Name: 마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: 학습하세요 HC11 마우스 유방 상피 세포에서 유유분화를 유도하고 mammosphere 형성을 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 세포 분화 조절 연구에 활용됩니다.

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Congressionally 감독 의학 연구 기금 부여 (DAMD17 - 01-0264)에서 ML 커틀러와 ML 커틀러하는 방법 United States 군사 암 연구소에 기금이 작업을 지원합니다.

<ol><li> HC11 세포 10% 소태아 혈청, 5μg/ml 인슐린, 10 MM HEPES, 능력을 확립하기 위해 10ng/ml 표피 성장 인자 (EGF)와 보충 RPMI 1640 배지에서 6 일간 합류로 성장했다. </li><li> 세포는 PBS로 씻어 24 시간 동안 EGF없이 성장 미디어에 유지했다. </li><li> lactogenic 차별을 유발하는 세포 차별화 미디어, dexamethasone과 함께 즉 RPMI (10 -6 M), 인슐린 (5 μg / ML)과 같은 DIP라고 prolactin (5 μg / ML)에 incubated했다. </li><li> 명시된 시간 이후 DIP 추가에서 mammospheres이 찍은 디지털 카메라 올림푸스 현미경 IX71를 사용하여 위상 콘트라스트 현미경에 의해 열거. </li></ol> 대표 결과 : 정상 내유 상피 세포 monolayers 여러 mammospheres의 낮은 전력 확대뿐만 아니라 단일 mammosphere의 높은 전력 배율은 각각 그림 1에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1265/1265fig1.jpg" alt="" /> 그림 1. Mammospheres가. () 일반 내유 상피 세포 monolayers가 합류 세포의 평면 레이어로 표시되어야합니다. (B) DIP 자극 3-5일 후 여러 mammospheres이 나타납니다. 사진은 5 일 DIP 또한 게시 촬영. DIP 또한 게시물 오일에 mammospheres를 포함하는 단일 필드 (C) 고등 확대.

<ol><li>Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectorial+secretion+by+constitutive+and+regulated+secretory+pathways+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epithelial+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells.</a> Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+induced+expression+of+connective+tissue+growth+factor+contributes+to+lactogenic+differentiation+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells.</a> J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).</li>
</ol>

위해서는이 기술에 대한 성공과 최고의 품질의 상피 세포가 lactogenic 호르몬으로 유도되고 이전에 합류 유지되어야합니다. 부량 어려운 만드는 수많은 mammospheres가있다 상황이있을 수 있습니다. 따라서, 정량 목적은 mammospheres의 숫자가 계산되는 수있는 때 시점에서 mammospheres을 사진에 좋습니다. 내유 상피 세포의 분화 lactogenic에 노출된 정도를 확인하는 데 사용되는 다양한 분자 마커가 있지만, 2D 문화 속에서 자란 세포를 사용 몇 형태학의 표식이있다. 우유 단백질이 누적될 수 모형 돔 구조를 형성 상피 세포 monolayers의 능력이 발달 과정에서 발생하는 형태학의 변경 사항 모니터링 할 수있는 모드를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>21870076</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>118089060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>인슐린(Insulin)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손(Dexamethasone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>QImaging</td><td>Retiga 2000RV Fast 1394</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 내유 상피 세포는 lactogenic 차별 동안 mammospheres를 형성

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

일반적으로 내유 마우스 상피 세포 배양에 lactogenic 분화의 정도를 결정하는 데 사용 phenotypic 측정 mammospheres이라고 돔 모양의 세포 구조의 형성이다<sup&gt; 1</sup&gt;. HC11 세포 라인은 내유 lactogenic 분화 모두의 규제 연구를위한 모델 시스템으로 채용되었습니다<em&gt; 체외에서</em&gt;과<em&gt; 생체내에</em<sup&gt; 2</sup&gt;. HC11 세포 lactogenic 호르몬 치료에 대한 응답으로 우유 단백질을 차별하고 종합. 합류하는 HC11 마우스 상피 세포 내유의 성장에 따라, lactogenic 차별화는 dexamethasone, 인슐린 및 prolactin 포함한 lactogenic 호르몬 조합의 추가에 의해 유도된으로 DIP 언급했다. 차별화 유도 HC11 세포 1백20시간 게시물 분화의 유도 및 열거되었다 각 문화에 나타난 mammospheres의 수에 번에서 촬영했다. 개인 mammospheres의 크기는 분화의 정도와 연결합니다 그리고 이것은 차별 세포의 이미지에 그려져 있습니다.

HC11 lactogenic 차별화는 mammospheres이라고 돔 구조의 형성에 의해 특징 수 있습니다. 구조 lactogenic 차별 quantifying에 투입 위상 콘트라스트 현미경에 의해 열거 수 있습니다.

마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성

마우스 유선 상피 세포 배양에서 유즙 생성 분화 정도를 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 표현형 측정 지표는 ...의 형성입니다.

