밀접하게 공막엔을 절삭하여 각막을 제거하고 포셉와 렌즈를 제거합니다. </li><li> 공막엔에서 망막을 제거하는 페인트, 포셉, 그리고 봄 가위를 사용합니다. 이것은 공막엔에서 망막을 분리 후 가위로 멀리 공막엔를 절단하여 이루어집니다. 하나는 작은 단위로있는만큼 손상이나 망막 조직을 찢어하지이 과정을 수행합니다. 공막엔는 쉽게 있도록 신중하게 시신경 주위 공막엔를 잘라 나머지 시신경에서 분리되지 않습니다. </li><li> 이 시점에서 망막의 곡선 모양을 유지하고 샘플링을 위해 평평해야합니다. 망막을 평평화 전에 젤리의 일관성을 가진 유리 유머는, 덩어리에서 제거할 수 있습니다. 슬라이드에 망막을 버리고, 메스 블레이드 여러 레이디얼 인하합니다. 잔여 유리체의 유머는 이제 일반 필터 종이와 페인트로 제거할 수 있습니다. 그것은 유리 유머를 제거하면 부드럽게하는 필수적인하므로 망막 신경절 세포 레이어는이 시점에서 노출됩니다. 시신경이 여전히 광학 디스크에 연결된 경우, 메스 칼날과 봄 가위를 사용하여 망막을 추출하지 않고 시신경을 제거합니다. 이것은 이제 평면 마운트 망막 (그림 1)이고 fovea는 광학 디스크에서 시간적 / 복부 방향으로 어두운 패치로 명확해야합니다. </li></ol> 4 부 : 샘플링 <ol><li> 망막을 샘플링 옵션이 많습니다. 여기서 우리는 flatmount 준비와 isodentric 샘플링을 설명합니다. 모두를위한 절차는 멀리 슬라이드에서 광섬유 레이어로 망막을 flatmount. 의도가 flatmount 준비에서 망막 신경절 세포 레이어를 조사하는 경우도 색소 상피를 제거하거나 표백하는 것이 필요합니다. 색소 상피이 레이어의 일부를 제거하는 가볍게 페인트를 사용하여 제거하려면,이 photoreceptor 레이어를 손상하는 경향이있다. 표백하면, 1 시간 동안 칼륨 과망간산염 솔루션 (0.25 %)에서 망막에 몸을 담글 수 증류수로 세척하고, 5 분 괭이밥에서 채취한 산성 (5 %)에서 지우면 포함됩니다. 2 </li><li> 의사가 망막을 통해 각 계층의 세포 분포 및 형태를 조사할 수있다면, 우리는 망막의 사시도 샘플링을 제안한다. 망막은 슬라이드에 flatmounted하고 PBS로 젖은 보관해야합니다. 사시 샘플링에 대한 콧소리, 현세의 상위 및 하위 경로 (그림 1)에있는 광학 디스크에서 등거리 조직의 작은 조각을 잘라 버릴거야. 이런 준비에 표백제 색소 상피를 필요는 없습니다. 이 작품은 현재 연구 질문에 따라 그라 이오 스탯, vibratome 또는 ultramicrotome와 코로나 비행기에서 sectioned 수 있습니다. 그라 이오 스탯의 sectioning 들어, 조각은 야간 30 % 자당에 cryoprotected이어야하며 드라이 아이스에 장착 매체의 맥락에서 냉동. 또한, 샘플은 한천에 포함된하고 vibratome에 얇게하실 수 있습니다. 그라 이오 스탯 및 vibratome 준비가 안정적으로 4 미터만큼 얇은 부분을 얻을 것입니다 얇은 섹션 (전자 현미경의 준비 등) 필요한 경우, 그것은 ultramicrotome에 대한 샘플을 준비하는 것이 필요합니다. 이렇게하려면 섹션 fumehood에 따라 1 시간 오스뮴 tetroxide에 포스트 수정되어야합니다. 이 등급 에탄올 탈수 시리즈 (50, 70, 95, 95, 100, 100 %) 및 ​​100 %의 프로필렌 산화물옵니다. 조직다음 Epon (임베드 - 812 포함 키트)에 포함된 것입니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 : 저희 연구실에서는, 우리는 정기적으로 cryosectioned retinae (그림 2)에 immunohistochemistry을 수행합니다. 이 경우에는 우리는 영장류 망막에서 cannabinoid 수용체 (CB1)의 isodensity에 관심이 있습니다. 우리는 또한 영장류 시각 시스템에 태아 에탄올 노출의 효과를 검사합니다. 이를 위해, 우리는 fovea과 주변 망막에있는 세포 밀도와 레이어의 두께에 관심이 있습니다. 이것을 달성하기 위해, 우리는 ultramicrotome에 700nm에서, Epon에 슬라이스를 망막의 조각을 포함,, 1 % toluidine 블루 (그림 3)와 얼룩. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 Flatmount의 망막. 레이디얼 상처는 망막을 평평하게하는 데 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 Immunostaining가. 주변 망막의 Cryosection는 망막 신경절 세포가 많이 안쪽과 바깥 핵 층의 일부 레이블과 레이블 아르 CB1에 대한 immunostained. 이 섹션의 두께는 슬라이드에서 14m와 얼룩이다. RG - 망막 신경절 층, IP - 내부 plexiform 층, IN - 내부 핵 계층, OP - 외부 plexiform 층, ON - 바깥 핵 층. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig3.jpg" alt="그림 3" /> Epon에 포함된하여 700nm에서 ultramicrotrome에 얇게 있던 fovea을 통해 그림 3 Fovea. 절을 참조하십시오. photoreceptor 층 (PR)이 섹션을 정렬하는 데 사용되었다. photoreceptors의 전체 범위가 코로나 비행기에 적절한 각도를 나타내는 확인할 수 있습니다납니다. 밀도 측정은 300m, 500m, 그리고 Bioquant 이미징 시스템을 사용 foveal 구덩이의 중심에서 800m에서 찍은. RG - 망막 신경절 층, IP - 내부 plexiform 층, IN - 내부 핵 계층, OP - 외부 plexiform 층, ON - 바깥 핵 층, 규모 표시줄 = 50m

