Name: 측정 식물 세포 벽 확장 (크리프)는 산성 산도에 의해 및 알파 Expansin에 의해 유도된 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 학습하세요 식물 세포벽 확장 측정법으로 산성 pH와 알파 익스팬신이 세포벽 신축성에 미치는 영향을 연구하는 방법입니다. 오이 hypocotyl을 이용한 일정 힘 신장계 측정 기술을 익혀보세요.

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여기에 표시된 기술은 에너지학과 (Bioenergy 과학)에서 보조금과 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 자금과 개발되었습니다.

1 부 : 재배와 적합한 식물 자료를 저장 <ol><li> 우리의 경험에서 etiolated 오이 모종의 젊은 hypocotyls이 실험을 위해 세포 벽 재료의 편리한 소스로 제공하고 있습니다. 오이 씨앗 26에서 설정한 일정한 온도 룸에서 어두운 캐비닛에 보관되는 빛을 증거 상자 ° C.에 서부 유럽 표준시 종이에 sown 아르 C가 괜찮을 20 °와 30 ° 사이에 아무것도로 정확한 온도가 중요한 것은 아니지만 온도가 묘목 개발의 적절한 단계에 도달 얼마나 빨리 결정됩니다. 따뜻한 온도, 빨리 묘목이 개발합니다. 그들은 파종 후 3-4일에 도달 길이 약 5cm로 성장 할 때 우리는 일반적으로 모종을 사용합니다. 빛의 심지어 소량 우리가이 기술을 측정되는 묘목 개발의 속도와 세포 벽 특성 모두에 영향을 미칠 때, 묘목이 어둠 속에서 성장하는 것이 중요합니다. 일 3 당신은 세들링 개발에 확인, 희미한 녹색 빛 필터링을 사용하여 상자에 살짝 수 있습니다. </li><li> 모종 신속하게 절단하고 작은 플라스틱 상자, 상자 당 100-150 모종의 포장하고, -80 ° C.에 저장됩니다 이 온도에서 그들은 몇 주 동안 유용하게 남아있다. </li></ol> 2 부 : 준비 셀 벽 샘플 <ol><li> 냉동 컷 모종의 소그룹 (80-10)은 냉동고에서 -80 냉동실 블록을 포함하는 절연 컨테이너로 전송됩니다. </li><li> hypocotyl를 덮고 표피는 카보런덤와 abraded 있습니다. 이것은 반복 서부 유럽 표준시 카보런덤 분말의 굵은 슬러리와 코팅의 엄지와 집게손가락 사이 hypocotyl를 그림으로써 이루어집니다. ; 너무 작은 압력과 표피가 permeabilized되지 않습니다 너무 많은 압력과 표피 레이어가났습니다하고 찢어진 것으로 시작 : 그것은 사용 압력의 정확한 금액을 알고 조금 경험이 걸립니다. 하나는 또한 냉동 hypocotyl 녹아서, 그것이 관리 이완된 및 하드되어 있기 때문에 신속하게 작업합니다. </li><li> 나머지 hypocotyls가 유사한 방식으로 준비하는 동안 abraded hypocotyl는 얼음물에 저장된 후 준수 카보런덤와의 대부분을 제거하는 얼음물에 담근이다. </li><li> hypocotyls는 새로운 하나의 양날 면도날로, 원하는 길이, 보통 1.2 cm로 절단하고 유리 슬라이드에 정렬됩니다. </li><li> 이제 우리는 세포 수액을 제거하고 클램핑 촉진하기 위해 벽면을 평평하게해야합니다. 