Name: gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 배우세요 gentleMACS Dissociator를 사용하여 성체 마우스 폐 조직에서 단일 세현액을 표준화된 방법으로 준비하는 기법을. 콜라게나제 D와 DNase를 활용한 이 프로토콜은 백혈구 및 내피세포 연구에 활용 가능한 고활성 세포를 제공합니다.

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Miltenyi Biotec 저자 GmbH를, 독일의 직원입니다.

무균 조건 하에서 해결하려면, 그것은 층류 후드의 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 1. 자료 <ol><li> HEPES 버퍼 : 10 MM HEPES - NaOH 산도 7.4, 150 MM NaCl, 5 KCl MM, 1 MM MgCl 2, 1.8 MM CaCl 2) </li><li> Collagenase D 솔루션 : Collagenase D : 100 MG / ML (Collagenase D&gt; 0.15 U / MG) HEPES에서 버퍼 </li><li> DNase I 솔루션 : 20,000 U / ML DNase I </li><li> 산도 7.2에서 PBS 버퍼 </li><li> PEB 버퍼 : 20 부품 1 부품 BSA 주식 솔루션 Rinsing 솔루션 autoMACS </li><li> 조직 : 인접한 장기 무료 7분의 6 week 오래된 성인 여성 BALB / C 마우스에서 파생된 폐. </li><li> 옵션 : CD11c MicroBeads, 맥 MS 열, 마우스 폐 단일 셀 정지 돌기 세포의 격리 Mac 용 세퍼레이터 </li></ol> 2. 폐 조직을 Dissociating <ol><li> 적혈구를 제거하는 PBS가 포함된 배양 접시에있는 조직을 씻어. </li><li> 4.9 ML의 HEPES 버퍼를 포함하는 gentleMACS C 튜브 450 MG의 폐 조직의 최대 전송합니다. </li><li> 2 MG / ML Collagenase D.의 최종 농도 100 μL Collagenase D 솔루션 추가 </li><li> 150 MG 조직 (40 U / ML DNase I의 최종 농도) 또는 150-450 MG의 폐 조직을 20 μL DNase I (80 U / ML DNase I의 최종 농도)에 10 μL DNase I 솔루션을 추가합니다. </li><li> 단단히 C 튜브를 닫고 gentleMACS의 Dissociator에 그것을 연결합니다. 그런 다음 프로그램 "m_lung_01"를 실행합니다. </li><li> 37 30 분 품어 ° C 자동 또는 수동으로 회전마다 5 분 터닝과 함께. </li><li> gentleMACS의 Dissociator에 샘플을 반환하고 프로그램 "m_lung_02"를 실행합니다. </li></ol> 3. 여과법 <ol><li> 70 μm의 메쉬 셀 스트레이너와 뚜껑을 교체하여 필터링 세포를 수집하기 위해 50 ML 튜브를 준비합니다. </li><li> 일단 두 번째 gentleMACS 프로그램이 튜브의 샘플 자료의 배포에 따라 종료, 당신은 튜브 하단의 샘플 자료를 수집하기 위해 간단히 튜브를 원심 수 있습니다. </li><li> 적당한 1,000 μl 피펫 팁을 사용하여 C 튜브의 심장 봉인 캡을 통해 세포를 제거하고 세포 스트레이너에게 적용됩니다. </li><li> RT에서 5 ML HEPES 버퍼와 셀 스트레이너 씻으십시오. </li><li> 10 분 300xg에서 50 ML 튜브의 펠렛에 세포를 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 기음과 PEB 버퍼의 원하는 볼륨의 세포 펠렛을 resuspend. </li></ol> 4 부 : 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1. gentleMACS ™ Dissociator과 폐 분리가 92% 가능한 세포의 결과. 죽은 세포는 찬란 propidium 요오드화물의 (PI) (; 없음 PI의 얼룩 왼쪽 도트 플롯 바로 도트 플롯)와 스테인드되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig2.jpg" alt="그림 2"> 그림 2. 가능한 leukocytes 및 내피 세포의 높은 비율의 gentleMACS의 Dissociator 결과를 사용하여 마우스 폐 조직의 해리. 파생된 단일 셀 suspensions는 CD45 - PE와 CD146 - FITC 또는 CD31 - FITC 물들일 및 유동세포계측법에 의해 분석되었다. <img src="/files/ftp_upload/1266/1266figure2c.png" alt="그림 2C"> 그림 3. 마우스 폐 조직에서 파생된 단일 셀 정지 CD11c - FITC와 안티 mPDCA - 1 - APC 마우스 CD11c 낮은 M - PDCA - 1 + plasmacytoid의 DC가뿐만 아니라 CD11c 높은 세포를 감지하는 물들일했다. <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig4.jpg" alt="그림 4"> 그림 4. CD11c MicroBeads, MiniMACS 구분 기호와 두 MS 열을 사용하여 돌기 세포의 농축.