<ol><li>Hendrickson, A., Kupfer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histogenesis+of+the+fovea+in+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The histogenesis of the fovea in the macaque monkey.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+in+the+St.+Kitts+green+monkey+%28Cercopithecus+aethiops+sabeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus).</a> J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).</li>
<li>Stone, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStone%2C+J+%22The+Wholemount+Handbook%22">The Wholemount Handbook</a>. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+early+hemispherectomized+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys.</a> Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).</li>
<li>Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).</li>
<li>Pow, D., Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+kinesis%2C+neurite+sprouting+and+abnormal+axonal+projections+of+cone+photoreceptors+in+the+aged+and+AMD-afflicted+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina.</a> Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).</li>
</ol>

wholemount로 망막의 준비는 지형과 신경절 세포 레이어 또는 망막 혈관 3 내피 세포 중의 공간적 분포의 분석을 위해 수 있습니다. 영장류 망막의 주변에있는 세포 밀도 부량이 쉽게 수행됩니다. 그러나 perifoveal 및 foveal 지역에서 신경절 세포 레이어에 여러 레이어 스태킹은 부량을 방해. 이러한 잠재적인 편견을 회피하려면, fovea 및 perifoveal 지역은 코로나 비행기 2,4 년 반 얇은 섹션을 얻기 위해 ultramicrotome를 사용하여 wholemount 준비에서 해부 Epon에 포함된, 그리고 순차적으로 sectioned 수 있습니다. 대체 샘플링 패러다임과 함께 극복할 수있는 wholemount 준비, 다른 단점이 많습니다. 망막에서 사시 샘플을 채취하고 그라 이오 스탯이나 vibratome 중의 코로나 비행기에 sectioning 것은 쉽게 wholemount 준비에 수행할 수없는 다른 레이어의 ...

<table><tbody><tr><td>메스</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>메스 날</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>모든 수술용 가위 사용 가능</td></tr><tr><td>론저(Rongeurs)</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>포셉</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>낙타털 또는 세이블 털 붓</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