두 번째 유리 슬라이드는 샌드위치를​​ 형성 8-10 샘플 그룹의 상단에 위치합니다. 무게 (400~500그램)는 5 분 유리 슬라이드 위에 위치합니다. 무게 위해 우리는 정기적으로 물을 적절한 금액을 포함하는 비커를 사용합니다. </li><li> 선택 단계 : 실험에 따라 hypocotyls이 시점에서 간단한 열처리로 inactivated 수 있습니다. 이렇게하려면 우리는 유리가 고무 밴드의 한 쌍을 함께 슬라이드를 바인드 실온에서 드 이온화 물 100 ML있는 용기에 어셈블리를 넣고 전체 전력에서 전자렌지에 넣습니다. 우리 전자렌지로 물이 약 50 S에서 끓기 시작하고 끓는이 시작 후 우리는 전자 레인지 15 S를 중지합니다. 온수는 빠르게 해제 붓고 및 변성을 막을 찬물로 대체됩니다. 귀하의 전자 레인지가 우리와 다를 수 있습니다대로,이 타이밍을 변경할 수 있습니다. 과도한 난방과 샘플이 약하되어 쉽게 휴식. 충분한 가열과 내생 expansin는 inactivated과 벽면 샘플 산성 pH의 몇 가지 대응을 유지하지 않습니다. </li></ol> 파트 3 : 신장계 설정 <ol><li> 벽 샘플은 현재 지속적인 강제 신장계에 고정되어 있습니다. 이것은 벽에 샘플과 샘플의 꼭대기의 끝에 붙어 움직일 수있는 클램프의 기초 끝을 잡고위한 플렉시 쿠베트 구성된 맞춤식 장치입니다. 움직일 수있는 클램프가 위치 센서의 오픈 코일 통과 막대의 끝 부분에 탑재, LVDT 또는 전자 작은 금속 실린더의 위치를​​ 감지 &#39;선형 가변 차동 변압기&#39;, 또는 &#39;핵심&#39;입니다 막대에 연결된. 막대의 위쪽 끝을 조절 평형추있는 레버에 연결되어 있습니다. 이 레버는 벽에 샘플에서 위쪽으로 힘을 조절 금액을 미치는. 힘이 레버의 맨 끝에 조정 금속 무게를 추가하거나 제거하여 조정됩니다. </li><li> 위로 벽면 예제 - hypocotyl 샘플의 기초 끝을 잘 포셉과 혀끝의 끝에 ~ 2~3mm이 움직일 수있는 클램프의 오픈 문턱 사이에 위치로 체포됩니다. 이 클램프 누구의 금속 문턱이 금속 표면과 버퍼 솔루션이나 벽에 샘플 사이의 직접 접촉을 방지하기 위해 플라스틱과 코팅하는 용수철 악어 클램프입니다. 우리의 경험 금속 이온에 연장, 그래서 우리는 금속이 적용 유지 벽의 능력을 발휘 클램프의 리치가 수있다. </li><li> 한 손으로 움직일 수있는 클램프 어셈블리를 개최, 벽 시편의 기초 끝에 이제 플렉시 쿠베트과 쿠베트의 두 기복 조각 사이 였는데입니다조각이 함께 가져온시키고 쿠베트의 벽 샘플의 바닥 끝을 잠금, 꽉 망했다. </li><li> 움직일 수있는 클램프 어셈블리 이제 부드럽게 평형의 전체 힘이 벽에 표본로 전송 있도록 배포되고 있습니다. 우리는 일상적으로 오이 hypocotyls에서 준비 벽 샘플 20g 총 평형추을 사용합니다. 