<ol><li>Swanson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3-Ligand%2C+IL-4%2C+GM-CSF%2C+and+Adherence-Mediated+Isolation+of+Murine+Lung+Dendritic+Cells%3A+Assessment+of+Isolation+Technique+on+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function.</a> J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).</li>
<li>Vermaelen, K., Pauwels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+simple+discrimination+of+mouse+pulmonary+dendritic+cell+and+macrophage+populations+by+flow+cytometry%3A+Methodology+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights.</a> Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).</li>
</ol>

저자들은 본 논문에 사용된 장비를 제조하는 Miltenyi Biotec GmbH의 직원입니다.

이 비디오에서는, 우리는 마우스 폐 조직의 분리를위한 새로운 방법을 소개합니다. 저희는 폐 조직의 기계적 효소 치료의 조합이 가능한 leukocytes 및 내피 세포의 높은 비율을 알아낼 것을 보여줍니다. 특히, 조직의 기계적 붕괴는 gentleMACS의 Dissociator에 의해 달성되었다. 고정자 시스템, 부드러운 방식으로 dissociates 조직 - gentleMACS C 튜브는 로터가 포함되어 있습니다. 절차는 악기의 프로그램 설정에 의해 제어됩니다. 설정은 세포의 높은 수율과 생존을 달성하기 위해 최적화되었다. 파생된 단일 셀 suspensions는 CD45 - PE와 CD146 - FITC 또는 CD31 - FITC 물들일 및 leukocytes과 내피 세포를 감지하는 유동세포계측법에 의해 분석되었다. 단일 세포 현탁액에서 돌기 세포는 CD11c - FITC와 안티 mPDCA - 1 - APC 물들일되었습니다. 또한, 마우스 폐 단일 셀 정지 돌기 세포는 맥 기술을 사용하여 풍부하게되었습니다. 돌기 세포는 자기 ...

<table><tbody><tr><td>C 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; 스타터 키트</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; 튜브 회전기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS&amp;#8482; 세척 용액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS&amp;#174; BSA 스톡 용액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-052-001</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c-FITC, CD11c-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-092-026130-091-830</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-mPDCA-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-091-963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD146-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-092-026</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-091-610</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물 용액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Art 1000 Reach 피펫 팁</td><td>Molecular BioProducts</td><td>주문 번호 2079</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;무균 조건에서 작업하기 위해 모든 단계는 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 수행하는 것을 권장합니다.

1. 재료
HEPES 완충액: 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2
Collagenase D 용액: HEPES 완충액에 희석한 Collagenase D 100 mg/mL (Collagenase D > 0.15 U/mg)
DNase I 용액: 20,000 U/mL DNase I
pH 7.2의 PBS 완충액
PEB 완충액: autoMACS Rinsing Solution 20부분에 BSA Stock Solution 1부분 혼합액
조직: 인접 장기가 제거된 6/7주령 성체 암컷 BALB/C 마우스 유래 폐
선택 사항: 마우스 폐 단일 세포 현탁액으로부터 수지상 세포를 분리하기 위한 CD11c MicroBeads, MACS MS Columns, MACS Separator

2. 폐 조직 해리
적혈구를 제거하기 위해 PBS가 담긴 페트리 접시에서 조직을 세척합니다. 최대 450 mg의 폐 조직을 4.9 mL의 HEPES 완충액이 담긴 gentleMACS C Tube로 옮깁니다. Collagenase D의 최종 농도가 2 mg/mL가 되도록 Collagenase D 용액 100 μL를 추가합니다. 조직이 150 mg 이하인 경우 DNase I 용액 10 μL(DNase I 최종 농도 40 U/mL)를 추가하고, 폐 조직이 150-450 mg인 경우 20 μL의 DNase I 용액(DNase I 최종 농도 80 U/mL)을 추가합니다. C Tube를 단단히 닫고 gentleMACS Dissociator에 장착합니다. 그 후 "m_lung_01" 프로그램을 실행합니다. 자동 회전 장치를 이용하거나 5분마다 수동으로 회전시키며 37°C에서 30분간 배양합니다. 샘플을 다시 gentleMACS Dissociator에 넣고 "m_lung_02" 프로그램을 실행합니다.

3. 여과
캡을 70 μm 메쉬 셀 스트레이너(cell strainer)로 교체하여 여과된 세포를 수집할 50 mL 튜브를 준비합니다. 두 번째 gentleMACS 프로그램이 종료되면, 튜브 내 샘플 물질의 분포 상태에 따라 튜브를 짧게 원심 분리하여 샘플 물질을 튜브 바닥으로 모을 수 있습니다. 적절한 1000 μl 피펫 팁을 사용하여 C Tube의 격막 밀봉 캡(septum sealed cap)을 통해 세포를 제거하고 이를 셀 스트레이너에 도포합니다. 실온(RT)에서 5 mL의 HEPES 완충액으로 셀 스트레이너를 세척합니다. 50 mL 튜브에서 300xg로 10분간 원심 분리하여 세포를 펠렛(pellet) 형태로 모읍니다. 상층액을 흡입 제거하고 원하는 부피의 PEB 완충액으로 세포 펠렛을 재현탁합니다.