두뇌에 게이트웨이 : 프리 메이트 &#39;눈&#39;을 분석 해 봅시다

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

인간의 시각 시스템은 세계의 관문으로 간주하고 감각, 지각 및인지 과정의 과다에 주요 역할을합니다. 그것은 비전의 품질은 삶의 질을 묶어 것을 따라서 놀라운 일이 아닙니다. 시각 장애의 원인을 둘러싼 광범위한 임상 및 기초 연구에도 불구하고, 그러한 retinitis pigmentosa과 황반 변성 등 시각 장애, 여러 형태의 효과적인 치료를 부족합니다. 비 인간 영장류는 인간의 것과 눈 개발의 가장 일반적인 기능을 가지고 있습니다. 뿐만 아니라 그들은 유사한 혈관 해부학을 가지고 있지만, 다른 포유 동물 사이, 영장류가 높은 영상 시력, fovea에 대한 전문 시간적 망막에서 영역을 갖는 독특한 특성을 가지고 할<sup&gt; 1</sup&gt;. 여기 우리는 망막 조직학, immunohistochemistry, 레이저 캡처 microdissection뿐만 아니라, 빛과 전자 현미경을위한 조직을 제공하는 영장류 망막을 해부에 대한 일반적인 기술을 설명합니다. translational 모델로 비 인간 영장류의 확장 사용과 함께, 우리의 희망은 망막의 개선 이해가 영향을받는 개인의 삶의 질을에 시각 장애의 부정적인 영향을 attenuating 또는 반대 방향으로 효과적인 접근 방법에 대한 통찰력을 제공할 것입니다.

비 인간 영장류가 개발 및 노화에 대한 우리의 이해를위한 중요한 translational 수종이다. 영장류 망막의 해부 학적 조직은 인간의 정상 및 병리 학적 조건에 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

인간의 시각 시스템은 세상으로 향하는 관문으로 여어지며, 수많은 감각적, 지각적 및 인지적 과정에서 핵심적인 역할을 수행합니다...