기타 벽 자료 또는 실험 서로 다른 가중치를 필요로 할 수도 있습니다. </li><li> 쿠베트는 버퍼가 가득 (200 UL)과 쿠베트의 위치는 움직일 수있는 클램프가 LVDT 측정 범위의 하단에 회부되도록, 조정 나사와 함께 아래로 이동하거나합니다. 우리 LVDT는 마이크로의 데이터 수집 장치에 연결하고, 그래서 우리는 컴퓨터를 통해 LVDT 위치를 모니터입니다. 우리는 동시에 8 벽에 샘플을 실행할 수 있습니다 하나의 컴퓨터와 병렬로 연결 팔 LVDT 어셈블리 있습니다. 컴퓨터는 매 30 S. 한번 LVDT 어셈블리의 각각의 위치를​​ 기록 </li></ol> 4 부 : 산성 산도 또는 expansin로 측정 확장 응답 - 대표 결과 <ol><li> [첫 번째 실험] 산성 유발 연장의 측정을 위해, 우리는 기본 벽 샘플 (즉, 열과 inactivated되지 않습니다)과 중성 버퍼로 시작은 쿠베트에 추가됩니다. 벽면 샘플 추가 긴장에 대응, 몇 분 동안 연장하지만, 확장 자연 붕괴 몇 분 후에 낮은 요금합니다. 우리 컴퓨터는 우리가 어느 샘플의 길이의 변화 (즉 실험의 시작 후 움직일 수있는 클램프의 위치의 변화입니다) 모니터 또는 우리가 즉, 확장의 속도를 위치의 시간 유도체를 모니터링할 수 있습니다 . 확장 속도는 시간과 낮은 값을 안정화. </li><li> ~ 20 분 후, 중립 버퍼가 제거됩니다. 우리는 벽에 최소한의 방해 또는 기계 조립과, 빨리 버퍼를 제거하는 진공 펌프에 연결된 대형 게이지 피하 바늘로 만든 얇은 금속 파이프를 사용합니다. 산성 버퍼는 다음 산성 버퍼의 전체 교환을 확보하기 위해 1-2 신속한 교류로 때로는 추가됩니다. 그렇다면 우리는 앉아서 벽의 반응을 봐. 일반적으로 우리는 몇 분 안에 확장의 빠른 속도를 검색할 수 있습니다. 어떤 경우에 측정이 더 이상 기간을 연장할 수 있지만 60 분 후에 우리는 일반적으로, 확장 반응을 평가하기 위해 충분한 정보를 얻을 수있다. </li><li> [두번째 실험] expansin 유발 세포 벽 확장의 측정을 위해, 우리는 열을 inactivated 벽 샘플 산성 버퍼로 시작은 쿠베트에 추가됩니다. 첫 번째 실험과 마찬가지로, 세포 벽 확장의 속도가 점차 때문에 기능 expansin 부족의 낮은 값으로 안정. </li><li> ~ 20 분 후, expansin 단백질은 expansin 솔루션의 10-20 UL과 쿠베트에서 버퍼와 &#39;급상승&#39;에 의해 쿠베트에 추가됩니다. expansin는 빠르게 세포 벽 샘플을 관통하고 몇 분 이내에 우리는 확장 률이 증가했습니다 것을 볼 수 있습니다. 이 확장 응답 시간 이상 다음 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1263/fig1.png" alt="" width="600" height="469" /> 그림 1 : 산성 유발 또는 expansin 유발 벽을 확장을 평가하기 위해 세포 벽 준비 절차의 개요.