파트 4: 대표 결과
그림 1. gentleMACS™ Dissociator를 이용한 폐 해리 결과, 세포 생존율이 92%로 나타났습니다. 사멸 세포는 propidium iodide (PI)로 형광 염색되었습니다(오른쪽 도트 플롯; 왼쪽 도트 플롯: PI 미염색).
그림 2. gentleMACS Dissociator를 이용한 마우스 폐 조직 해리를 통해 높은 비율의 생존 백혈구 및 내피 세포를 얻었습니다. 유도된 단일 세포 현탁액을 CD45-PE 및 CD146-FITC 또는 CD31-FITC로 염색하여 유세포 분석기로 분석하였습니다.
그림 3. 마우스 폐 조직 유래 단일 세포 현탁액을 CD11c-FITC 및 Anti-mPDCA-1-APC로 염색하여 마우스 CD11clow m-PDCA-1+ 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid DCs)와 CD11chigh 세포를 검출하였습니다.
그림 4. CD11c MicroBeads, MiniMACS Separator 및 두 개의 MS Column을 이용한 수지상 세포 농축 결과입니다.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

gentlemacs dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 suspensions의 표준화 준비

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

조직에서 단일 셀 suspensions의 준비 세포 연구에 많은 실험을위한 중요한 사전 요구 사항에 해당됩니다. 전체 장기 dissociating의 과정은 재현성 방식으로 가능한 세포의 높은 숫자를 얻기 위해서는 특정 매개 변수를 필요로합니다. gentleMACS Dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 악기는 마우스를 포함하여 폐 조직 유형의 다양한 효율적이지만 부드러운 분리에 최적화된 미리 프로그램된 설정이 포함되어 있습니다. 이 간행물의 생쥐에서 파생된 폐 조직에 gentleMACS의 Dissociator의 사용을 시연합니다.

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직의 동요에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 폐 조직에서이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

조직으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하는 것은 세포 연구의 많은 실험에서 중요한 전제 조건입니다. ... 과정은

본 비디오 프로토콜에서는 폐 조직 해리 후 GentleMACS를 사용하여 성체 마우스 폐 조직을 분리하는 방법을 보여드립니다. Collagenase D 및 DNase I 존재 하에 단일 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너로 여과하고 원심 분리하여 향후 응용 단계에서 사용할 수 있도록 현탁합니다. 안녕하세요, 독일 Miltenyi Biotec의 Melanie Mlu입니다.오늘은 GenX dissociation을 사용하여 마우스 폐 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하는 재현 가능하고 자동화된 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 백혈구 또는 내피 세포 준비를 위한 단일 세포 현탁액을 제조할 때 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.프로토콜을 시작하기 전에 몇 가지 표준 용액을 준비하여 대기시켜야 합니다. 우선, Hebes 완충액이 필요합니다. 다음으로, 100 mg/mL의 효소와 Hebes 완충액을 포함하는 collagenase D 용액을 준비합니다.셋째, mL당 20,000 unit의 dase one을 포함하는 dase one 용액입니다. 마지막으로, 두 가지 일반적인 완충 용액이 있습니다. pH 7.2의 전형적인 PBS 완충액과 AutoMax 세척액 및 BSA 스톡 용액으로 제조한 PEB 완충액입니다.6~7주령의 암컷 생검 마우스에서 적출한 폐를 사용하여 프로토콜을 시작합니다. 폐에 심장, 흉선과 같은 인접 장기, 수출혈관 및 수입혈관, 기관 및 결합 조직이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 적혈구를 제거하기 위해 PBS가 담긴 페트리 접시에서 조직을 헹굽니다.일반적으로 이 연령대 마우스의 폐 무게는 110에서 150 mg 사이입니다. 더 고령의 동물이나 다른 마우스 계통의 폐를 분리할 계획이라면, 조직과 완충액의 무게를 측정하십시오. 튜브 하나당 최대 450 mg의 조직을 분리할 수 있습니다.폐 조직을 4.9 mL의 heis buffer가 채워진 gentle max C tube로 옮깁니다. 폐 조직과 buffer에 collagenase D 용액 100 µL를 첨가하여 최종 농도가 2 mg/mL가 되도록 합니다. 이제 dase 10 µL를 추가합니다.150 mg 이상의 조직에 사용할 용액입니다. dase one 용액 20 µL를 추가하십시오. C 튜브가 단단히 닫혔는지 확인한 후, gentle max dis 위에 거꾸로 놓으십시오.조직이 로터와 스테이터 사이에 위치해 있는지 확인하십시오. 폐(

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gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직 aggitation에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS Dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 nerual 조직이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

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