이 절차는 혈류가 잘 유지된 원숭이 머리에서 시작합니다. 뇌를 제거한 후 안구를 추출하여 연결합니다. 다음으로 주변 조직을 제거하고, 각막 렌즈, 공막 및 유리체를 조심스럽게 제거하여 망막을 분리합니다.망막을 유리 슬라이드 위에 평평하게 놓고, 남아 있는 유리체를 제거합니다. 그다음 Iso Dentrix 시료를 채취하여 동결 보호 처리합니다. 안녕하세요, 저는 몬트리올 대학교 검안대학 시각 신경과학 연구실의 Mark Burke 박사입니다.안녕하세요, 저는 몬트리올 대학교 검안학과의 시각 신경과학 연구실 소속 Shaheen Zur 박사입니다. 안녕하세요, 저는 몬트리올 대학교 검안학과의 시각 신경과학 연구실 책임자인 Tito 박사입니다. 오늘은 비인간 영장류의 망막을 적출하는 절차를 보여드리겠습니다.저희 연구실에서는 정상적인 발달 과정 및 발달 중의 외부 간섭에 반응하는 망막 조직의 다양한 측면을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이전에 관류 처리를 마친 영장류의 머리부터 준비하여 프로토콜을 시작하십시오.Paraformaldehyde와 같은 고정액을 사용하여, 여기서 해부할 망막을 버빗원숭이로부터 채취합니다. 안구를 확실하게 보존하기 위해 paraform aldehyde와 같은 고정액을 수정체 바로 아래에 주입할 수 있습니다. 안구에 더 쉽게 접근하기 위해, 안구를 적출하기 전 머리를 고정액 또는 PBS에 보관해야 합니다.먼저, 뇌를 제거합니다. 이 과정은 정위 공간에서 비인간 영장류 뇌를 해부한 최신 JoVE 논문을 참고하십시오. 뇌를 제거하면 벽이 얇은 안와골이 쉽게 나타납니다.골 큐렛(bone curette)을 사용하여 안와벽을 천천히 깎아냅니다. 메스로 안근을 절개하고 안구에서 결합 조직을 제거합니다. 마지막으로 시신경을 조심스럽게 절단하여 안구를 안와강에서 분리합니다.안구를 분리했으므로 이제 망막을 제거할 수 있습니다. 망막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 먼저 안구를 PBS가 채워진 페트리 접시에 넣으십시오. 각막을 제거하는 것부터 시작합니다. 스프링 가위를 사용하여 전거톱니연(ora serrata) 높이에서 각막 주변부의 공막을 절개하십시오.포셉을 사용하여 수정체를 제거합니다. 마지막으로, 공막에서 망막을 분리합니다. 이때 페인트 붓, 포셉 및 스프링 가위를 사용하십시오.망막을 공막에서 분리한 다음 가위로 공막을 잘라냅니다. 망막 조직의 손상이나 찢어짐을 방지하기 위해 이 과정은 조금씩 나누어 수행해야 합니다. 공막은 남은 시신경에서 쉽게 분리되지 않습니다.시신경 주변의 공막을 조심스럽게 절개합니다. 이때 망막이 곡선 형태를 유지하도록 합니다. 젤리 형태의 유리체를 덩어리째로 제거합니다.이제 망막을 슬라이드에 고정하고 샘플링할 준비가 되었습니다. 망막을 슬라이드 위에 평평하게 펴기 위해 메스 날을 사용하여 방사형으로 여러 번 절개합니다. 일반 여과지와 붓을 사용하여 남아 있는 유리체액을 제거하십시오.이 단계에서는 망막 신경절 세포층이 노출되므로 매우 조심스럽게 수행하는 것이 필수적입니다. 시신경 유두에 시신경이 여전히 부착되어 있는지 확인하십시오. 메스 날과 스프링 가위를 사용하여 망막이 찢어지지 않도록 시신경을 제거하십시오.이제 망막을 2x3인치 유리 현미경 슬라이드 위에 평평하게 마운트하며, 이때 망막 신경절층이 슬라이드 반대 방향을 향하게 합니다. 중심와는 이제 시신경 유두로부터 측두 복측 방향의 어두운 패치로 나타납니다. 망막 신경절 세포층을 관찰하려면 색소 상피층을 제거하거나 표백해야 할 수도 있습니다.붓을 사용하여 색소 상피 일부를 가볍게 제거합니다. 이 방법은 광수용체 층을 손상시키는 경향이 있음에 유의하십시오. 망막 전반에 걸친 각 층의 세포 분포와 형태를 조사하려면 망막의 등거리 샘플링이 필요합니다.먼저 망막을 슬라이드에 평면 장착(flat mounting)하고, 망막이 마르지 않도록 PBS를 첨가합니다. 그런 다음 시신경 유두(optic disc)를 중심으로 비측(nasal), 귀측(temporal), 상측 및 하측 방향으로 동일한 거리의 조직 조각들을 작게 절단합니다. 이렇게 절단된 조각들을 크라이오스탯 바이브레이토(cryostat vibrato) 또는 울트라 마이크로톰(ultra microtome)을 사용하여 관상면(coronal plane)으로 절편화할 수 있습니다.연구 질문에 따라 달라집니다. 크라이오스탯(cryostat) 절편 제작의 경우, 망막 조각들을 인산염 완충액에 포함된 30% sucrose에서 4°C로 하룻밤 동안 저온 보호 처리해야 합니다. 하룻밤 배양 후, 건조 얼음 위에서 마운팅 용액(mounting medium)을 사용하여 망막 조각들을 동결시킵니다.크라이오스탯을 사용하여 4 µm 두께의 절편을 제작합니다. 본 연구실에서는 냉동 절편 망막에 대해 통상적으로 면역조직화학 염색을 수행합니다. 이번 실험에서는 영장류 망막 내 카나비노이드 수용체의 등밀도(iso density)를 분석하고자 합니다.우리는 또한 태아기 에탄올 노출이 영장류의 시각 체계에 미치는 영향을 조사합니다. 이를 위해 중심와와 주변부 망막의 세포 밀도 및 층 두께에 주목합니다. 이를 수행하기 위해, 초정밀 절편기(ultra microtome)를 사용하여 망막 조각을 700 nanometers 두께의 epon slice로 임베딩하고 1% toine.Blue로 염색합니다.지금까지 영장류의 망막을 적출하는 방법을 보여드렸습니다. 이 과정을 수행할 때, 망막 신경절 세포층이나 광수용체 층이 손상되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

아닌 인간 영장류의 두뇌의 정상적인 처리에 대한 우리의 이해를위한 중요한 translational 수종입니다. 영장류 두뇌의 해부 학적 조직은 인간의 정상 및 병리 학적 조건에 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

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마우스 눈 해부의 정식 데모는 망막 안료 상피의 전체 마운트의 결과.

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비종양성 지구본의 철저한 그로잉 및 표준화된 절편은 고품질의 재현 가능한 조직병리학적 절편을 얻는 데 중요합니다. 성인 및 태아의 비종양 지구본의 표준화된 매출에 대한 지침이 여기에 제공됩니다. 사례 기반 의사 결정에 대한 기준을 포함하여 구체 절편에 대한 다양한 옵션을 시연하고 논의합니다.

태아의 눈을 포함한 비종양성 지구의 그로잉(Grossing of non-neoplastic globes, including petal eyes)

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

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