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+long-term+extension+of+isolated+cell+walls+from+growing+cucumber+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.</a> Planta. 177, 121-130 (1989).</li>
<li>Rayle, D. L., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Acid+Growth+Theory+of+auxin-induced+cell+elongation+is+alive+and+well%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well.</a> Plant Physiol. 99, 1271-1274 (1992).</li>
<li>Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin-induced+growth+of+Avena+coleoptiles+involves+two+mechanisms+with+different+pH+optima%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxin-induced growth of Avena coleoptiles involves two mechanisms with different pH optima.</a> Plant Physiol. 99, 1556-1561 (1992).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407, 321-326 (2000).</li>
<li>McQueen-Mason, S., Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+endogenous+proteins+that+induce+cell+wall+expansion+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants.</a> Plant Cell. 4, 1425-1433 (1992).</li>
</ol>

그들이 처리하고 좋은 감도와 반응하기 쉬운 벽 샘플의 신뢰할 수있는 원본으로 입증해야하기 때문에이 실험을 위해 우리는 오이 hypocotyls의 세포 벽를 사용했습니다. 우리는 또한 어린 시금치 잎과 셀러리 줄기로 슈퍼마켓에서 다른 모종뿐만 아니라 재료에서 벽 좋은 성공을 있었다. 기본적으로, 젊고 부드럽고 빠르게 성장하는 식물의 조직이 쉽게이 기술을 측정 가능성이 있지만, 거친, 이전, 산화 또는 nongrowing 식물 조직 때문에 세포 벽이 교차 연결의 반응이 될 가능성이 있습니다. 주의 할 몇 가지 다른 것들이 있습니다 : <ol><li> 생물 다양성 - 심지어 균일한 모종이 변수 응답을 제공하므로 5-8의 최소 복제는 통계적으로 의미있는 결과를 얻을 필요가 있습니다. </li><li> 표피의 마모가 세포 벽에 표본으로 버퍼 및 단백질의 빠른 침투력을 허용하는 것이 중요합니다. 표피가 충분히 abraded되지 않은 경우, 산성 버퍼에 대한 답변은 느리고 음소거되고 단백질도 응답을 이끌어내는 수있는 표피를 뚫고하지...

측정 식물 세포 벽 확장 (크리프)는 산성 산도에 의해 및 알파 expansin에 의해 유도된

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

성장 식물 세포 벽 특질상 우리가 그들이 낮은 PH (&lt;5) 1에서 더 확장 의미하는 &#39;산성의 성장&#39;으로 알려진 속성을 나타냅니다. 식물 호르몬 옥신은 급격히 산성 성장 메커니즘 2, 3 적어도 일부 젊은 줄기 및 유사 조직의 세포 신장을 자극. 옥신은 H를 활성화 + 플라즈마 막에 펌프를, 세포 벽 솔루션의 산성화을 불러 일으킨다. 벽면 산성화은 세포 벽이 셀 turgor 압력에 의해 만들어진 벽면 긴장에 항복로 인해, 내생 세포 벽 - 느슨해진 단백질 4아르 expansins를 활성화됩니다. 그 결과, 세포가 급속하게 확대하기 시작합니다. 이 &#39;산성 성장&#39;현상이 쉽게 격리 (nonliving) 세포 벽 표본 단위로 측정됩니다. 산성 유도 확장자를 받아야하는 세포 벽의 능력은 단순히 세포 벽의 다당류 (예 : pectins)의 구조 배열의 결과 아니라, expansins 5 활동에 따라 달라집니다. Expansins은 알려진 효소 활동을하지 않으며 expansin 활동에 대해 분석하는 유일한 방법은 세포 벽 확장 자신의 유도를 측정하는 것입니다. 이 비디오 보고서는 세부 expansin의 assays에 적합한 벽 자료를 얻기위한 소스와 준비 기술과 산성 유발 확장 및 성장 오이 hypocotyls에서 준비 벽 샘플 expansin 유발 확장을 보여주기에갑니다. 적당한 세포 벽 샘플을 얻으려면, 오이 모종이 어둠 속에서 재배, hypocotyls가 -80에서 잘라 냉동 ° C. 냉동 hypocotyls는 abraded 평평하고 신장계 측정을위한 특별한 쿠베트에 일정한 장력에 고정되어 있습니다. 산성 유도 확장을 측정하려면 벽은 처음에 기본 셀 벽면의 구성 요소 expansins의 낮은 활동의 결과, 중성 산도에서 버퍼입니다. 산성 산도에 버퍼 교환시 expansins가 활성화하고 세포 벽이 급속하게 확장하고 있습니다. 우리는 또한 reconstitution 분석에 expansin 활동을 보여줍니다. 이 부분에 대한, 우리는 세포 벽 샘플에서 네이티브 expansins을 변성하는 간단한 열처리를 사용합니다. 이러한 inactivated 세포 벽 산성 버퍼에도 확장할 수 없지만, 세포 벽에 expansins의 또한 급속하게 확장하는 능력을 복원합니다.