안녕하세요, 저는 Uniform Services University of the Health Sciences 병리학과의 Mary Lou Cutler 박사님 연구실 소속 Bethany Morrison입니다. 오늘은 HC 11 마우스 유선 상피 세포로부터 mammosphere를 배양하는 과정을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 유선 분화를 연구하기 위해 이 방법을 사용합니다.그럼 프로토콜을 시작하겠습니다. HC 11 세포를 RPMI 1640 배지에서 6일 동안 배양하여 confluence 상태로 만듭니다. 이때 배지에는 10% fetal calf serum, 5 µg/mL insulin, 10 µM Heiss 및 10 ng/mL epidermal growth factor (EGF)를 첨가하여 competence를 확립합니다.이 세포들은 Nancy Hines와 Bernard Groner 연구실에서 조직 배양 후드 내 유전자 분화 조절을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어 왔습니다. 그 후 세포를 PBS로 세척하고 EGF가 포함되지 않은 성장 배지에서 24시간 동안 유지합니다. 이 배양 단계 이후, 배양 후 유선 분화를 유도하기 위해 dexamethasone, insulin 및 prolactin이 첨가된 RPMI로 구성된 분화 배지에서 세포를 배양합니다.분화 배지 내에서 디지털 카메라가 장착된 Olympus IX 71 현미경을 사용하여 mamo sphere를 촬영하고 개수를 측정합니다. 위상차 현미경을 통해 유도 후 120시간까지 mamo sphere를 여러 차례 촬영하고 개수를 측정합니다. 이 이미지는 정상 기억의 저배율 확대 사진을 보여줍니다.상피세포 단층 세포는 유전 호르몬으로 자극하기 전 약 3일 동안 confluence 상태로 유지해야 합니다. 여기 유도 후 3일째에 형성된 새로운 mammosphere를 저배율로 관찰한 모습입니다. 이들은 상피세포 전반에 걸쳐 무작위로 배치된 작은 돔 형태의 구조물로 나타나기 시작합니다.다시 저배율로 관찰합니다. 여기 유도 후 5일이 지나 발달한 여러 개의 맘모스피어(mammo spheres)의 모습이 있습니다. 고배율에서 보면 맘모스피어의 크기와 수가 계속 증가한 것을 알 수 있으며, 맘모스피어 특유의 거품 또는 돔 형태의 특징이 명확하게 보입니다.지금까지 기억 유선 상피 세포를 유도하여 분화의 표지자로 사용되는 mammosphere를 형성하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 유도 전까지 세포의 confluence 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 이 기간 동안 세포는 matrix 단백질을 생성하며, 분화 호르몬에 완전히 반응하기 위해서는 이 단백질들과 상호작용해야 하기 때문입니다. 또한, EGF가 분화 과정을 억제하므로 처리 전 배지에서 EGF를 제거하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 방법은 생쥐에서 유선 개발 및 기능을 해부하다하고 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 우유 방출은 옥시토신 기반 myoepithelial 세포 수축 분석을 사용하여 평가하는 동안 Excised 내유 분비가 전체 마운트를 사용하여 개발의 정도에 대한 평가입니다.

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

간단한 방법은 관련 상피 세포에서 조직 섬유아 세포의 효과를 분석하는 설명되어 있습니다. 이 방법과 3 차원 조직 배양의 결합 차원에서 고립 후 세포의 분석을 용이하게하실 수 있습니다. 기술은 종양 세포에서 종양 - 관련 기질의 효과를 체계적으로 연구를 허용, 악성 잠재력을 변화의 세포에 적용됩니다.

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

이 비디오는 유방암 세포주에서 암 줄기세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 이러한 암 줄기세포를 배양하여 자가 재생을 평가하고 구 형성 효율성을 계산하기 위한 1차 유방구를 생성하여 다양한 시딩 밀도를 비교할 수 있습니다.

1차 유방구의 생성: 세포 효능을 결정하는 기술

손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids&gt;는 6 개월 가능한 남아있다.

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

부유 유방구 분석은 현탁 상태에서 생존하고 마우스에 이식했을 때 향상된 종양 형성을 보여주는 줄기 유사 유방암 세포의 하위 집합을 조사할 수 있습니다.  이 프로토콜은 생체 내 종양 형성의 대용물인 구 형성 능력의 편리한 체외 측정을 제공하는 동시에 줄기 관련 전사 환경의 분석을 용이하게 합니다.

인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

이 문서에서 설명하는 간접 면역 형광 프로토콜 탐지 및 마우스 유방 동맥에서 단백질의 현지화 할 수 있습니다. 완전한 방법은 유선 샘플을 제조 형광 현미경에 의해 이미지, 조직 절편을 면역 조직 화학 법을 수행하고, 이미지를 재구성하기 위해 주어진다.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

이 프로토콜은 non-adherent / mesenchymal 유방 상피 세포에서 세포 외 소포 (EVs) / 엑소 좀을 정화, 정량화 및 특성화하고 유선 형성능을 내유성 상피 세포로 전달하는 방법을 설명합니다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은이 세포 특성을 EVs / 엑소 좀을 섭취하는 세포로 전달할 수있다.

extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

우리는 2개의 유방 상피 선, HC11 및 EpH4의 분화 유도를 위한 기술을 기술합니다. 둘 다 우유 단백질을 생성하기 위하여 태아 송아지 송아지 혈청, 인슐린 및 prolactin를 요구하는 동안, EpH4 세포는 3 차원 문화에서 유방구로 완전히 분화할 수 있습니다. 이러한 상보적인 모델은 분화 및 신생물의 신호 환전 연구에 유용하다.

마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화

여기서, 우리는 시험관 내 유방동체재생정량분석법의 결과의 이행 및 해석을 설명한다.

뮤린 맘모스피어 문화에서 자체 갱신의 정량화

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

이 프로토콜은 비종양성 유방 상피세포에서 세포자손멸증 억제제 5(Api5) 유도 암 줄기를 연구하기 위한 유방구형 형성 분석 설정 방법을 설명합니다. 1차 세대 유방구에서 채취한 용해액은 줄기세포 유사 특성의 유도를 평가하기 위해 다양한 줄기 특성 지표를 분석합니다.

유방 구상 분석법은 비종양성 유방 상피 세포주에서 API5 유도 줄기 특성을 밝혀내다

학습하세요 HC11 마우스 유방 상피 세포에서 유유분화를 유도하고 mammosphere 형성을 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 세포 분화 조절 연구에 활용됩니다.

마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성

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