우리는 산성 버퍼와 expansin 단백질에 의해 유도된 식물 세포 벽의 표본의 장기 연장 (크리프)를 측정하기 위해 일정한 - 강제 신장계의 사용을 보여줍니다.

측정 식물 세포 벽 확장 (크리프)는 산성 산도에 의해 및 알파 Expansin에 의해 유도된

성장하는 식물 세포벽은 '산성 성장(acid growth)'이라고 알려진 특성을 특징적으로 나타내는데, 이는 pH가 낮을 때(< 5) 세포벽의 신장성이 더 커짐을 의미합니다 1. ...

본 연구에서는 세포벽 신장 기하학을 통해 신장 및 활성을 측정하는 방법을 제시합니다. 내인성 expansion이 결합된 천연 세포벽에 의해 촉매되는 산 유도 신장을 측정하기 위해, E TAT 처리된 오이 종자 엽초의 하이포코틸(hypocotyl)에서 적절한 벽 표본을 준비할 수 있습니다. 중성 완충액 상태에서 벽을 신장계에 고정하고 산성 pH로 전환하면 expansion이 활성화되어 세포벽이 빠르게 신장됩니다.우리는 또한 팽창 재구성 분석(expansion reconstitution assay)을 시연합니다. 이 단계에서는 짧은 열처리를 통해 내인성 팽창 인자들을 변성시킵니다. 열로 비활성화된 세포벽은 산성 완충액에서도 확장되지 않지만, 팽창 인자를 첨가하면 세포벽의 신장성이 빠르게 회복됩니다.안녕하세요, 저는 펜실베이니아 주립대학교 생물학과의 Daniel Cosgrove 박사 연구실 소속 Dan De Roko입니다. 오늘은 분리된 식물 세포벽의 비가역적 신장 또는 크리프(creep)를 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.저희의 경험에 따르면, 오이 묘목에서 얻은 어린 하이포 아보카도는 세포벽 물질의 편리한 공급원이 됩니다. 본 실험을 위해, 오이 씨앗을 빛이 차단된 상자 안의 젖은 종이에 심어 26 °C로 설정된 항온실 내 암실 보관함에 둡니다. 22 °C에서 30 °C 사이의 온도에서도 가능하지만, 온도가 성장 속도를 결정한다는 점에 유의해야 합니다.온도가 높을수록 묘목의 성장 속도가 빨라집니다. 아주 적은 양의 빛이라도 묘목의 발달 속도와 본 기술로 측정하는 세포벽 특성에 영향을 미치므로, 어두운 성장 환경을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 3일 차에는 어두운 녹색 필터광을 사용하여 박스 내부를 살펴보고 묘목의 발달 상태를 확인할 수 있습니다.보통 3일 또는 4일째에 박스 내부를 확인하면 묘목이 약 5cm 길이까지 자란 것을 볼 수 있으며, 이는 일반적으로 실험에 사용되는 크기입니다. 이 묘목들은 사용 전 -80 °C에서 냉동 보관할 수 있습니다. 세포벽 시료 준비를 시작하려면, 냉동되어 절단된 묘목 8~10개를 소그룹으로 묶어 냉동고에서 -80 °C 냉동 블록이 들어 있는 단열 용기로 옮깁니다. 엄지와 검지에 carbo run 파우더를 두껍게 도포한 후, 엄지와 검지로 하이포코틸을 반복적으로 문질러 하이포코틸을 덮고 있는 큐티클 층을 제거합니다.이 기술을 수행할 때는 표피층을 손상시키지 않으면서 큐티클의 투과를 보장할 수 있는 정확한 압력을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 냉동된 hypo coddle이 해동되면서 납작해져 부착된 carum의 대부분을 제거하기 어려워지므로 신속하게 작업해야 합니다. 마모된 hypo coddle은 담근 후, 나머지 hypo coddle들을 준비하는 동안 얼음물에 보관합니다.모든 묘목의 큐티클을 제거한 후, 새 외날 면도날을 사용하여 보통 1.2 centimeters의 원하는 길이로 자르고, 정렬 후 유리 슬라이드 위에 배치합니다. 8~10개의 시료 그룹 위에 두 번째 유리 슬라이드를 덮고, 그 위에 400 to 500 grams의 무게추를 5분 동안 올려둡니다. 이때 일반적으로 적당량의 물이 채워진 비커를 사용합니다.비커의 무게로 세포벽을 눌러 세포액을 제거하고 클램핑을 용이하게 합니다. 실험 내용에 따라, 이 시점에서 짧은 열처리를 통해 hypo coddles를 불활성화할 수 있습니다. 이를 위해 유리 슬라이드를 고무줄 한 쌍으로 묶어, 실온의 탈이온수 100 mL가 담긴 용기에 넣은 후 전자레인지에 넣고 최대 출력으로 가열합니다.약 50초 후에 물이 끓기 시작하며, 끓기 시작한 지 15초 후에 마이크로웨이브를 정지시킵니다. 변성을 중단시키기 위해 뜨거운 물을 빠르게 따라내고 찬물로 교체합니다. 최적의 가열이 이루어지면 샘플은 낮은 pH에 반응하지 않으면서도, 동시에 약해져서 쉽게 부러지지 않는 상태가 됩니다. 이제 벽 샘플을 정하중 X 신伸び계(extensometer)에 고정합니다.이 장치는 벽면 시료의 기저단을 고정하기 위한 플렉시글라스 큐비트와 시료의 정단(APIC end)에 부착된 이동식 클램프로 구성된 맞춤 제작 장치입니다. 이동식 클램프는 LVDT(선형 가변 차동 변압기)라는 위치 센서의 개방형 코일을 통과하는 로드의 끝단에 장착되어 있습니다. 이 센서는 로드에 부착된 작은 금속 실린더 또는 코어의 위치를 전자적으로 검출합니다.로드의 상단은 조절 가능한 평형추가 달린 레버와 연결되어 있습니다. 이 레버는 세포벽 시료에 조절 가능한 양의 상향력을 가합니다. 세포벽 팽창 측정을 위한 시료를 준비하기 위해, 레버의 맨 끝단에 교정된 금속 추를 추가하거나 제거하여 힘을 조절합니다.하배축 샘플의 기저부를 미세 핀셋으로 집어 약 2~3mm 정도를 잡은 후, 정단부 끝을 가동형 클램프의 벌려진 조(jaw) 사이에 배치합니다. 이 클램프는 스프링이 장착된 앨리게이터 클램프입니다. 금속 표면과 완충 용액 또는 벽 샘플 간의 직접적인 접촉을 방지하기 위해 금속 조는 플라스틱으로 코팅되어 있습니다.저희의 경험에 따르면, 금속 이온이 클램프에서 용출되어 벽면의 확장 능력을 저해할 수 있으므로 금속 부분을 덮어둡니다. 가동 클램프 어셈블리를 한 손으로 잡은 상태에서, 벽면 시료의 기저부를 플렉시글라스 vete의 두 힌지 조각 사이에 배치한 다음 vete 조각들을 모아 나사로 단단히 조여 벽면 시료의 하단부를 vete에 고정합니다. 이제 가동 클램프 어셈블리를 조심스럽게 놓아 카운터웨이트의 전체 힘이 벽면 시료에 전달되도록 합니다. 오이와 hypo coddles로 준비한 벽면 시료의 경우, 통상적으로 총 20 grams의 카운터웨이트를 사용합니다.다른 벽면 재료나 실험의 경우 다른 가중치가 필요할 수 있습니다. QVE를 완충액으로 채우고, 조절 나사를 사용하여 QVE의 위치를 위아래로 이동시켜 가동 클램프가 LVDT 측정 범위의 하단에 오도록 합니다. 사용된 LVDT는 컴퓨터의 데이터 수집 장치에 연결되어 있습니다.우리는 한 대의 컴퓨터에 8개의 LVDT 어셈블리를 병렬로 연결하여 8개의 벽 샘플을 동시에 실행할 수 있습니다. 컴퓨터는 산으로 유도된 신장(extension)을 측정하기 위해 30초마다 각 LVDT 어셈블리의 위치를 기록합니다. 열로 비활성화하지 않은 천연 벽 샘플로 시작하며, 베트(vet)에 중성 버퍼를 추가합니다.벽면 시료는 가해진 인장력에 반응하여 수 분 동안 늘어나지만, 신장 속도는 점차 낮아집니다. 수 분 후, 컴퓨터를 통해 실험 시작 후 이동식 클램프의 위치 변화인 시료의 길이 변화를 모니터링하거나, 위치의 시간 도함수를 모니터링할 수 있습니다. 즉, 신장 속도를 측정하는 것입니다.신장 속도는 시간이 지남에 따라 낮은 값으로 안정화됩니다. 약 20분 후, 진공 펌프에 연결된 굵은 게이지의 하이포더믹 니들(hypodermic needle)로 만든 얇은 금속 파이프를 사용하여 중성 완충액을 제거합니다. 이는 완충액을 빠르게 제거하기 위함입니다.이 설정을 통해 벽면이나 기계적 장치에 가해지는 방해를 최소화하면서 완충액을 제거할 수 있습니다. 그 다음 산성 완충액을 첨가하며, 산성 완충액으로의 완전한 교체를 보장하기 위해 때로는 한두 번의 빠른 교체 과정을 거칩니다. 이후 벽면의 반응을 관찰합니다.일반적으로, 몇 분 내에 더 빠른 신장 속도를 검출할 수 있습니다. 일반적으로 60분 후면 신장 반응을 평가하기에 충분한 정보를 얻을 수 있지만, 일부 경우에는 측정 기간이 더 길어질 수 있습니다. 팽압으로 인한 세포벽 신장을 측정하기 위해, 열 불활성화된 세포벽 시료로 시작하여 qve에 산성 완충액을 추가합니다.첫 번째 실험과 마찬가지로, 기능적인 팽창제(expansin)가 부족하여 세포벽 신장 속도는 점차 낮은 값으로 안정화됩니다. 약 20분간의 팽창 후, Q vet에 있는 버퍼에 10~20 µL의 팽창제 용액을 첨가하여 단백질을 주입합니다. 큐티클이 제거된 상태이므로, 팽창제가 세포벽 시료에 빠르게 침투하며, 몇 분 이내에 신장 속도가 증가하는 것을 확인할 수 있습니다.이 신장 반응은 한 시간 이상 관찰할 수 있습니다. 지금까지 내생적 팽창소(expansin)와 외부에서 첨가된 팽창소에 의한 세포벽 신장을 측정하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 기계적 진동과 온도 변화를 최소화하는 것이 중요한데, 이는 신장 곡선에 노이즈를 발생시키기 때문입니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 신장 분석 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

원자력 현미경(AFM)을 사용하여 식물 조직의 기계적 특성을 매핑하는 방법을 설명합니다. 우리는 식물 발달 중 세포벽에서 발생하는 기계적 변화를 광시야 중간 규모로 기록하여 이러한 변화가 성장 및 형태 형성과 상관 관계가 있을 수 있도록 하는 방법에 중점을 둡니다.

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

칼슘 신호는 식물에서 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 여기에 우리가 공간과 시간 칼슘에 의한 비 생물 적 스트레스를 모니터링하기위한 방법을 제시 애기 세포와 유전자 인코딩 칼슘 지표 애큐 오린 또는 Case12를 사용하여 조직에 2 + 신호.

측정 공간적 칼슘 2 + 신호

살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

결정질 셀룰로오스는 식물 세포벽의 중요한 구성 성분입니다. 그러나 세포 분해능에서 정량화하는 것은 기술적으로 어렵습니다.  여기에서는 시공간 해상도에서 세포벽 구성에 대한 정보를 얻기 위해 편광 기술과 뿌리 단면을 사용하는 방법을 보고합니다.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

본에 설명된 프로토콜은 2-클로로에틸포스폰산(CEPA)을 활용하여 박테리아 에틸렌 반응의 편리한 조사를 용이하게 합니다.  에틸렌은 수성 박테리아 성장 매체에서 CEPA의 분해를 통해 현장에서 생산되며, 순수한 에틸렌 가스에 대한 요구 사항을 우회합니다.

도구로 에틸렌 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 산을 활용하여 박테리아의 에틸렌 응답을 공부하기

여기에서, 우리는 세포와 조직에 나노 및 마이크로 들여 쓰기 공구로 작동하는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 제시합니다. 이 계측기는 시료의 3D 표면 지형과 세포벽 Young의 계수및 터거 압력을 포함한 기계적 특성을 동시에 수집할 수 있습니다.

식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

여기서 우리는 촬영 에 피질 미세 투하 세포 골격의 살아있는 세포 이미징을위한 프로토콜을 설명하고 물리적 인 힘의 변화에 대한 반응을 모니터링.

미생물의 미세 관 세포 골격및 아라비도시스 촬영 Apical 메리스템의 미세 기계적 조작의 라이브 세포 이미징

원자력 현미경 압입 프로토콜은 정상 또는 제한된 성장 (즉, 물 부족 상태) 동안 조직 또는 기관의 특정 세포의 세포벽의 물리적 특성의 역할을 해부 할 수있는 가능성을 제공합니다.

살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포의 물리적 특성을 연구하기 위한 원자력 현미경

세포벽 생체 역학에 대한 연구는 식물 성장과 형태 형성을 이해하는 데 필수적입니다. 다음 프로토콜은 원자력 현미경을 사용하여 젊은 식물 기관의 내부 조직에서 얇은 1 차 세포벽을 조사하기 위해 제안됩니다.

원자력 현미경을 사용한 살아있는 식물 장기의 일차 세포벽의 기계적 특성 특성 분석

이 원고는 살아있는 이끼 조직의 3D 세포벽 역학을 이미지화하는 상세한 프로토콜을 제시하여 장기간에 걸쳐 발달하는 동안 ggb 돌연변이에서 세포벽의 분리와 야생형의 세포벽 패턴을 두껍게 시각화할 수 있습니다.

이끼 피스코미트리움 파텐스에서 칼코플루오르를 사용한 세포벽 역학의 3D 타임랩스 이미징

이 보고서는 단세포 연쇄상구균 조류인 Penium margaritaceum을 배양하고 실험적으로 조작하는 데 사용되는 기본 방법을 설명합니다. 또한 단클론 항체 및 기타 형광 프로브를 사용한 라이브 셀 라벨링 및 주사 전자 현미경을 포함한 현미경 기반 이미징의 기본 프로토콜을 제공합니다.

페니움 마가리타세움(Penium margaritaceum)에 대한 실험적 스크리닝 프로토콜, 면역세포화학 및 현미경 기반 이미징 기법

학습하세요 식물 세포벽 확장 측정법으로 산성 pH와 알파 익스팬신이 세포벽 신축성에 미치는 영향을 연구하는 방법입니다. 오이 hypocotyl을 이용한 일정 힘 신장계 측정 기술을 익혀보세요.

측정 식물 세포 벽 확장 (크리프)는 산성 산도에 의해 및 알파 Expansin에 의해 유도된

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